基于激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析

基于激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析关键字：基于,于激,激光,剥蚀,电感,电感耦合,耦合,等离子,等离子体,离子,体质,质谱,技术,技术的,生物,元素,成像,分析基于激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析本文为Word文档，感谢你的关注！　　摘要生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，也与许多疾病密切相关。现代生物医学的研究亟需能在组织、细胞等不同水平上原位分析生物样品中微量元素的分析方法。本研究建立了激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LAICPMS）原位分析生物样品的方法。采用线扫描模式和较小的激光输出能量（<1J/cm2），得到了鼠脑切片和金纳米颗粒暴露后单细胞的金属元素成像图。LAICPMS具有空间分辨率高、检出限好、运行成本较低等优势，有望在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。　　关键词电感耦合等离子体质谱；激光剥蚀；元素成像；单细胞分析；鼠脑切片；金纳米颗粒　　1引言 　　生物体内的微量元素具有十分重要的生物功能，参与多种生物化学过程[1＼]，如金属离子常作为蛋白质的活性中心，催化和调节生物体内的化学反应[2＼]。微量元素还与一些疾病的发生发展密切相关[3＼]。研究发现，阿尔茨海默病（Alzheimer′sdisease，AD）患者大脑的沉积斑中有高浓度的铜、锌、铁离子[4＼]；金属离子在脑组织微区内的代谢紊乱、氧化应激与AD的形成和损伤关系密切[5＼]。因此，生物样品中微量元素的分析和检测，特别是元素的原位微区分析，无论对于研究微量元素在生物体内的结构、功能和生物效应，还是对于阐明与微量元素相关疾病的发病机理，寻找这些疾病的预防和治疗策略，都具有重要的意义。　　生物体内微量元素的分析主要使用原子吸收、原子发射、原子荧光、无机质谱等原子光谱/质谱仪器完成。常规方法大都需要使用强酸消化样品，前处理过程冗长而繁琐，一般只能得到元素总量的信息，而无法得到元素在生物样品中的分布信息。如果采用具有空间分辨能力的原位分析方法，如二次离子质谱[6＼]、激光电离飞行时间质谱[7＼]、同步辐射X射线荧光[8＼]、激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（Laserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry，LAICPMS）[9＼]等方法，可以实现生物样品中元素的原位、微区分析，得到元素成像图。　　在上述原位元素分析方法中，LAICPMS由于具有空间分辨率好（约5μm）、分析检出限低（10　　4g/L级）、仪器商品化程度高、运行成本较低等优点，逐渐成为应用最广泛的元素成像方法[10，11＼]。杨红霞等[12＼]利用LAICPMS原位分析了印度芥菜中的7种元素，得到了植物茎中的元素分布图；冯流星等[13＼]将同位素稀释法应用于LAICPMS的定量分析，建立了生物切片中Fe元素的原位定量分析方法。本实验详细描述LAICPMS元素成像的步骤和方法，并将建立的方法应用于鼠脑切片和单个细胞的元素成像分析。　　2实验部分　　2.1仪器与试剂　　NWR213Nd：YAG激光剥蚀系统（美国NewWave公司）；四极杆电感耦合等离子体质谱仪（NexION300DICPMS，美国PerkinElmer公司）；冷冻切片机（德国LEICA1900）；NuncLabTekII腔室载玻片（美国赛默飞世尔科技有限公司） 　　本实验所用小鼠（C57BL/6J）购自中国医学科学院实验动物研究所；高纯Ar气和He气购自北京普莱克斯公司；LAICPMS调谐用标准物质（SRM612），30nm金纳米颗粒（RM8012）购自美国国家标准与技术研究院（NIST）；细胞培养基、小牛血清、PBS、胰酶、青霉素、链霉素均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。　　2.2样品前处理　　3月龄正常小鼠麻醉后，用生理盐水快速灌注15min，再断头取脑组织。将脑组织快速冷冻，制成30μm厚的冠状切片，置于干燥器中备用。　　小鼠巨噬�胞（RAW264.7）用含有10%小牛血清（FBS）、100μg/mL链霉素、100units/mL青霉素的DMEM/F12培养基在培养箱中（37℃，5%CO2）培养。NIST金纳米颗粒超声处理后，用纯水稀释至合适的浓度，加入细胞培养液。细胞暴露于0.1mmol/L金纳米颗粒4h后，JP吸出细胞培养液，用PBS反复清洗后，将细胞转移至腔室载玻片，待细胞贴壁后，除去腔室间的隔断，将载玻片置于干燥器中备用。　　2.3LAICPMS实验　　激光剥蚀产生的气溶胶由He气载带出样品ZH（池，通过三通与Ar气混合后进入ICPMS分析。ICPMS用NIST612调谐，使U、Th信号最强且得到较低的氧化物产率（UO+/U+）。LAICPMS所用的仪器参数见表1。　　LA采用线剥蚀模式，激光剥蚀时自动触发ICPMS以时间分辨模式采集质谱数据。所得数据用MicrosoftExcel处理，用IgorPro.（美国WaveMetrics公司）软件画出元素成像图。　　3结果与讨论 　　激光烧蚀系统可以作为ICPMS的固体进样装置，工作时激光束先剥蚀样品表面，产生的固体气溶胶被载气运送至等离子体而完成电离，然后在质谱中得到检测。LAICPMS的准确分析需要尽可能地满足下面3个条件：（1）激光剥蚀产生的气溶胶与固体样品的组成相同；（2）气溶胶可以高效率地传输至质谱；（3）进入质谱的气溶胶可以完全电离[14＼]。在实际分析过程中，上CM（203/5述条件常常很难完全满足，这样会导致“元素分CM）ZH）馏”（不同元素在LAICPMS分析过程中的行为差异）的产生。为了校正激光能量、样品厚度、漂移对质谱响应的影响，LAICPMS元素成像分析时，需要选用适合内标元素。还要使用基体匹配的标准，以获取准确的定量分析结果。研究表明，相比过去常用波长的激光器（如266nm），使用213nm波长的NdKG-3∶KG-5YAG激光剥蚀得到的样品更为均匀，元素分馏效应更小[15＼]。使用氦气作为载气，可以有效地提高气溶胶的传输效率，从而提高分析的灵敏度[16＼]。因此，在本实验中，使用波长为213nm的激光，采用He气作为载气，并采用13C的信号作为内标校正元素。　　3.1剥蚀模式的选择　　元素成像可采用点剥蚀模式（Spotablation）或线剥蚀模式（Lineablation）完成（图1）。在点剥蚀模式中，激光在样品表面每隔一定距离取一点剥蚀样品，重复操作直到激光采样的点阵覆盖整个样品。在此模式下，采集的数据真实反映每个采样点上的元素信息，激光光斑越小，采样点越多，得到的元素成像图的分辨率越高。而在线剥蚀模式中，在样品表面每隔一定距离设置一条剥蚀线段，重复设置剥蚀线段，直到激光采样的线段覆盖整个样品。工作时激光沿直线连续剥蚀样品，此时，元素成像图的分辨率取决于激光光斑、剥蚀频率、线扫描速率，以及剥蚀线间的距离等条件。 　　LAICPMS分析时，如果采用点剥蚀模式，在两个剥蚀点之间需要耗费较多的时间等待质谱信号回到本底水平，才能进行下一点的分析。这样减少了有效质谱分析时间的比例，增加了元素成像分析所需要的时间。所以在本实验中，采用线剥蚀模式，并使用两种剥蚀参数分别应用于鼠脑切片和细胞样品（见表1）。需要注意的是，由于剥蚀参数的选择，最终得到的元素成像图在激光扫描的方向常会拉长变形，一般需要在最后处理过程中恢复原始比例。　　3.2激光能量的选择　　与地质样品不同，生物样品的含水量较高，因此在剥蚀时，必须有效地控制剥蚀条件，既要实现完全剥蚀样品，又要避免用过高的能量剥蚀而使样品中的水大量汽化，造成样品不规则撕裂和严重的元素分馏。此外，在分析生物样品时，选择较低能量密度（<1J/cm2），有利于得到稳定的激光脉冲。有文献报道，使用低温样品池可以有效减少由于样品中水分汽化而造成的负面影响[17＼]。但是由于低温样品池结构复杂，价格昂贵，从而限制了其实际应用。我们发现，通过选择合适的激光能量，也可以实现对生物样品的有效剥蚀，而不必采用低温样品池。图2显示了不同能量的激光剥蚀鼠脑切片的结果，可以清楚地看出，对于本实验中的鼠脑切片样品来说，选用40%的激光输出能量，即可得到较好的剥蚀效果。如果输出能量大于40%，会导致激光穿透样品而剥蚀载玻片，从而引入了来自载玻片的元素干扰，还会造成切片样品的不规则剥蚀。对于实验中的细胞样品，经过对比，选用80%的输出能量可以达到良好的剥蚀效果。　　3.3鼠脑和细胞的元素成像图 　　元素C作为生物样品的内标校正元素，Fe，Cu，Zn是生物体中重要的必需微量元素，具有多种生物功能。所以，本研究选择分析以上元素。LAICPMS分析得到的鼠脑元素成像见图3。从图3可以清楚地分辨小鼠脑的不同区域，并可以看出Fe，Cu，Zn等重要微量元素在各个脑区中的分布情况。由于Fe元素在ICPMS中受到ArO+等多原子离子的严重干扰，所以得到的Fe元素成像图不如其它元素成像图清晰。JP文献＼[18＼]报道，采用碰撞反应池技术可以消除测量时的质谱干扰，得到更加清晰的Fe元素成像图。由于缺乏可用于LAICPMS定量分析的生物标准参考物，定量元素成像分析相对困难。国外实验室常自制基体匹配的生物切片标准物质，采用外标校正的办法，实现生物样品的定量元素成像[10＼]。　　如果LAICPMS技术与免疫组织化学方法相结合，使用元素标记的抗体与切片上的待测抗原反应，通过分析标记的元素，可以得到切片上蛋白质（抗原）的分布信息，进一步拓展LAICPMS在生物成像分析的应用范围。Seuma等[19＼]成功得到了两种癌症生物标志物在组织上的成像。利用类似的方法，Wang等[20＼]同时得到了Fe，Cu，Zn等金属元素和β淀粉样蛋白在老年痴呆模型鼠脑切片中的元素和分子成像图。　　图4是暴露金纳米颗粒后的单细胞光学成像和元素成像图。在本实验条件下，除了Mg元素外，不能得到其它天然微量元素的清晰成像。�@主要是由于细胞中的这些元素含量较低，或者是由于分析这些元素时存在较为严重干扰。从图4可见，Mg和Au元素浓度较高的位置与光学显微镜中细胞所在位置重合，而在没有细胞的位置，Mg和Au元素浓度很低。因此可以确定，Mg和Au的元素信号分别来自于细胞本身和进入细胞的金纳米颗粒。 　　为了准确得到单个细胞中的元素含量，需要发展合适的定量标准和校正方法。Wang等使用微喷系统制备了与细胞大小和含碳量相似的标准液滴，作为基体匹配的单细胞定量标准，成功实现LAICPMS定量分析单细胞中的金属纳米颗粒[21＼]。此外，现有的激光器最小光斑约为5μm，如果希望用LAICPMS技术得到单个细胞中的元素成像图，则需要进一步提高空间分辨率。Becker等提出的近场剥蚀技术，将LAICPMS空间分辨率提高到亚微米级，有望真正实现单个细胞成像分析[22＼]。　　4结论　　本研究建立了LAICPMS元素成像方法，得到了鼠脑切片、单细胞等不同水平生物样品的元素成像图。LAICPMS由于具有空间分辨率高、检出限低、运行成本较低等优势，有望作为其它生物成像技术的有力补充，在生物医学研究中得到更广泛的应用，发挥更重要的作用。　　References　　1（#LiYF，ChenCY，QuY，GaoYX，LiB，ZhaoYL，ChaiZF.PureAppl.Chem.，2008，80（12）：2577-2594　　2FinneyLA，O′HalloranTV.Science，2003，300（5621）：931-936　　3BushAI.TrendsNeurosci.，2003，26（4）：207-214　　4MillerLM，WangQ，TelivalaTP，SmithRJ，LanzirottiA，MiklossyJ.J.Struct.Biol.，2006，155（1）：30-37　　5ZHAOBaoLu，WANLi.Prog.Biochem.Biophy.，2012，39（8）：756-763　　赵宝路，万莉.HTK生物化学与生物物理进展，2012，39（8）：756-763 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　　AbstractTraceelementsplayaveryimportantroleinbiologicalorganismandcloselyrelatedtomanydiseases.Thenewanalyticalmethodsareurgentlyneededforinsitudeterminationoftraceelementsinbiologicaltissuesorsinglecells.Amethodbasedonlaserablationinductivelycoupledplasmamassspectrometry（LAICPMS）wasdevelopedforsuchinsituanalysis.Lineablationmodewaschosenandtheoutputenergyofthelaserwasalsooptimizedatalowfluenceoflessthan1J/cm2.Thetwokindsofelementalbioimagingofbothacoronalsectionfrommousebrainandsinglecellsexposedtogoldnanoparticleswereobtainedbythedevelopedmethod.Becauseoftheuniquecharacteristics，suchasgoodspatialresolution，excellentdetectionlimit，andreasonablerunningcost，LAICPMSwillbeappliedwidelyandbecomeausefultoolinbiomedicalresearchinthefuture.　　KeywordsInductivelycoupledplasmamassspectrometry；Laserablation；Elementalbioimaging；Singlecellanalysis；Mousebrainsections；Goldnanoparticles　　HQWT6JY（Received19February2016；accepted11April2016）　　ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21775136，U1432241，11505194）.文档资料：基于激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱技术的生物元素成像分析完整下载完整阅读全文下载全文阅读免费阅读及下载阅读相关文档:西汉彩绘陶壶鉴析中国博物馆学学科发展的回顾与反思天水市博物馆藏Z0933清白连弧纹铜镜再探平凉市博物馆馆藏瓷器赏析明代报恩寺琉璃宝塔探析简化行政执法程序的探讨端砚篆刻岭南篆刻美学的新方向安徽省人居硬环境质量评价与优化研究医养结合养老模式的需求影响因素研究 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