现代生物技术实验讲义 华东师范大学生命科学学院

莄薄螀肇芀蚄袃袀膆蚃薂肆肂蚂蚅衿蒀芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃现代生物技术实验讲义华东师范大学生命科学学院现代生物技术实验讲义DNA重组技术与基因检测芯片技术动物细胞培养及细胞活性检测技术发酵工程及分离提取技术SCHOOLOFLIFESCIENCES,EASTCHINANORMALUNIVERSITY华东师范大学生命科学学院2007年9月引言随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。1第一部分DNA重组技术与基因检测芯片技术黄静陆泉枝编目录前言………………………………………………………………………………………………31.相关基础知识……………………………………………………………………………….…..41.1DNA重组技术的基本原理………………...…………………………………………………41.2基因芯片技术的基本原理…………………………………………………………………...62. 莄薄螀肇芀蚄袃袀膆蚃薂肆肂蚂蚅衿蒀芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃莁螇膄膃蚇蚃膃芅葿羁膂莈蚅袇膁蒀蒈螃芀膀蚃虿艿节蒆羈芈蒄蚁羄芈薆薄袀芇芆螀螆袃莈薂蚂袂蒁螈羀袁膀薁袆羁芃螆螂羀莅蕿蚈罿薇莂肇羈芇蚇羃羇荿蒀衿羆蒂蚆螅羅膁蒈蚁羅芄蚄罿肄莆蒇袅肃蒈蚂螁肂膈蒅螇肁莀螁蚃肀蒂薃羂肀膂蝿袈聿芄薂螄肈莇螇蚀膇葿薀罿膆腿莃袅膅芁薈袁膄蒃现代生物技术实验讲义华东师范大学生命科学学院现代生物技术实验讲义DNA重组技术与基因检测芯片技术动物细胞培养及细胞活性检测技术发酵工程及分离提取技术SCHOOLOFLIFESCIENCES,EASTCHINANORMALUNIVERSITY华东师范大学生命科学学院2007年9月引言随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力，因为该学科是一门实践性较强的科学。在培养生物技术专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等课程实验。这些实验为培养学生的基础操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，学生完成实验后没有一个完整的概念。本实验以基因工程、细胞工程和发酵工程实验为基础，组成了生物工程中上游、中游和下游技术。其中每一个部分放弃了原来单独小实验的结构，而改为一个独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系。本讲义分为三个部分，第一部分“DNA重组技术与基因检测芯片技术”；第二部分“动物细胞培养及细胞活性检测技术”；第三部分“发酵工程及分离提取技术”。这些实验采取大实验方法，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程的上游、中游和下游技术有了感性认识。1第一部分DNA重组技术与基因检测芯片技术黄静陆泉枝编目录前言………………………………………………………………………………………………31.相关基础知识……………………………………………………………………………….…..41.1DNA重组技术的基本原理………………...…………………………………………………41.2基因芯片技术的基本原理…………………………………………………………………...62. 实验目的和要求…………………………………………………………………………….…72.1DNA重组技术实验目的和要求………………………………………………………….......72.2基因芯片技术实验目的和要求……………………………………………………………...73.实验材料和仪器…………………………………………………………………………….…83.1实验材料………………………………………………………………………………….…83.2主要仪器设备…………………………………………………………………………….…83.3实验器皿……………………………………………………………………………………...83.4细菌培养基…………………………………………………………………………………...83.5分子生物学试剂……………………………………………………………………………...83.6SDS-PAGE电泳试剂…………………………………………………………………………93.7基因芯片试剂……………………………………………………………………………….104.实验质粒DNA的提取………………………………………………………………………14附录二琼脂糖凝胶电泳…………………………………………………………….………….15附录三DNA的纯度、浓度的测定…………………………………………………………….17附录四DNA的酶切和连接（体外重组）…………………………………………………….18附录五大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化………………………………19附录六重组转化子DNA的鉴定（篮白斑筛选法）…………………………………………21附录七重组转化子DNA的鉴定（限制性DNA的体外扩增（PCR技术）………………………………………………………23附录九SDS－PAGE电泳………………………………………………………………………25附录十毛囊中DNA的提取……………………………………………………………………28附录十一基因型检测芯片检测ACE基因多态性………………………………………………282前 言二十一世纪是生物学的世纪，分子生物学作为生物学最前沿的基础学科是生物学类专业通向生物高技术的必修课程。随着人们在分子生物学水平上的研究和学习的深入和广泛展开，除了在分子水平上了解生物学的本质特征外，在分子水平如何进行生物学操作是生物学界共同关心并十分重视的问题。“DNA重组技术”就是利用分子生物学的一般原理阐述在分子生物学实验中所涉及的技术方法、原理和策略，是一门指导分子生物学实验操作的理论与实践相结合的课程。随着生物科学和生物技术的日益发展，人们越来越重视对生物学研究手段的了解和掌握。作为新世纪的生命科学学院的大学本科生有必要学习DNA重组技术的原理和方法，学会和掌握DNA重组技术。本实验讲义就是为基因工程操作的入门者而编写的。基因工程技术的核心内容就是DNA重组技术，即在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要生产出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。根据这一定义，基因工程技术涉及到极其广泛的生物学新技术新方法，但它又有一个基本的操作程序。因而，我们按照DNA重组技术的操作程序来安排实验，即从载体的选择→目的基因的制备→体外DNA的重组（酶切与连接）→重组DNA分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。在这个综合性实验中，每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连，只有获得第一个步骤的实验结果才能开始第二个实验。因此，实验也涵盖了所要训练的单项技术。在实验取材方面，我们以大肠杆菌为基本资料，建立适合于大肠杆菌的DNA重组技术实验。我们旨在通过这些实验，让同学们获得分子生物学最基本的技术训练，掌握最基本、最常用的技术，并对DNA重组技术有一个比较全面而系统的概念。此外，生物芯片技术已被国际公认为是正在和将要给二十一世纪的生物科学、医药、农业、环保等领域带来革命性变化的新技术，作为新世纪生物技术专业的大学生，有必要接触生物芯片的一些基本知识。鉴于目前实验条件有限，本实验教程的内容仅涉及一种基因（ACE基因）的多态性检测，让同学们了解基因检测芯片技术的一般原理和操作技术，为今后的工作和学习打下基础。作者2006.931.相关基础知识1.1DNA重组技术的基本原理基因工程技术的核心4和HindⅢ的识别序列和切割位置如下。EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTTCTTAA↑GTTCGA↑A连接酶则是将两段核酸连接起来的酶，相当于基因工程中的“糨糊”。常用的T4DNA连接酶是在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现和分离的，需Mg2+和ATP的存在才能发挥活性。它能催化两条匹配DNA链的3’－OH和5’ －P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。外源DNA就是需要克隆的DNA片断，一般有四种来源。（1）限制性内切酶切割DNA产生的片断，经电泳分离后回收获得；（2）大DNA分子经人工剪切产生的片断，这种片断一般是平末端；（3）cDNA，即与mRNA互补的DNA，由真核基因的mRNA逆转录制备；（4）人工合成的基因，例如根据蛋白质的氨基酸顺序和遗传密码合成的一些基因。外源DNA分子与载体（质粒）经过相同的酶切可以产生相互匹配的粘末端或平末端，经DNA连接酶连接就构成了重组DNA分子（重组质粒）。质粒的转化就是指将质粒或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌（受体细胞）的过程。这一步是实现重组克隆的增殖。受体细胞要接纳外源DNA，必须处于感受态。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而使外源DNA能进入细胞，一般转化率为109～1010转化子/μgDNA；对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化率约106～107转化子/μgDNA。获得转化子后可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。首先可根据转化细胞的特征进行初步筛选。由于载体都具有供筛选用的遗传标记，如抗生素，细胞转化后获得了这种遗传特性，使用含适当的相应抗生素的培养基即可初步筛选出转化的细菌。经过培养初步筛选出来的细菌不一定都含有重组DNA，还需进一步对DNA进行分析。常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定，观察PCR产物的大小是否与目的基因大小相符；方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。在确证得到核酸序列一致的基因后，接下来就要想办法使该基因得到表达，获得基因表达产物——蛋白（肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定。SDS-PAGE电泳不但能观察到蛋白在电场中的泳动位置，而且还能知5道蛋白的分子量大小以及由几个亚基组成。此外，还可将电泳胶上的蛋白质条带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应来检测特异蛋白的存在，即所谓的WesternBlotting。在基因表达产物也得到确证之后，就可以对表达的蛋白（肽）进行发酵和分离纯化，并研究其生物学功能。1.2基因芯片技术的基本原理基因芯片（genechip）技术是自20世纪90年代初发展起来的新兴技术，又称DNA芯片（DNAchip），是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统或CCD成像扫描系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片基本技术通常包括：芯片制作、样品制备（标记）、生物分子反应（杂交）以及数据分析（杂交信号的检测及分析）等步骤。在本实验教程中，我们给大家介绍单基因多人份的基因检测芯片的基本原理和技术。本实验教程使用的基因芯片制作是在醛基修饰后的玻璃基片上制造的。DNA探针（寡核苷酸片段，与被检测的靶DNA互补）溶液与点样缓冲液以1：1比例混合，通过点样仪点到醛基基片上，然后用芯片活化液固定8小时。固定后DNA探针将与醛基玻片共价结合，形成阵列；在基因阵列周围贴上反应舱，完成芯片制作过程。样品制备：通过向样本，如毛发、口腔粘膜脱落细胞、全血中加入抽提液，煮沸、离心等操作，使样品中的细胞裂解释放出DNA、同时使蛋白变性沉淀，完成样本DNA的抽提。抽提获得的染色体DNA浓度太小，直接进行杂交检测无法获得信号。将抽提获得的染色体DNA作为模板，进行PCR扩增。针对待检基因序列的SNP位点，设计20bp左右的上、下游引物用于扩增靶DNA，同时，在引物的5’ 端加上标签序列，对扩增靶DNA进行标记。杂交反应：将扩增后的PCR产物变性成单链DNA分子，由于基因芯片上固定有与标签序列相结合的标签探针，可与PCR扩增产物通过碱基配对进行特异性杂交。这样，芯片上的每个标签探针都结合有一个扩增靶DNA分子。然后将芯片与经生物素（Biotin）标记的特异性检测探针进行杂交，就可以知道样本DNA序列中的SNP信息，即到底是属于野生型还是突变型，是杂合子还是纯合子。在杂交反应中，序列组成、靶标DNA分子和探针的长度、杂交温度、盐浓度等均会影响杂交效率和强度。显色原理：采用生物素标记的碱性磷酸酶（AP）催化的NBT/BCIP显色反应的检测方法。首先，特异性检测探针上的生物素先与链亲和素碱性磷酸酶复合物（Stripavitin-AP）反应，生成新的复合物：Biotin-Stripavitin-AP，后者发生如下的显色反应：Biotin-Stripavitin-AP+BCI-P→BCI-OH+Pi（pH7.5）BCI-OH+NBT→蓝紫色沉淀其中，BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT为硝基四氮唑蓝。检测原理：采用CCD（ChargeCoupledDevice即电荷耦合器件）原理，将芯片上的色6斑信号扫描成图像，用ArrayDoctor分析软件进行分析，给出靶基因SNP信息。单基因多人份基因芯片检测原理示意图2实验目的和要求2.1DNA重组技术实验目的和要求本实验利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。2.1.1提取基因工程中的运载基因的载体DNA，掌握最常用的提取和纯化DNA的方法。2.1.2掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。并以此法进一步区分质粒DNA中染色体DNA和RNA的污染；估计出质粒DNA分子量的大小；观察质粒DNA三种基本构象的比例；也可用此法纯化DNA及计算出DNA的浓度，是基因工程实验中最常用的实验方法。2.1.3学习和掌握用紫外分光光度法测定DNA的纯度和浓度。2.1.4学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法。了解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。2.1.5学习和掌握感受态细胞的制备过程。2.1.6掌握质粒的转化方法，学习把体外重组的DNA（即连接反应物）导入受体细胞（感受态细胞），使受体菌具有新的遗传特性，并从中选择出阳性转化子。2.1.7学习从转化子中筛选和鉴定目的克隆的方法，掌握菌落PCR和限制性内切酶酶切两种鉴定方法。2.1.8掌握PCR反应的基本原理与实验技术，了解引物设计的一般要求。2.2基因芯片技术实验目的和要求2.2.1了解从毛囊中提取基因组DNA的原理和技术。2.2.2了解在PCR扩增过程中如何对样品进行标记。2.2.3掌握核酸杂交反应原理，将样品与生物素标记的探针杂交，通过检测杂交信号得出基 7因的基因型。2.2.4熟悉利用基因芯片技术检测人染色体基因多态性的基本原理和方法。3实验材料和仪器3.1实验材料：菌种：大肠杆菌JM101，大肠杆菌DH5α质粒：pUC18/19（Ampr）3.2主要仪器设备：超净工作台；恒温培养箱；恒温振荡器；恒温水浴锅；微波炉；低温冰箱；台式高速离心机；漩涡混合器；分析天平；脱色摇床稳压电泳仪；垂直/水平式电泳槽；紫外－可见光分光光度计；紫外检测仪；SDS-PAGE电泳系统PCR扩增仪；凝胶成像分析系统ACE基因检测芯片（上海百傲科技有限公司提供）BaiO生物芯片识读仪（上海百傲科技有限公司提供）ArrayDoctor分析软件（上海百傲科技有限公司提供）3.3实验器皿：锥形瓶；试管；烧杯；量筒；三角推棒；培养皿；tip头；Eppendorf管；微量移液枪（2μl－1000μl）；微量进样器（50μl或100μl）；一次性手套，牙签。3.4细菌培养基：LB液体培养基蛋白胨1.0％酵母膏0.5％NaCl0.5%pH7.5固体培养基加入2％琼脂。将上述培养基灭菌后（1.1公斤/cm2，保温20分钟），加入100mg/mL的Amp，使其终浓度为100ug/mL。3.5分子生物学试剂：RNaseA溶液:10mg/mL，0.1MNaOAcpH4.8,0.3mMEDTA，80－100℃加热10分钟，自然冷却到室温，分装，－20℃保藏。DNAMarker；限制性内切酶EcoRI或HindIII；λDNA（线状）；质粒纯化Kit；TaqDNA聚合酶，4×dNTP；引物溶液I：50mM葡萄糖；25mMTris-HCl(pH8.0)；10mMEDTA溶液II：0.2NNaOH；1%(w/v)SDS8溶液III：5MKAc60mL；冰醋酸11.5mL；H2O28.5mL核酸上样缓冲液：50％蔗糖，0.2％溴酚兰溶液（1）TBE缓冲液（Tris-硼酸）：89mMTris-硼酸；2mMEDTA（pH8.0）。（2）TAE缓冲液（Tris-HAc）：0.04MTris-HAc，1mMEDTA（pH8.0）。琼脂糖：按所需浓度称取，并用核酸电泳缓冲液配制，微波炉或煤气加热熔化使用。EB染液替代品：Goldernview染料氨苄青霉素（Amp）溶液:100mg/mL，无菌水溶解IPTG溶液（20％，m/V）：20mgX-gal溶于1mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存 X-gal溶液（20％，m/V）：1gIPTG溶于4mL去离子双蒸水中，定容至5mL，过滤灭菌后，-20℃保存苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1（V/V/V）70%冷乙醇（－20℃保藏）3.6SDS-PAGE电泳试剂：储备液1．2MTris-HCl(pH8.8),100ml2．1MTris-HCl(pH6.8),100ml3．10%SDS,100ml4．50%甘油,100ml5．50%溴酚兰,10ml工作液A液：100ml1．30%丙烯酰胺(29.2g)2．0.8%甲叉双丙烯酰胺(0.8%)加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶避光保存。B液：100ml1．75ml2MTris-HCl(pH8.8)2．4ml10%SDS1．21mlH2OC液：100ml1．50ml1MTris-HCl(pH6.8)2．4ml10%SDS3．46mlH2O过硫酸铵，5ml0.5g过硫酸铵溶于5ml蒸馏水。电泳缓冲液，1L91．3g2．14.4g甘氨酸3．1gSDS加蒸馏水定容到1L。5×上样缓冲液，10ml1．0.6ml1MTris-HCl(pH6.8)2．5ml50%甘氨酸3．2ml10%SDS4．0.5ml2-巯基乙醇5．1ml1%溴酚兰染色液,1L1．1g考马斯亮蓝R-2502．450ml甲醇3．450ml H2O4．100ml乙酸脱色液，1L1．100ml乙醇2．100ml冰醋酸3．800mlH2O其它试剂均为国产分析纯3.7基因芯片试剂：毛囊DNA提取试剂盒，Baio基因型检测芯片试剂盒（上海百傲科技有限公司提供）4实验内容4.1DNA重组技术实验内容4.1.1载体的制备从大肠杆菌中提取质粒作为运载外源基因的载体。并将提取到的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，观察质粒大小、构型和纯度。为作下一步的酶切，连接及转化试验，还必须测定DNA的纯度和浓度。将提取到的质粒用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，可检测质粒纯度并根据吸光值计算出浓度。4.1.2目的基因的制备根据已知基因序列，设计两条引物，运用PCR方法扩增出目的基因片断。将扩增片断用琼脂糖凝胶电泳检测，用PCR产物回收Kit纯化PCR产物，为下一步酶切准备。注意，如果是真核基因，应该是用其cDNA序列进行克隆。4.1.3体外DNA的重组（酶切与连接）10选择合适的两种限制性内切酶对供体（目的基因）和受体（载体）同时进行酶切，产生相匹配的粘性末端，再利用T4DNA连接酶将基因片段与载体连接起来，在体外构建成重组DNA分子。4.1.4重组DNA分子引入受体细胞制备大肠杆菌感受态细胞。将重组DNA分子转化入感受态细胞，抗性平板筛选并培养过夜观察。4.1.5转化子的筛选利用重组质粒的氨苄抗性和蓝白斑筛选法对转化子进行初筛。4.1.6重组DNA分子的鉴定采用菌落PCR法鉴定和限制性内切酶分析来进一步确定阳性克隆。或者通过DNA测序来直接检验。4.1.7目的基因产物的检测将阳性克隆发酵培养，若是诱导表达质粒，则加入诱导物进行诱导表达，然后用SDS-PAGE分析目的基因产物的大小与表达量等，若有合适抗体，还可直接用Westernblotting检测目的基因是否表达。4.2基因芯片技术实验内容4.2.1毛囊中DNA的抽提采集带毛囊的毛发，经裂解后分离出全基因组DNA。4.2.2人染色体ACE基因的PCR扩增将抽提获得的全基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。针对ACE基因（AngiotensinConvertingEnzyme血管紧张素转化酶）序列的SNP位点，设计20bp左右的上、下游引物用于扩增靶DNA，同时，在引物的5’端加上标签序列，对扩增靶DNA进行标记。4.2.3 ACE基因的基因型检测芯片杂交、显色、检测实验将PCR扩增产物进行预杂交，使PCR产物的标签序列与基因芯片上的标签探针结合。提高温度，将基因芯片与带有生物素标记的特异性检测探针杂交、显色并进行检测分析。4.2.4检测结果的验证实验（琼脂糖凝胶电泳方法）人类ACE基因的16内含子中，存在287bp的插入/缺失(I/D)多态性。因此通过PCR扩增再进行琼脂糖凝胶电泳检测，可以发现有490bp(I等位基因)和190bp(D等位基因)两个片段，故可出现三种DNA基因型：（1）由两个490bp等位基因构成的基因型II；（2）由两个190bp等位基因构成的基因型DD；（3）由一个490bp、一个190bp等位基因组成的基因型ID。因此，可以通过电泳验证基因芯片的检测结果。11图4.1ACE扩增产物的电泳结果M：分子量标记II：纯合子插入型ID：杂合子插入/缺失型DD：纯合子缺失型5习题1.原核表达系统的基本要素有哪些？2.为何真核基因在原核系统中表达时要用其cDNA进行克隆？3.实验小论文以“×××基因的克隆和表达”为题，模拟一个来源于真核生物的基因在大肠杆菌中进行表达的实验论文。要求简单介绍欲克隆基因的背景知识，克隆策略及重组DNA分子筛选等内容。书写格式请参考《中国科学》杂志上相关文章格式。实验小论文中应包含如下内容：标题，摘要（中英文），关键词，前言，材料，方法，结果，讨论和参考文献等。4.如何实现一人份多基因检测的基因芯片设计、制备？6参考资源6.1参考书目：1.分子克隆实验指南（第三版），科学出版社翻译版，20022.基因工程原理（第二版）上册，吴乃虎，科学出版社，19983.基因工程原理（第二版）下册，吴乃虎，科学出版社，20014.现代基因操作技术，胡福泉主编，人民军医出版社，20005.基因工程概论，张惠展编著，华东理工大学出版社，19996.基因工程实验技术（第二版），彭秀玲编著，湖南科学技术出版社，19987.生物芯片技术实验教程，邢婉丽，程京主编，清华大学出版社，2006 6.2参考产品目录：很多分子克隆技术是由一些知名公司开发出来的，其分子生物学产品目录产品介绍部分有很多值得我们学习的信息。她既对产品所涉及的基因操作原理作出论述，也对产品的技术参数作出详细的比较介绍。其工作原理、操作步骤深入浅出，图文并茂，帮助初学者对操作原理和实验步骤的理解。其附件、附表等参考信息栏目对研究工作者也有很强的借鉴意义。如NewEnglandBiolabs公司在分子生物学试剂方面，Bio-Rad公司在分子生物学仪器方面都有很深的造诣。1.Invitrogen公司分子生物学产品目录www.invitrogen.com2.NewEnglandBiolabs公司分子生物学产品目录www.neb.com3.Promage公司分子生物学产品目录www.promage.com.cn4.TAKARA公司分子生物学产品目录www.takara.com.cn6.3参考网站：互联网上有很多关于分子生物学以及生物芯片的网站，这里仅仅罗列了一部分。www.bioon.com生物谷www.biooo.com中国生物论坛www.biolover.com中文分子生物学个人交流网www.dnalc.org冷泉港实验室www.ncbi.nlm.nih.gov美国国立生物信息中心www.genehealth.com.cn上海百傲科技有限公司13附录.附录一质粒DNA的提取质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。一、原理：从细菌如大肠杆菌或枯草杆菌中提取DNA的方法很多，其分离原理可根据DNA分子大小的不同、碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。目前常用的有碱变性提取法、酸酚法；PEG法、煮沸法以及溴化乙锭——氯化铯梯度离心法。这些方法各有利弊，有的操作繁琐，难以控制，有的纯度不够，有的需要昂贵的仪器。而碱变性法被认为是一种既经济，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用这种方法提取的DNA可用于酶切、连接和转化。碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环结构的两条互补链不能完全分离，当以pH4.8的NaAC缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存于溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠连的网状结构，通过离心与不稳定的大分子RNA、蛋白——SDS复合物等一起沉淀下来而去除，从而达到分离的目的。二、操作步骤：1.挑取大肠杆菌JM101（pUC19）单菌落接种于20mLLB液体培养基中（含氨苄青霉素100ug/mL），于37℃ 振荡摇床中培养过夜（10－12小时）。2.3.4.5.取1.2mL培养物入一1.5mLEppendorf管中，12000rpm，离心20s，弃尽上清。往沉淀中加100ul溶液I，旋涡器上振荡使菌体重悬，37℃水浴15min。往3中溶液加200ul溶液II，轻柔混匀至溶液澄清，冰浴5min。往4中溶液加150ul溶液III，轻柔颠倒2次，冰浴10min；12000rpm，离心15min。吸上清，转入一新的1.5mLEppendorf管中。6.往5中上清加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混合物，用力混匀成乳状不分层；12000rpm，离心10min。7.吸6中上清，转移至新的1.5mLEppendorf管中，加入等体积氯仿，用力混匀；12000rpm，离心5min。8.吸7中上清至新的无菌1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置15分钟；或加入两倍体积的无水乙醇；-20℃静置30min。12000rpm，离心15min。9.小心弃去上清，加入1mL-20℃预冷的70%乙醇，颠倒3次，12000rpm，离心2min；14弃尽液体，室温干燥至沉淀变透明。10.加入20ul无菌水溶解沉淀；RNaseA（10mg/mL）1ul（1/20体积加入，终浓度0.5mg/mL），37℃水浴15分钟。-20℃保藏。pUC19质粒示意图附录二 琼脂糖凝胶电泳一、原理：溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发出荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA含量，如将已知的标准样品做电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需5~10ng（1ng=10-9μg）DNA，就可从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测0.05μg~0.01μg的DNA。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值呈反比关系。可以以此特征区别染色体DNA、质粒DNA和RNA，若用小刀取下含质粒DNA的凝胶带经电泳洗脱则可得纯DNA。若将质粒DNA用单一切点的酶消化后，与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离就可估计出该样品分子量的大小。DNA分子在凝胶中泳动的速度还与DNA分子本身的构型有关，共价闭合环状DNA（cccDNA）,一条链断开的开环DNA（ocDNA）,两条都断开的线状DNA（LDNA）在电泳中的迁移速率不同，一般cccDNA泳动最快，LDNA次之，ocDNA最慢，因而可以通过电泳来区别质粒DNA的构型。二、操作步骤：1、选择适当大小的电泳槽（大、中、小、微等类型）。2、选择适当大小的点样梳其底部离电泳槽水平面的距离为1~2mm。153、制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子量的大小，决定凝胶中琼脂糖的含量。一般可参照下表：4、称取1%浓度的琼脂糖，加入TBE（或TAE）缓冲液，在微波炉中熔解，待凝胶冷却到50℃左右时，轻轻倒入电泳槽水平板上，除掉气泡。5、待凝胶冷却至凝固后，在电泳槽10、将凝胶放在紫外观察灯下观察电泳结果。质粒构型观察示意图16附录三DNA的纯度、浓度的测定——紫外分光光度法一、原理：核酸具有吸收紫外光线的能力，在波长为260nm的条件下具吸收峰值，而蛋白质在280nm时具有吸收峰值。根据经验数据，纯核酸溶液OD260=1.8~2.0时，认为已达到所要求的纯度。在样品中含有蛋白质等杂质时，会使OD260/OD280的比值下降。用此法测定时，只能区别核酸和蛋白质，而无法区别质粒DNA与染色体DNA及RNA。二、计算DNA浓度（μg/mL）=OD260稀释倍数/0.026×LDNA纯度=OD260/OD280（要求比值在1.8~2.0范围内）注：L为比色杯厚度（cm,一般为1cm。）核酸和蛋白质的吸光度三、操作步骤：1、取石英杯两只，分别加入TE缓冲液2990μl。2、在对照杯中加入10μlTEbuffer,在样品杯加入10μl样品。盖上盖子，上下几次摇匀。3、放入751型分光光度计的比色槽中，使用氢灯，分别测出OD260和OD280的值。4、按上述计算公式算出你所制备的DNA的纯度和浓度。17附录四 DNA的酶切和连接（体外重组）一、原理：各种限制性18将连接反应管中摇匀后放入12℃条件下连接反应过夜或16℃下连接反应2-3小时。操作中的注意事项：1、基因工程是微量操作技术，DNA样品与大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化一、原理：重组DNA转化不同细菌有不同的转化效率。转化效率的高低与受体菌的感受态有关。所谓感受态，就是细菌具有吸收周围环境中的DNA的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多，目前主要两种假设：1、局部原生质体化假说，即认为是由于细菌表面的细胞壁结构发生变化——局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过细胞膜进入细胞；2、酶受体假说，认为感受态细胞的表面形成一种感受态的细胞使极少数。而只有感受态的细胞才能稳定地收取外源DNA分子。而且感受态是在短暂时间内发生地。一般出现在细菌对数生长的后期。作为基因工程的受体菌必须是基因重组缺陷突变体，必须能同外来DNA分子发生遗传重组，同时它们又必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。使外来基因（DNA）不受其限制酶的降解，这样才能进行遗传操作。受体菌的感受态往往通过CaCl2处理而获得。DNA分子转化的复杂过程如下：1、吸附：完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；2、转入：双链DNA分子解链。单链DNA分子进入受体菌，另一条链被降解；3、自稳：外源质粒DNA分子在受体菌内又复制成双链环状DNA；4、表达：外源基因随同复制子同时复制，并被转录翻译。对DNA分子来说，成功转化的比率极小，仅占DNA分子的0.01%。二、操作步骤：（一）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)1、从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5mLLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100mLLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；192、每组取培养液2个1.5mL转入1.5mL离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；3、倒净上清培养液，用1mL冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；4、0～4℃，4000r／min离心10min；5、弃去上清液，加入500μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；6、弃去上清液，加入100μl冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5mL离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。（二）细胞转化1、分别取3个100μl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入10μl重组质粒DNA(体积不超过10μl)+ 100μl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng+100μl感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng未酶切质粒DNA十100μl感受态细胞悬液。2、将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min3、立即向上述管中分别加入0.8mLLB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.9mL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。（三）平板培养（有时需要稀释）1、取各样品培养液0.1mL，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。2、菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱用CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×10－2×10个转化菌落。在实际工作中，每微克有10以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。（四）检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，按下列公式计算转化率。转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）56720附录六 重组转化子DNA的鉴定（篮白斑筛选法）一、原理：现在使用的许多质粒载体(如pUC系列和它们的衍生载体)都带有一个大肠杆菌DNA的短片段，其中含有β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码信息及调控序列。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它不破坏阅读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的N端，而不影响其功能。这种类型的载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分的宿主细胞。尽管宿主和载体编码的片段都没有活性，但它们能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。这样，lacZ基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种互补现象称为α互补。由α互补而产生的lac细菌落易于识别，因为它们在生色底物X-gal存在的情况下形成蓝色菌落。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无α互补能力的N端片段。因此，携带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简化了在这种构建质粒载体中鉴定重组子的工作。仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落，并识别可能含有重组质粒的菌落。然后通过小量制备质粒DNA，进而限制酶酶切分析或其他方法就可以确定这些质粒的结构。α互补筛选是非常可靠的，但并非永不出错：外源DNA的插入并不总是激活β-半乳糖苷酶α片段的互补活性。如果外源DNA很小（小于100bp），或者插入片段没有破坏编码框，也没有影响α片段的结构，就可能不会严重影响α互补。虽然这种现象在文献中有所报道，但是极为罕见，因此只对遇到这种问题的研究者才有意义。不是所有的白色克隆都携带重组质粒。Lac序列的突变或者丢失可能掩盖质粒表达α片段的能力。不过在实际中并不成问题，因为在质粒群体中产生lac-突变体的频率远远低于在连接反应中产生的重组子的数目。IPTG（异丙基-β-D-半乳糖苷）是一种乳糖类似物，可使lacZ抑制子失活，从而诱导+lac操纵子转录。然而，常用于α互补的大多数细菌并不合成明显数量的lacZ抑制子。因此，一般没有必要通过诱导宿主菌或质粒编码的β-半乳糖苷酶片段来进行细菌克隆的组织化学分析。只有在细菌携带lacZ抑制子的L等位基因或质粒中含有lacI基因的情况下，IPTG应被用来诱导β-半乳糖苷酶两种片段的合成。二、操作步骤：1、在含有Amp的预制90mmLB琼脂板中央滴加40ul2％X-gal和7ul20%IPTG。2、用一个无菌的涂布器拨散X-gal溶液，使之分散于培养板整个表面，于37℃温育直至全部液体消失。（新鲜平板约需3－4小时）3、接种需要鉴定的细菌。100ul细菌液（50000个细胞/mL）铺板。4、待接种液完全吸收后，颠倒培养板与37℃培养12~19小时。5、取出培养板与4℃放置数小时（过夜），使蓝色在这一期间充分显色。6、鉴定携带重组质粒的克隆。21Q附录七重组转化子DNA的鉴定（限制性内切酶分析法）一、原理：在实验六的选择性培养基上长出的菌落，由受体菌DH5α的表型Amp-转变为Amp＋，且颜色由蓝色变为白色的菌落，证明重组质粒已转化入受体菌，但要证明插入片段的大小和序列，还需进一步鉴定。常用方法之一是进行重组质粒的抽提，然后电泳分析，观察其分子量与原有载体相比是否增大；方法之二是将抽提的重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符；方法之三是以重组质粒为模板进行PCR鉴定，观察PCR产物的大小是否与目的基因大小相符；方法之四则是将重组质粒进行DNA序列分析，直接分析重组质粒上的插入片段即目的基因的大小与序列是否正确。本实验将初筛得到的白斑菌落进行过夜培养，用试剂盒（Kit）快速抽提和纯化重组质粒，然后对重组质粒进行限制性内切酶分析，观察酶切下来得到的DNA片段大小是否与预计的相符，从而对重组转化子DNA进一步鉴定。二、操作步骤：（一）质粒提取1．将过夜培养的1－3mL细菌高速离心2min，彻底去掉上清，在细菌沉淀中加入250ulSolutionⅠ，振荡至沉淀彻底悬浮或用枪头吹打均匀。2．250ulSulutionⅡ，立即小心温和地倾倒离心管5－10次以混匀，室温孵育5min至溶液变的澄清。3．350ul预冷的SolutionⅢ，立即小心温和颠倒离心管5－10次以混匀，冰上放置5min，此时溶液中出现大量的絮状物，于12000－13000g，4℃高速离心10min，以确保沉淀层比较致密。4.小心吸取约700ul上清转移到套放于2mL收集管中的吸附柱内，小心切勿吸入絮状蛋白，12000－13000g高速离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5.在吸附柱中加入500ulSolutionⅣ,于12000－13000g高速离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6.在吸附柱中加入650ulSolutionⅤ，于12000－13000g高速离心1min，倒掉收集管中的液体。7.重复步骤6一次。8.将吸附柱放入同一个收集管中。于12000－13000g空柱离心2min。9.将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中加入50ulSolutionⅥ溶液（65℃ 水浴预热，可提高质粒的得率），室温下静置2min，高速离心1min，将洗脱下来的DNA溶液于－20℃保存。22附录八DNA的体外扩增（PCR技术）聚合酶链式反应（PolymerseChainReaction,简称PCR）技术产生时间虽不长，却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各领域。PCR技术能够快速特异地扩增任何目的基因或DNA片段，并很容易使得微微克（pg）水平的起始物达到毫微克（ng）水平的量。它不仅可以用于基因分离、克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制探查、法医鉴定等诸多方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科和研究进展。一、原理：PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：待扩增DNA于高温下解链成为单链模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3’端开始掺入，沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA新股。由于每一周期所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经过25-30次周期之后，理论上可增加10倍，实际上至少可扩增10倍，一般可达10-10。5679二、操作步骤：1、按顺序在0.2或0.5mLEppendorf管中加入（1）无菌去离子水（2）10×缓冲液（3）混合dNTP（4）上游引物（5）下游引物23（6）模板DNA（7）TaqDNA聚合酶2、摇匀后离心5s，将Eppendorf管放入PCR仪，设置反应程序；3、按下列步骤反应；第一步：94℃预变性3－5min；第二步：基因扩增，约30－35次循环（1）94℃变性反应（2）55-58℃退火反应（3）72℃ 延伸反应第三步：72℃适温延伸反应5－10min。4、取少量（10-20μl）PCR反应液电泳分析，可用1.5%聚琼脂或10-12%聚丙烯酰胺电泳。5、EB染色，观察并记录扩增片段大小。注意：电泳时需有标准DNA分子量Marker和不加模板的阴性对照样品三、影响PCR的因素PCR方法操作简便,但影响因素较多,欲得到好的反应结果,需根据不同的DNA模板,摸索最适条件.现将几种主要影响因素介绍如下:1、模板单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品，若起始材料是RNA，须通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA），但为了保证反应的特异性，一般还宜用ng量级的克隆DNA、μg水平的染色体DNA或10拷贝的待扩增片段来做起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。另外，有的实验者认为，用线性化的或缺刻的DNA比用超螺旋构型的DNA能获得更好的反应结果；虽然有时并没有进行线性化或缺刻的步骤，但因样品已存在有部分这种构型，故PCR亦能成功。2、引物引物是决定PCR结果的关键。下列原则有助于引物的合理设计：（1）引物长度以15-30个碱基为宜，（G+C）含量约50%，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列；（2）避免引物内部形成二级结构，必要时应通过计算机进行结构分析；（3）两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，避免形成“引物二聚体”；（4）人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化；（5）引物浓度不宜偏离，浓度过高有两个弊端，一是易形成引物二聚体，二是当扩增微量靶目标并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般来说，用低浓度引物不仅经济，反应特异性也较好。3、Mg浓度Mg浓度对反应物的特异性及产量有显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量减少。在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg为1.5mmol/L较合适。若样品中含有EDTA或其他螯合物，可适当增加Mg的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须2+2+2+2+424相应调节Mg的浓度。4、dNTP浓度高浓度dNTP易产生错误掺入，而浓度过低，势必降低反应产物的产量。PCR常用50-200μmol/L。四种脱氧单核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其他几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg结合，使游离Mg降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg浓度。5、TaqDNA聚合酶用量在100μl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。6、循环参数PCR程序是把起始材料加热到90℃-95℃，保持短时间使双链DNA（dsDNA）解链，然后冷却到37℃-55℃，使引物同模板上与其相互补链的序列退火，再升温至70℃-75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸使引物沿模板延伸。解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。用DNA扩增仪时，94℃保持1分钟可使模板的起始物完全变性。若用低于94℃时条件，则需适当延时，但不可过长，因为高温环境对聚合酶活性保持不利。引物与模板退火温度由引物及GC含量决定。一般先用55℃ 的反应条件，如果在电泳检测时发现有并非所需的产物，则要增加退火温度。短时间退火（1-2分钟）有利于产物的特异性。引物延伸在70℃-75℃保温的时间根据扩增的片段的长短来调节。正常情况下，每分钟可延伸1kb的长度，如果扩增的片段在15bp左右（或者更少），则可免去此步骤，因为退火温度下聚合酶显示出的活性以完成短序列的合成。常规PCR一般为25-40个周期。随着周期次数增加，TaqDNA聚合酶活性降低、聚合时间延长、引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易发生错误掺入。所以，在满足产物得率的前提下，应尽量减少周期次数。2+2+2+2+附录九SDS－PAGE电泳一、原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS-PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。本实验所介绍的实验步骤及试剂均是根据Bio-Rad的小凝胶系统来计算的，但这些步骤也适用于其他系统。最适分辨率25丙烯酰胺浓度分辨率15%15~45kd12.5%15~60kd10%18~75kd7.5%30~120kd5%60~212kd二、操作流程：1、X%分离胶的配制A液x/3mlB液2.5mlH2O（7.5-x/3）ml10%过硫酸铵50μlTotalVolume10ml2、浓缩胶的配制A液0.67mlC液1mlH2O2.3ml过硫酸铵30μlTEMED5μlTotalVolume5ml3、 样品的处理及上样将蛋白质样品与5×上样缓冲液混合（20μl样品+5μl上样缓冲液），沸水煮2~10分钟，高速离心1分钟，用微量进样器上样20μl。4、电泳浓缩胶部分电压60V分离胶部分电压120V5、染色、脱色染色0.5小时脱色0.5小时（重复两次）三、操作步骤（一）灌制分离胶1．组装凝胶模具可按照使用说明书，装配好灌胶用的模具。2．将A液、B液及蒸馏水在一个小烧杯中混合，A液中的丙烯酰胺是神经毒素，操作时必需戴手套。263．加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀（过量气泡的产生会干扰聚合）。凝胶很快会聚合，操作要迅速。4．小心将凝胶溶液用移液枪缓慢加入两块玻璃片之间，注意不要产生气泡。5．当加入适量的分离胶溶液时，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1－5mm的水层，这使凝胶平面变得平整。6．等待30－60分钟，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。（二）灌制浓缩胶1．吸进覆盖在分离胶上的水。2．将A液、C液和蒸馏水在小烧杯中混合。3．加入过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀。4．将浓缩胶溶液用移液枪加至分离胶上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。5．将梳子插入凝胶100V分离胶部分电压200V2．将电压调至100V，保持恒压。当样品跑至分离胶时，将电压调至200V，保持恒压。3．当染料前沿迁移至凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。4．从电泳槽中取出凝胶玻璃板，并轻轻撬开玻璃板，凝胶会贴在其中的一块板上。（五）染色与脱色1．将胶移入一个盛有少量考马斯亮蓝染色液的培养皿中，在摇床上振荡染色，使染色均匀。染色时间为0.5小时。2．弃去染液，换脱色液。清晰的蛋白条带很快会显现出来。为了脱色完全，需数次更换脱色液并振荡过夜。27附录十毛囊中DNA的提取一、原理：常规DNA检测样本有很多种，比如从血液、口腔（口腔粘膜细胞）、带毛囊的毛发、肌肉、骨骼、胎儿组织或者是绒毛组织都可以提取全基因组DNA。蛋白酶K能消化大多数天然蛋白，并能快速灭活细胞溶液中的DNA酶和RNA酶，非常适合从含角蛋白丰富的毛发中分离全基因组DNA。二、试剂盒组成：1．毛囊清洁液：规格：500ul/管 5管2．毛囊裂解液（含蛋白酶K）：规格：500ul/管1管三、操作步骤：1．取带有毛囊的毛发2～5根，将含毛囊端在清洁液中浸洗1min，将毛发取出，室温晾干。注意手不要触及毛发的毛囊部位，即黑色头发根部的白色物质。2．将毛发的含毛囊端置于1.5mL离心管中，剪去管外上端多余部分，加入毛囊裂解液60μL。3．放入65℃水浴，孵育30min，然后94℃15min。4．取出离心管，以3000rpm离心30秒，离心完毕后取上清液，上清液可直接用于PCR扩增。如不立即使用，置于-20℃保存。注意：-20℃可保存一年，使用前低温溶化，反复冻融不超过5次。附录十一基因型检测芯片检测ACE基因多态性一、原理：采用基因芯片检测技术，结合PCR体外扩增方法，即扩增产物与固定有基因探针的基因芯片进行特异性杂交，经过酶促显色反应，检测人染色体中ACE基因插入、缺失的多态性，为预防心血管疾病提供参考。二、试剂盒组成：1．ACE基因检测芯片：每张芯片可同时检测4人份，12张/盒。2．预杂交液：3mL/瓶，1瓶。3．杂交液：杂交液A和B，3mL/瓶，各1瓶。4．洗液1（9mL/瓶），洗液2（9mL/瓶），洗液3（3mL/瓶）各1瓶。5．显色液：3mL/瓶，1瓶。6．抗体液：1mL/管，3管。7．带标记的PCR扩增引物：ACE-1，ACE-2，ACE-3，ACE-4一套，12个/套8．ACE基因型标准对照：II型、DD型、ID型三、操作步骤：（一）、抽提人基因组DNA，参考附录十。28（二）、PCR扩增：1、从试剂盒中取出ACE-1扩增液、ACE-2扩增液、ACE-3扩增液、ACE-4扩增液和Taq酶，3000g离心数秒，使液体流回管底；分别在每管中加入Taq酶溶液1.5μL；2、按顺序分别在各扩增管中加入抽提好的相应人基因组DNA样品3μL，混匀，离心10秒；3、将各管放入热盖PCR仪中，按下列条件扩增：94℃4min,94℃25sec,56℃30sec,68℃1min25sec做35个循环，最后72℃5min。4、取各管PCR扩增产物各10μL，加入同一个0.2mL的薄壁管中（自备），混和均匀，98℃变性5分钟，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置。（三）、杂交1、取出ACE基因检测芯片，做好样品编号，在A、B杂交舱中各加满预杂交液溶液（约110μL），于46℃静置5分钟，吸除预杂交液；2、 取无菌的1.5mL离心管（自备），分别从杂交缓冲液瓶A、B中吸出65μL杂交缓冲液，各加入已变性的PCR扩增产物混合物48μL，混匀，将液体全部加入到A、B杂交舱（约110μL）中（加液时应注意无气泡产生）；3、将ACE基因检测芯片迅速放入46℃恒温箱中，保温30分钟。同时取1.5mL离心管（自备），从洗液1瓶中分别吸取700μL洗液1，于46℃恒温箱中预热；4、从恒温箱中取出ACE基因检测芯片，吸除A、B杂交舱中溶液；5、在A、B杂交舱中各加满已预热的洗液1（约110μL），46℃保温5分钟，然后吸除。再重复此步骤两次。（四）、显色1、在A、B杂交舱中加满洗液2溶液（约110μL），室温放置2分钟；2、吸除杂交舱中溶液，向A、B杂交舱中加满抗体液溶液（约110μL），室温放置20分钟；3、吸除杂交舱中溶液，向A、B杂交舱中加满洗液2溶液（约110μL），室温放置5分钟；再重复此步骤一次；4、吸除杂交舱中溶液，向A、B杂交舱中加满洗液3溶液（约110μL），室温放置2分钟；5、吸除杂交舱中溶液，向A、B杂交舱中加满显色液溶液（约110μL），46℃避光放置40分钟；（五）、检测6、吸除杂交舱溶液，小心揭除杂交舱，将显色载玻片显色区小心用蒸馏水冲洗一下，置46℃烘干；7、将显色载玻片面朝下扣在BaiO生物芯片识读仪的片槽上检测，具体操作见仪器使用说明。检测图象经ArrayDoctor软件分析可自动输出检测结果。四、注意事项：1、整个检测过程应分三区进行，一区进行样本处理、加样等；二区进行扩增反应；三区进29行杂交试验、检测及结果分析；各区的仪器、设备和工作服应独立使用。2、在操作中，应使用一次性手套（经常更换），一次性PCR专用离心管、移液器头（带滤嘴自卸式），特别注意防污染。3、操作台、移液器、离心机、扩增仪等设备应经常用10%次氯酸钠及或70%乙醇擦拭消毒。实验房间、超净工作台应定期及每次实验后用紫外灯处理。4、请勿用手或其它物体接触显色载玻片显色区表面，以免损坏。30第二部分动物细胞培养及细胞活性检测技术叶希韵编目 录前言………………………………………………………………………………………………321.实验研究目的和要求…………………………………………………………………….…332.实验研究材料和仪器…………………………………………………………………….…333．实验研究实验器械、器皿的清洗和消毒…………………………………………………………36附录二细胞培养用液的配制…………………………………………………………………40附录三动物细胞原代培养技术…………………………………………………………….…41附录四动物细胞的传代培养…………………………………………………………………43附录五培养细胞的冻存与复苏…………………………………………………………….…44附录六细胞计数………………………………………………………………………………45附录七细胞成活率测定………………………………………………………………………46附录八MTT法检测细胞相对数和相对活力…………………………………………………46附录九细胞生长曲线的测定…………………………………………………………………47附录十乳酸脱氢酶（LDH）的含量测定方法………………………………………………48附录十一细胞丙二醛(MDA)含量的微量测定………………………………………………49附录十二细胞超氧化物歧化酶（SOD）的测定……………………………………………50附录十三细胞膜通透性检测…………………………………………………………………51附录十四蛋白含量标准曲线的绘制和蛋白含量的测定……………………………………5231前言由于活细胞是构成活的有机体的基本单位，迄今为止，对活细胞的生命现象仍有许多奥秘有待探索，因此研究活细胞仍是生命科学的中心问题之一。体外培养细胞是研究活细胞的最基本方法和手段。因此细胞培养技术是细胞工程实验中的基础和基本功，是必不可缺的必须也是必须掌握的基本实验技术。本模块实验通过动物细胞培养基本技术的学习和训练，包括动物细胞培养的基本知识和概念，细胞培养的条件，各种组织来源的原代细胞和传代细胞的培养方法，细胞的营养、环境和影响细胞生长的各种因素，特别是对正常细胞、肿瘤细胞的培养和细胞系（株）的建立，细胞的纯化、细胞的长期保存以及冻存细胞的复苏，细胞培养的形态结构和生长特性的观察和测定，细胞 2006.9321、实验研究目的和要求动物细胞培养及细胞活性检测技术的模块实验目的是为了让学生们真正掌握细胞培养的基本实验操作方法和技能，通过对实验方案的设计开拓思路，培养学生的科研思维能力和实验动手能力，为今后的科研和进一步深造打下扎实的实验基础。要求学生们自己设计一套完整的实验，从细胞培养前的准备工作开始，到用自己培养出的细胞，按照自己设计的实验方案得到预期的实验结果为止，从头至尾独立动手操作实验过程，并允许和鼓励学生打破常规，自己提出实验新思路和方法。使学生在实践中不断发现问题、提出问题，同时培养学生寻找解决问题的能力。本实验以动物体外培养细胞为实验材料，细胞培养技术为主要手段，按设计的实验方案测试的实验结果为最终目的。整个实验过程必须掌握以下实验技术：细胞培养前的各项准备工作，如培养用器皿器具的清洗、包装、消毒和培养用液的配制、抽滤、灭菌等实验前的准备工作。动物细胞原代培养方法，包括细胞计数和细胞存活率计算方法。原代细胞或细胞株的传代培养的方法。动物细胞的冻存保种和细胞复苏的实验操作方法。各种生化与分子生物学的实验技术和方法，各种细胞5．干燥消毒锅6．Z氏滤器7．家用冰箱8．低温冰箱9．重蒸水装置10．倒置相差显微镜11．台式离心机(10ml,1ml)12．恒温水浴锅13．恒温磁力搅拌器烘箱14．电子称15．小天平16．酶标仪17．分光光度仪2．3实验用品培养皿、指管、滴管、离心管、培养瓶、100ml瓶子、橡皮塞、眼科剪、眼科镊、大镊子、96孔、24孔培养板、抽滤器、微孔滤膜、血球计数板、载玻片、盖玻片、试管、试管架、废液缸、新洁尔灭、洗洁精、酒精灯、滴管橡皮头、冻存管、5ml注射器、微量加样器20ul、200ul、微量加样器1000ul、各种枪头、枪头盒、eppendorf管、eppendorf管架、肥皂、1000ml烧杯、500ml烧杯、100ml烧杯、1000ml量筒、500ml量筒、100ml量筒、磁力转子、不锈钢滤网、无菌帽、无菌口罩、药棉等。2．4实验药品硫酸、重铬酸钾、NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4·2H2O、NaHCO3、胰蛋白酶、1640培养基、DMEM培养基、小牛血清、青霉素、链霉素、酒精棉球、碘酒棉球、台盼蓝、考马试亮蓝、DMSO（进口）、DMSO（分析纯）、甘油、MTT、聚乙二醇（PEG）、氢氧化钠、甘氨酸、氯化钠、盐酸、2,4-二硝基苯肼、乳酸钠、辅酶Ⅰ、丙酮酸钠、酒精、碘酒等。333、实验研究内容流程图实验准备（器皿、用具、药品） 细胞原代培养细胞传代培养用自己培养的一种细胞设计一个实验证明某一因素或药品对该细胞有损伤或保护作用传代细胞的冻存冻存后细胞的复苏培养细胞的受损情况观察和各项生化指标检测实验结果分析讨论 344、思考题（1）谈谈组织细胞培养前准备工作的重要性。（2）为什么清洗瓶皿时冲洗的次数要到位，否则有什么危害？（3）抗生素能杀灭细菌吗？为什么？（4）如何根据培养物品的质地和培养环境，选择不同的消毒方法？（5）配液时为什么药品要按顺序溶解，否则会产生什么结果？（6）在细胞培养操作过程中，你如何加强无菌操作的观念避免污染？（7）细胞计数时怎样防止盖玻片内产生气泡？怎样才能记数准确？（8）台盼蓝染色２小时后再观察和计算活细胞的存活率还正确吗？为什么？（9）组织块培养时，翻转培养瓶的时间不易过长，为什么？（10）组织块培养时，如组织块剪得太大或太小，对细胞培养有什么影响？（11）细胞传代与细胞世代有什么区别？（12）为什么加入培养液后，即可终止胰蛋白酶的消化作用？（13）细胞冻存时为什么要掌握缓冻速融的原则？（14）请计算一下5～10个视野内的细胞融合率。（15）以空白对照为100%，计算原代细胞和传代细胞的存活率。（16）你用什么药物来损伤细胞，再用什么方法证明细胞受损了，谈一谈你的实验设计思路。（17）你用什么药物来作用细胞，细胞的形态、结构和功能发生了哪些变化？你用什么方法来检测？（18）统计分析实验结果并说明本次实验成功或失败的原因。（19）本实验的收获以及本模块实验尚需改进的地方。35附录一实验器械、器皿的清洗和消毒一、实验目的掌握细胞培养所需器械、器皿的清洗和消毒方法。二、实验用品1、玻璃器皿：移液管、指管、离心管、培养瓶、100ml玻璃瓶、250ml玻璃瓶、培养皿、大橡皮塞、培养瓶盖、过滤器。2、实验器械：眼科剪、眼科镊。3、仪器：超净工作台、干燥箱、高压锅、烘箱。4、试剂：75%酒精、1‰新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸。三、实验方法（一）清洗1．玻璃器皿的清洗组织细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求透明、无污迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅残留百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此清洗质量的好坏直接影响到细胞培养成功与否，必须严格按照清洗的程序进行，以保证达到清洗的目的。一般玻璃器皿清洗的程序包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。（1）浸泡初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或溶解，培养后的玻璃器皿往往粘有大量蛋白质，干燥后不易刷洗掉，故用后立即浸入清水中，注意让水完全进入瓶皿中，不应留有气泡。新的玻璃器皿表面常附着灰尘，同时在生产过程中，玻璃表面常呈碱性并带有一些对细胞有毒的物质，如铅和砷等。新瓶皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸溶液（5%）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。（2）刷洗浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以去除器皿表面附着较牢的杂质。刷洗玻璃器皿易用软毛刷和优质洗涤剂（如高级洗衣粉和洗洁精），绝对不能使用含沙粒的去污粉，注意特别要刷洗瓶角部位。（3） 浸酸刷洗不掉的微量杂质经过浓硫酸和重铬酸钾清洁液的强氧化作用后，可被除掉，而且对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成。浸泡时，器皿要充满清洁液，勿留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。36清洁液一般可配制三种强度，配方如下：[强液]重铬酸钾浓硫酸蒸馏水[次强液]重铬酸钾浓硫酸蒸馏水[弱液]重铬酸钾浓硫酸蒸馏水63g1000ml200ml120g200ml1000ml100g100ml1000ml配制清洁液时，应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙。注意保护好面部和身体裸露部分。配制过程中，可使重铬酸钾溶于水中（有时不能完全溶解，可加热溶解重铬酸钾）。待重铬酸钾溶液冷却后，慢慢加入浓硫酸（工业用酸即可）。注意！只能将浓硫酸缓慢加入水溶液中，若注入过急产热量大，易发生危险，切忌反向操作，以免浓硫酸溅出伤人。配制容器应用陶瓷或耐酸塑料制品。配成后的清洁液呈棕红色，经长时间使用后，因有机溶剂和水分增多渐变成绿色，表明已失效，应重新配制。旧清洁液仍有腐蚀作用，严禁乱倒，宜深埋土中。（4）冲洗刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。冲洗宜用洗涤装置，以保证冲洗效果，省时省力，亦可用手工操作，但每瓶都得用水灌满，倒掉，重复十五次以上，最后再用蒸馏水漂洗2～3次，凉干备用。2．橡胶制品的清洗组织细胞培养中所用橡胶制品主要是橡胶塞、圈以及滴管头等。新购置的橡胶制品带有大量滑石粉应先用自来水冲洗干净后，再作常规清洗处理。常规处理方法是：每次使用后的橡胶制品都要置入水中浸泡，以便集中处理和避免附着物干涸，然后用2%NaOH液煮沸10～20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水各冲洗2～3次，凉干备用。3．塑料制品的清洗目前组织细胞培养使用的塑料器皿主要是进口的，是一种经过消毒灭菌密封包装的商品。用时，打开包装即可，是一次性使用物品。必要时，用后经过无菌处理后，尚可反复使用2～3次，但不宜过多。再用时仍然需要清洗和灭菌处理。塑料器皿质地软，使用后应即刻浸入水中严防附着物干涸，不宜用毛刷刷洗，以防划痕出现，如残留有附着物可用脱脂棉轻轻擦拭，用流水冲洗干净，晾干，再用2%NaOH液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，然后用5%盐酸溶液浸泡30分钟，随后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水漂洗5～6次，晾干后备 37用。4．金属器具的清洗组织细胞培养所用金属器具主要是一些手术刀、剪、镊子、针等，这些器具使用后应立即用酒精擦洗干净，晾干后备用。（二）包装包装的目的是防止器皿器具消毒灭菌后再次遭受污染，所以这些培养用品在消毒处理前要经严格的包装。清洗后的器皿可先放入鼓风干燥箱中烘干（塑料和橡胶制品不能放入干燥箱！），或置于通风无尘处自然晾干，然后包装起来，再做消毒处理。包装后的器皿应便于消毒和储存。包装材料常用不印字的皱纹纸、牛皮纸、硫酸纸、脱脂棉、棉布和鞋底线等，包装后的培养用品装入铝饭盒或不锈钢饭盒及金属制的消毒筒内（长度能容纳移液管）。1．局部包装较大的瓶皿、滤器、消毒筒等只需把瓶口部分用硫酸纸包裹后，再罩以牛皮纸或棉布密包起来用鞋底线扎紧即可。2．全包装比较小的培养皿、注射器、金属器具和橡胶塞等，需采用全包装，即用牛皮纸全部包起来后装入金属盒或筒，盖上盖子再用牛皮纸包扎起来。用笔写上盒内所装物品的名称、数量、日期等。移液管包装时要用脱脂棉将接胶头处堵塞，松紧适宜，然后装入筒中，筒底要垫软纸或棉花以防移液管装入时折断管尖。最后将筒口用纸包起用线扎紧即可。（三）器皿器具及环境的消毒对组织细胞培养实验最危险的是发生包括细菌、真菌和病毒等微生物的污染。它们都能直接影响实验结果。污染主要是由于操作者的疏忽而引起的，如操作台表面或周围空气不洁、培养器皿器具和培养液消毒灭菌不彻底或存放过久等。有时一两个培养物发生污染，可能累及整个实验室，不得不防。因而，组织细胞培养的每个环节都应采取严格的消毒措施，以防止发生污染。消毒灭菌方法因物品材质及环境的不同而异。消毒方法分为三类：即物理消毒法、化学消毒法和抗生素抑菌法。1．物理消毒法（1）湿热消毒：即高压蒸汽消毒，实验室一般采用手提式高压灭菌锅消毒，是最有效的方法之一。适合于玻璃器皿、金属器具、橡胶制品、布质类以及耐热的无机离子平衡液等的消毒。其方法是先将消毒锅洗净，放入适量的水（水面必须盖过电热管，以防电热管干裂！）。然后将所需消毒的物品放入消毒锅，消毒物品不能装的太满，以保证消毒器内气体的流通，消毒瓶装液体时，橡皮塞与瓶口之间要加一根通气线，防止瓶内气体受压将瓶塞蹦出。加上消毒锅盖，拧紧螺栓防止漏气。在加热升压之前，先要打开排气阀门，排出残留在锅内的冷空气，因此，导气管一定要插到锅底并不能堵塞。关闭排气阀门，继而开始升压，当达到所需的压力时，通过调节火力大小，使压力稳定在所需数值后开始计算时间。灭菌后不要立即38打开气阀放气以免水气喷出。要让其自然降温降压至0磅，才能打开气阀。消毒过程中，消毒者不能离开岗位，要经常检查压力是否恒定，如有偏离应及时调整。一般消毒锅都装有安全阀门，还是以不超安全限为好，以免影响消毒物品化学性质和发生其他意外。各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品8磅30分钟布类、玻璃器皿、金属器具等15磅20分钟（2）干热消毒：实验室一般采用干燥箱进行，适用于玻璃器皿的干燥消毒，由于干热传导慢，因此需要升温到160℃ 和保持90～120分钟，才能杀死细菌芽孢，达到消毒目的。消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。（3）过滤消毒：大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等，在高温下会发生变性，失去其生物学功能，必须采用过滤法除菌。实验室一般主要采用Zeiss滤器。Zeiss滤器为不锈钢结构，中间可夹一层纤维滤板或滤膜，纤维滤板现已很少使用，多用由纤维素制成的微孔滤膜，质地均匀，有0.60um、0.45um和0.22um等几种规格，常用孔径0.22um滤膜过滤一般培养用液而除菌。注意：过滤器必须经过湿热消毒，操作过程中，必须将过滤器放在超净工作台上进行，以免发生污染。（4）紫外线消毒：紫外线直接法很方便，效果好，是实验室常用的消毒法，适用于消毒空气、操作台表面和一些不能使用其它方法进行消毒的培养器具（如少量的塑料培养皿、培养板等）培养室的紫外线灯应距地面2.5米，使得每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，才能发生有效的消毒作用。消毒时物品要相互分开，避免遮挡紫外线的照射。注意：由于紫外线照射时会产生臭氧以及对细胞、培养液、包括人体都有一定的损伤作用，因此不要一边照射一边操作，以免受伤。照射30分钟，可达灭菌效果。（5）熏蒸消毒：当遇到细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可以用高锰酸钾5—7.5克，加甲醛（40%）10—15毫升，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时，至少4小时以上。（6）煮沸消毒：它的优点是简便迅速，缺点是湿度大，消毒后物品不适于长时间保存，这种方法适宜于临时需要消毒的耐热物品，如金属器具和注射器等在水中煮沸20～30分钟，趁热倒去水分即可使用。但金属器具煮沸后宜马上使用，以防器具生锈。2．化学消毒法化学消毒剂，包括新洁尔灭、来苏儿、过氧乙酸和酒精等。主要适用于那些无法用其它方法消毒的物品，如操作者的皮肤、操作台面及无菌室内的桌椅、墙壁和空气等（可于紫外线配合消毒，互相取长补短）。实验室最常用的化学消毒剂是0.1%新洁尔灭和70%的酒精，这些消毒剂对皮肤和细胞毒性小，尤其对那些瓶皿开口部位的消毒，效果很好。过氧乙酸是新近推出的一种消毒剂，消毒能力极强，在0.5%浓度，10分钟即可将芽孢杀灭，可以用作各种物品的表面消毒，使用时需用水稀释后用喷洒和擦拭的方法消毒。3．抗生素消毒法39抗生素消毒作用主要是抑制液体细胞培养用液的配制一、实验目的熟练掌握各种细胞培养用液的配制方法。二、实验材料与器具RPMI1640、DMEM、NaHCO3、胰蛋白酶液、D-Hanks液、100ml量筒、1000ml量筒、100ml烧杯、1000ml烧杯、小牛血清、双蒸水、三蒸水等。三、实验方法（一）D-Hanks液配制先配D-Hanks原液NaCl8.0g0.06g0.4g0.06g100mlNa2HPO4·2H2OKClKH2PO4蒸馏水配制时，按配方顺序逐一用水彻底溶解，必须在前一药品完全溶解之后，才能加入下一种药品，原液暂时不用可置4℃冰箱保存。再配D-Hanks使用液D-Hanks原液10ml蒸馏水90ml加5%NaHCO3，调整PH值至7.2。将配好的D-Hanks使用液，分装，包扎瓶口，经8磅30分钟或10磅15分钟灭菌后，置4℃ 冰箱备用。使用前加双抗于D-Hanks使用液中浓度为1%。（二）0.25%胰蛋白酶液配制胰蛋白酶0.25gD-Hanks使用液100ml先用少量D-Hanks液把胰蛋白酶粉末调成糊状，再加D-Hanks液溶解，用5%NaHCO3调pH至7.6～7.8，用D-Hanks液定容至100ml。过滤除菌，分装小瓶，置冰箱中-18℃冰冻保存。40（三）RPMI1640培养基配制将干粉型RPMI1640培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用1/3水冲洗包装5g蒸馏水100mlNaHCO3溶于水后，分装，瓶口盖紧橡皮塞，包纸并用线扎紧瓶口，以防高压过程中NaHCO3溶液喷出瓶口，经8磅30分钟高压灭菌后置4℃冰箱保存备用。（七）双抗溶液配制1.青霉素1瓶（80万单位）加4ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。2.链霉素1瓶（100万单位）加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。取1和2溶液各0.5ml混合，加入9ml灭菌的D-Hanks液，则成含青、链霉素各1万单位/ml，分装后置4℃冰箱保存备用。附录三动物细胞原代培养技术一、实验目的掌握动物细胞原代培养的基本方法和培养过程，熟悉消化法培养和组织块培养法的基本操作要求，掌握细胞无菌培养的操作技术。二、实验用品眼科剪、眼科镊、培养皿、指管、滴管、离心管、培养瓶、橡皮塞等以及10%小牛血清的RPMI1640培养液、D-Hanks液、0.25%胰蛋白酶液、75%酒精棉球、碘酒棉球、0.4%的台盼蓝染液。显微镜、离心机、水浴锅、天平、废液缸等。41胎鼠或新生鼠三、实验方法（一） 消化法培养的基本操作1．操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，手和临时带进无菌室的物品、工具等均用1%0新洁尔灭浸泡消毒2分钟。2．将胎鼠或新生鼠处死，然后用75%酒精浸泡消毒，迅速进入无菌室。3．将胎鼠或新生鼠置超净工作台上，使其背部朝上，用碘酒棉球擦洗背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。4．在腰部的后缘，用解剖镊提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，用镊子将剪开的皮肤拉向两侧。用解剖剪剪开背部的肌肉，此时，即可见蚕豆状的肾脏，用镊子取出肾脏，放于无菌的已加入D-hanks液的培养皿中。5．用D-hanks液洗涤肾脏，将肾外膜剪破，去肾外膜及脂肪，剪去肾盂部分，用D-hanks液洗涤肾脏，将洗过的肾脏转移至另一无菌培养皿中，用眼科剪将肾脏剪成1mm3的小块，组织块的大小要尽量一致。再用无菌D-hanks液漂洗二次，直到液体澄清。6．将清洗过的D-hanks液吸掉，按组织块的体积的5-6倍量加入0.25%的胰蛋白酶溶液，将其吸入无菌的离心管中，置于37℃中进行消化。消化时间在30分钟左右。每隔5分钟摇动一次，以便组织块分散开，以利继续消化，直至组织块变的松散，颜色略发白为止。7．从水浴中取出离心管，将组织块连同胰蛋白酶液倒入一无菌培养皿中，加入一定量的含10%小牛血清的培养基，用吸管反复吹打，直到大部分组织块均分散成细胞悬液为止。8．然后用吸管小心吸取悬液入离心管（注意不要吸入组织块），1000rpm离心5分钟。弃去上清液，在离心管中加入一定量的培养液，打匀后吸取少量的细胞悬液进行稀释（根据细胞悬液的浓度决定）、计数。9.取一副血球计数板，进行细胞计数。悬液滴入计数室后，静止2～3分钟，待细胞在计数室中下沉后，再在低倍镜下观察计数。10.将细胞悬液用培养液稀释至5×105/ml的细胞浓度，每个培养瓶装4ml培养液，盖好橡皮塞，放入37℃培养箱中培养，直至细胞铺满。（二）组织块法培养的基本操作1．操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，手和临时带进无菌室的物品、工具等均用1%0新洁尔灭浸泡消毒五分钟。2．将胎鼠或新生鼠处死，然后用75%酒精浸泡消毒，迅速进入无菌室。3．将胎鼠或新生鼠置超净工作台上，使其腹部朝上，用碘酒棉球擦洗腹部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。4．用解剖镊提起腹部皮肤，用解剖剪剪开皮肤，用镊子将剪开的皮肤拉向两侧，剪开腹腔。42用解剖剪剪取肝脏一片，放于无菌的已加入D-hanks液的培养皿中。5．用D-hanks液洗涤肝脏三次，用眼科剪将肝脏剪成1mm3的小块，组织块的大小要尽量一致。再用无菌D-hanks液漂洗三次。6．头镊子将组织块移入培养瓶中，并均匀地分布在培养瓶动物细胞的传代培养一、实验目的了解和掌握动物细胞传代培养的基本方法和基本操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状态。二、实验用品滴管、指管、培养瓶、橡皮头、橡皮塞、酒精棉球、酒精灯、显微镜、RPMI1640培养液、D-Hanks液、0.25%胰蛋白酶液、肿瘤细胞。三、实验方法1．在传代前，首先将培养瓶置相差显微镜下，观察细胞是否已长成致密单层，如已长成致密单层，则可以进行细胞传代。2．先将培养液、胰酶、D-Hanks放在37℃ 水浴中，然后用1%0新洁尔灭浸泡消毒，再进入无菌室。3．取将传代的细胞，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶1ml，置室温下作用2～3分钟后翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，待细胞层出现缝隙，（空隙）时，即可停止消化。如未出现缝隙，可再将瓶翻回，让消化液继续浸泡几分钟（消化时间长短与细胞种类、生长情况有关）之后再翻转培养瓶，直至出现缝隙，然后倒去消化液。也可以在显微镜下43观察，当单层细胞变成圆形时，立即停止消化，慢慢弃去消化液。4．加入3～4ml培养液，即可终止剩余消化液中胰蛋白酶的消化作用，用滴管轻轻将瓶壁上细胞吹打下来，打匀后分装2个培养瓶。5．补加培养液，使每瓶中培养液仍为3～5ml。置37℃恒温箱中继续培养。注意事项：1．实验之前将实验中用到的培养液及其他溶液先于37℃温育一段时间。2．向培养有细胞的培养瓶中加入液体时，一般沿着生长细胞的对面瓶壁注入,然后慢慢转动培养瓶。3．操作过程中要尽量轻拿轻放。4．酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。附录五培养细胞的冻存与复苏一、实验目的掌握细胞冻存与复苏的基本原理、方法和要领，熟练进行细胞冻存与复苏的操作。二、实验用品低温冰箱、水浴锅、1ml塑料冻存管、eppendorf管、吸头、吸头盒、离心管、酒精灯、滴管等。培养液、胰酶、冻存液、培养的细胞。三、实验方法（一）细胞冻存1．选对数增生期细胞，在收集细胞24h前换液一次。2．按传代方法把培养细胞制备成悬液，收集到离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清液。3．沉淀加冻存液，吹打均匀，计数，调整至5×106个细胞/ml左右。4．将悬液分至冻存管中，每管1ml。5．将冻存管空封严，贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。6．按下列顺序降温：室温4℃冰箱（20-20℃冰箱（30-80℃冰箱冻存（或液氮中）（二）细胞复苏1．从低温冰箱或液氮中取出塑料冻存管。2．迅速放入37℃ 水浴中，并不断摇动，使其急速融化，30s～1min内完成。443．冻存管用70%酒精棉球擦拭消毒后，打开上盖，用吸管将细胞悬液吸到离心管中。4.低速离心（1000r/min）10min，去上清液。后再用培养液洗一次。5．沉淀加10毫升培养液，吹打均匀后再离心10min，弃上清液。6．加适量培养基后将细胞转移至培养瓶中，置37℃恒温箱中培养，第二天观察细胞生长情况。注意事项：1.实验过程中掌握慢冻快融的原则。附录六细胞计数一、实验目的掌握细胞计数的方法和操作要领。二、实验用品血球计数板、载玻片、盖玻片、吸管、试管架、eppendorf管、吸头、吸头盒、普通显微镜、细胞悬液。三、实验方法1.取一副血球计数板，将计数板载玻片、盖玻片洗干净，擦干。将盖玻片盖在计数板上。2.取移液管一支，伸入培养瓶中，轻轻用移液管将细胞悬液混匀（反复吸放移液管橡胶头），然后吸取少量悬液滴一滴于盖玻片与计数板载玻片的边缘上，利用溶液的虹吸现象，使其自动流入计数室细胞数----------------------×104=---------4ml悬液每人至少重复计数2～3次，取其平均数。如细胞原液经过稀释，则稀释液的细胞数乘以稀释倍数，即为细胞原液的细胞数。45附录七细胞成活率测定一、实验目的掌握测定细胞活力的方法。二、实验器具血球计数板、载玻片、盖玻片、吸管、试管架、eppendorf管、吸头、吸头盒、普通显微镜、细胞悬液、0.4%台盼蓝。三、实验方法一般难以从外形上将死细胞与活细胞区别开来，但是可以通过细胞对色素的吸附性来判断细胞的死活。常用的染料是台盼蓝、苯胺黑等。台盼蓝可以通过死细胞膜而使死细胞着色。活细胞一般不易着色，但若染色时间过长，活细胞亦可能因受损而着色，所以染色后要及时观察。1．将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2．加入0.5ml 0.4%台盼蓝染液，染色2-3分钟。3．吸取少许悬液涂于载玻片上，盖上盖玻片。4．在低倍镜下观察细胞着色情况，任意取几个视野分别计数死细胞和活细胞数。5.计算细胞成活率：在低倍镜下任意数100个以上细胞，按以下公式计算：细胞总数-死细胞数细胞成活率=----------------------×100%细胞总数附录八MTT法检测细胞相对数和相对活力一、实验原理MTT比色法是一种检测细胞存活率和增殖率的方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，其颜色深浅与酶活力成正比，所以测定570nm波长的O.D值可以反映琥珀酸脱氢酶活力高低，间接反映活细胞数量多少。二、实验目的了解并掌握MTT法的基本原理及基本过程。三、实验器具4696孔细胞培养板、微量加样器、吸头、吸头盒、酶联免疫检测仪、显微镜、细胞计数板等。四、实验方法1.细胞接种:将处于对数生长期的细胞用培养基制成2×105细胞/ml的悬液，用微量加样器接种于96孔板中,每孔100ul,边缘孔中不加细胞，仅加培养基作为无细胞空白。37℃培养箱中培养，使细胞贴壁。2.加药:弃去培养掖，于相应实验孔中加不同浓度的药物，每孔100ul，留数孔不加药，而加入等体积培养液作空白对照，继续培养24h。3.加MTT:弃培养液，每孔中加入200ulD-Hanks洗一次，每孔再加入100ulMTT(1mg/ml)，37oC继续培养4小时。4.洗板:吸去MTT，每孔中加入200ulD-Hanks洗一次,最后吸干孔细胞生长曲线的测定一、实验目的掌握测定细胞生长曲线的方法。二、实验器具24孔细胞培养板、微量加样器、eppendorf管、吸头、吸头盒、显微镜、细胞计数板、载玻片、盖玻片、吸管、试管架、普通显微镜、细胞悬液、0.4%台盼蓝。三、实验方法1.培养细胞：首先在24孔细胞培养板内分别接种相同数量的细胞，计数并记录接种的细胞悬液密度，接种时间记为0小时。2.计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24小时计数3孔的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次，如此操作至第七天结束。3. 绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。47附录十乳酸脱氢酶（LDH）的含量测定方法一、实验原理细胞012345678910丙酮酸标准液00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50乳酸钠缓冲液1.00.950.900.850.800.750.700.650.600.550.50蒸馏水0.30.30.30.30.30.30.30.30.30.30.32,4-二硝基苯肼1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0相当于LDH活力02505007501000125015001750200022502500各管混匀，置37℃水浴15min，加0.4MNaOH10ml，室温静置15min，440nm波长比48色，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度减"0"号管吸光度，所得差值与对应的卡门氏酶活力单位作图。样品测定如下：管号对照样品样品0.2ml0.2ml乳酸钠缓冲液1.0ml1.0ml37℃3min双蒸水0.2ml0辅酶Ⅰ00.2ml37℃15min2,4-二硝基苯肼1.0ml1.0ml37℃15min0.4MNaOH10ml10ml室温静置5min，440nm比色，以蒸馏水为空白对照。附录十一 细胞丙二醛(MDA)含量的微量测定一、实验原理丙二醛（MDA）是膜脂质过氧化作用的终产物，MDA的含量可以反映膜脂的过氧化程度，进而得知细胞受自由基（OFR）损伤的程度。细胞或细胞膜在稀硫酸酸性条件下用磷钨酸沉淀，脂质过氧化物也随之沉淀。在醋酸酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应（95oC），产物被正丁醇提取，该产物在激发波长为515nm，发射波长为553nm处有特征荧光。二、实验目的了解并掌握丙二醛（MDA）的测定方法。三、实验材料24孔细胞培养板、微量加样器、分光光度仪、显微镜、细胞计数板等。四、实验方法1.将各组处理好的细胞消化下来，离心，细胞计数。取106细胞，加入M/12硫酸4ml，10%磷钨酸1ml，室温放置5min，离心(2500rpm,10min)。2.倒去上清液，在沉淀中加入4ml双蒸水和1mlTBA冰醋酸溶液，充分摇匀，同时做标准49物1.1.3.3.-四甲基丙烷（TMP）0.5nmol。3.悬液置95oC水浴中加热1小时。4.急冷至室温后加入5ml正丁醇，充分摇匀，离心(2500rpm,10min)。5.取上清液测其荧光强度f.LP=0.5×f/F×1000/100×100(nmol/百万细胞数)F为0.5nmol标准物（TMP）的荧光值。附录十二细胞超氧化物歧化酶（SOD）的测定一、实验原理超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）是机体超氧自由基的清除剂，广泛分布于细胞内和各种体液中。超氧自由基是由于氧代谢过程接收电子不足而形成的，对机体有毒性，与肿瘤、辐射、损伤、衰老，炎症等有重要关系，SOD能阻止并消除自由基的连锁反应，使机体免受损害。二、实验目的了解并掌握超氧化物歧化酶（SOD）的测定方法。三、实验材料24孔细胞培养板、微量加样器、分光光度仪、显微镜、细胞计数板等。四、实验方法1.相关溶液的配制（1）Tris-HCl溶液：准确称取3.0285g三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）、0.0058gEDTA溶于500mL蒸馏水中，并用HCl调pH至8.2。（2）0.06M邻苯三酚溶液：准确称取0.06M邻苯三酚溶于500mL10mM的HCl中。2.SOD的测定SOD的测定采用邻苯三酚自氧化速率（O.D420）法。测定设空白管、自氧化速率管各一。依表向自氧化速率管、空白管及样品管中顺序加样。邻苯三酚自氧化速率测定SOD活性50加样后在722分光光度计上420nm波长处比色，以空白管校正到零点，读出各管O.D值。3. SOD活力的计算以降低自氧化产物（420nm处O.D值）一半时的SOD量为一个活力单位，计算各样品管的SOD比活。A-B3.111SOD比活（U/mg蛋白）=×××A÷50%0.20.2蛋白浓度其中，A为自氧化速率管测定的O.D值，B为样品管测定的O.D值。附录十三细胞膜通透性检测一、实验目的了解并学习细胞膜通透性检测的实验方法。二、实验材料24孔细胞培养板、微量加样器、显微镜、细胞计数板、流式细胞仪等。三、实验方法1.制作细胞悬液：（1）取培养药物处理过的细胞，用PBS冲洗2次。（2）0.25%的胰酶消化，终止消化后用1500r/min离心5min。2.荧光标记物标记：（1）用含10%胎牛血清培养液重新制作细胞悬液并培养细胞3h后，重新制作细胞悬液，加入24孔培养板内，细胞数1×105孔。（2）每孔加入荧光标记物FD50050ul(25mg/ml)。3.细胞膜通透性检测：（1）各组细胞移入培养箱内再培养4h后，每组各抽取5孔样本，经3次PBS洗涤以除51去细胞外FD500。（2）用流式细胞仪检测荧光染色阳性的细胞(FD500进入细胞蛋白含量标准曲线的绘制和蛋白含量的测定一、实验原理考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸收，其光吸收值与蛋白含量呈正相关关系。以牛血清白蛋白(BSA)为标准品配制浓度梯度标准液，用考马斯亮蓝G-250法进行蛋白含量的测定，作标准曲线。然后依据标准曲线推算样品中蛋白质含量。二、实验目的了解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白含量的方法。三、实验材料24孔细胞培养板、微量加样器、分光光度仪、显微镜、细胞计数板等。四、实验方法1.相关溶液的配制（1）考马斯亮蓝G250工作液：取100mg考马斯亮蓝G250溶于95%乙醇中，再加入100mL85%磷酸溶液，用双蒸水定容至200mL。滤纸过滤并将滤液稀释5倍即为工作液。（2）BSA标准液：准确称取300μgBSA溶于3mLpH=8.0的D-Hank’ s液中，配成100μg/mLBSA标准液。2.蛋白含量标准曲线的绘制蛋白含量标准曲线的绘制混匀室温静置5min后在722分光光度计上595nm波长处比色，以pH=8.0的D-Hank’s液校正到零点，读出各管O.D值，并绘制蛋白含量标准曲线。523.蛋白含量的测定（1）培养细胞在24孔板，用胰蛋白酶消化，分散培养板中细胞，悬浮于PBS中，计细胞数。（2）以1000rpm离心5min，弃上清液。（3）破碎细胞。（4）取细胞破碎液100ul加900ulpH=8.0的D-Hank’s液，再加2mL考马斯亮蓝G250工作液，混匀室温静置5min后在722分光光度计上595nm波长处比色，以pH=8.0的D-Hank’s液校正到零点，读出O.D值并在标准曲线上查出蛋白含量。53第三部分发酵工程及分离提取技术高红亮常忠义贾彩凤编目录前言………………………………………………………………………………………………551.相关基础知识………………………………………………………………………………...561.1培养基的制备………………………………………………………………………………561.2灭菌……………………………………………………………………………………….561.3微生物的接种方法………………………………………………………………………581.4酶的分离提取技术……………………………………………………………………….591.5实验背景介绍…………………………………………………………………………….602.实验目的和要求…………………………………………………………………………….613.实验材料和仪器…………………………………………………………………………….613.1实验材料 ………………………………………………………………………………….613.2主要仪器设备…………………………………………………………………………….613.3试剂……………………………………………………………………………………….624.实验方法与流程图………………………………………………………………………….634.1实验方法与步骤………………………………………………………………………….634.2实验流程图……………………………………………………………………………….645.注意事项…………………………………………………………………………………….…655.1发酵罐使用的注意事项………………………………………………………………….…655.2谷氨酰胺转胺酶(MTGase)沉淀分离和冷冻干燥的注意事项…………………………656.关键词……………………………………………………………………………………….…667.问题讨论…………………………………………………………………………………….…668.参考文献…………………………………………………………………………………….…669.实验结论和报告…………………………………………………………………………….…67附录一.微生物发酵系统简介……………………………………………………………….…68附录二3,5－二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖………………………………….…72附录三Folin－酚法测定蛋白质含量……………………………………………………….…73附录四微生物谷氨酰胺转氨酶(MTGase)的活性测定………………………………………74附录五SYNDER—UF101型超滤使用说明书…………………………………………….…76附录六10L不锈钢发酵罐BIOF的使用说明书……………………………………………78附录七GBJS-10B玻璃发酵罐的使用说明书…………………………………………………8754前言发酵工程是一门以生物代谢过程和对代谢过程控制，获得生物产品共性原理为研究对象的学科。探讨生物产品生产过程中的共性为目的，从工艺角度阐明细胞的生长和代谢产物与细胞的培养条件之间的相互关系，为生产过程的优化提供理论依据。发酵工程及下游分离提取技术是一门应用性和强的技术，主要通过对发酵罐的认识和操作，掌握应用发酵罐的基本技术。生物产品的分离提取一直是生物工程行业最为重要的技术之一，本课程通过对酶的分离提取学习生物产品一般的分离提取工艺。本实验课程2006.9551.相关基础知识1.1 培养基的制备培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围不能有任何杂菌，因此，对所用器材、培养基要进行严格灭菌，对工作场所进行消毒，以保证工作顺利进行。1.2.1灭菌方法介绍消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。㈠加热法加热法又分干热灭菌和湿热灭菌两类。1．干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气160℃-170℃下保56温2小时进行灭菌。2湿热灭菌⑴高压蒸汽灭菌法此法是将物品放在高压蒸汽灭菌锅有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌。该器底层盛水，顶部插有温度计，加热后水蒸汽温度达到100℃时，即循环流于器注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10-15分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。㈡过滤灭菌许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。蔡氏过滤器是用银或铝等金属做成的，分为上、下两节、过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。滤膜过滤器的结构与蔡氏过滤器相似，只是滤膜是一种多孔纤维素(乙酸纤维素或硝酸纤维素)，孔径一般为0.45mm，过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的滤膜。㈢ 紫外线灭菌紫外线波长在200-300nm，具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。㈣化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的有2%煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3-5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等。1.2.2实验室常用灭菌方法㈠干热灭菌用干燥热空气(170℃)杀死微生物的方法称干热灭菌。玻璃器皿(如吸管、平板等)、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。培养基、橡胶制品、57塑料制品等不能用干热灭菌法。㈡加压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：1．首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2．放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自立式、卧式和手提式等几种。本实验介绍手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。然下降，当6．将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。可待用。1.3微生物的接种方法微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及 58容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。1.4 酶的分离提取技术酶是蛋白质，因此凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的制备，如盐析法、聚乙二醇沉淀法、有机浴剂分级沉淀法、等电点法、选择性沉淀法、各种柱层析法（吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤）、各种电泳法及亲和层析等。不同之处是酶的纯化过程尚需选用迅速简便的活力测定方法，以追踪酶的去向。在选用酶的活力测定方法时，分析方法的迅速要比其精确度更为重要。如宁可要一个需时5min，准确度为5%的方法；也不要一个需时30min，准确度为0.5%的方法。在建立活力测定法之后，再根据各单元纯化步骤及活力分布情况用列表形式表达，表的内容包括：操作步骤、总体积、酶浓度（每毫升酶活力）、总活力、蛋白质浓度mg/ml）、比活力（即纯度、酶活力单位/毫克蛋白）、产率%（每步总活力除以第一步的总活力）和纯化倍数（每步比活力除以第一步比活力）。一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作，各单元操作如何串联，需靠实践摸索。每经过一个步骤一般可提高酶纯度2一3倍，总纯度可提高数千倍，而总产率常仅百分之几或十几。总的原则是选用最少的步骤而能取得最好的纯化效果、因为增加步骤势必增加酶的丢失。通常对于含盐浓度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用盐析法；对于低离子强度的酶溶液则可用吸附法或离子交换法。交替使用不同分级沉淀法常比单独重复同一类型方法更能奏效。所以常将吸附法、盐折法和有机溶剂分级沉淀法串联起来进行纯化。当这些方法仍达不到要求时，还可以采用一些包括电泳、层析法在内的其他类型纯化方法。当酶达到一定纯度时，便可以进行结晶，结晶也是纯化酶的有效手段之一。但应注意的是药用酶有些并不需要结晶。酶的第一次结晶纯度有时仍低于50％。酶的结晶通常可以在较纯的酶液中添加硫酸铵、氯化钠等盐达到一定饱和度，使酶慢慢结晶出来。此时必须控制温度和pH值。盐浓度要逐渐提高，添加速度要慢，才能得到较好的结晶。有时在低温下，用丙酮、乙醇等有机溶剂进行结晶。近年来采用平衡透析法，即将酶液装人透析袋中，置于一定饱和度的盐溶液中进行透折，这种操作可以获得大量结晶。在本次实验中，我们用到离心、超滤浓缩、有机溶剂沉淀、冷冻干燥等分离提取技术得到粗酶制剂。离心是利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩和提纯的一项操作。超滤浓缩是最近几年来迅速发展起来的分子级薄膜分离技术，它以特殊的超滤薄膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性的分离。它的优点是没有相的移动，无须添加任何强烈化学物质，可以在低温下进行，过滤速度较快，操作简便，可以避免生物活性物质的活力损失和变性。59有机溶剂沉淀作用主要是降低水溶液的介电常数从而使溶液中的蛋白质溶解度降低，使大分子物质脱水而相互凝聚析出。有机溶剂它能对许多能溶于水的小分子生化物质以及蛋白质等大分子物质都能发生作用。一般而言，不同溶质的沉淀要求不同浓度的有机溶剂。冷冻干燥又称升华干燥，是使湿物料从冻结状态下除去水分，并且其中水分不经过液体直接升华成气体而脱水干燥的过程。它具有被干燥材料结构变化小，干燥温度较低等特点，因此适宜对热不稳定的物质如酶的干燥保藏。酶的制备一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和结晶（或制剂）。首先将所需要的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地要夹带着一些杂质，而后再将酶从溶液中选择地分离出来，或者从酶溶液中选择地除去杂质，最后制成纯净的酶制剂。1.5实验背景介绍本发酵实验所用的实验菌种是轮枝链霉菌（Streptoverticilliummobaraense），经过发酵生产谷氨酰胺转胺酶。谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶,它可催化在蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的C2羧酰胺基和伯胺之间的氨酰基转移反应(图1a)。利用该反应可以将赖氨酸引入蛋白质来改善蛋白质的营养特性。当蛋白质中的赖氨酸残基的g氨基作为酰基受体时,蛋白质在分子2+HOHOTGasec谷氨酰胺转胺酶能改变食品蛋白质的功能性质主要由于：1)它可改变酪蛋白、肌球蛋白和b-乳球蛋白等蛋白质的物理特性；2)利用其催化作用可将各种必需氨基酸以共价键形式与各食品蛋白质结合，以弥补加工过程中所流失或破坏之必需氨酸而提高食品蛋白质的营养价值；3)不同蛋白质也可通过该酶作用结合成一大分子，其物理特性与同种蛋白质分子结合体a酰基转移反应b蛋白质的Gln残基和Lys残基之间的交联反应c脱氨基化反应图1TGase催化的反应60类似，可作为开发新蛋白食品的方法，如：各种人造肉、仿蟹肉等的开发；4)在低蛋白浓度下，该酶作用所产生的聚合体可溶于水，但在高浓度下，该酶作用有助于胶体的形成。利用此原理，可用于各种食品蛋白薄膜的制造，所制得的薄膜具有高拉力强度、且不溶于水及其它溶剂。1989年日本味之素公司从土壤中筛选到一株命名为StreptoverticillumS28112的菌株,它可产生胞外谷氨酰胺转胺酶。1993年味之素公司开发了以谷氨酰胺转胺酶为主体的食品用酶制剂TG-K、TG-S和TG-B三个品种,将其投放市场。TG-K酶制剂1g约含100单位酶活力,在鱼糕和鱼丸等水产品中用量为0105%～2%,就可提高水产制品的弹性;TG-S酶制剂和TG-K酶制剂含相同的酶活力,在火腿中的添加量为011%～014%,就可提高火腿的弹性;TG-B酶制剂1g约含60单位酶活力,在猪肉和鱼肉中添加1%就能使碎肉粘成整块肉。2.实验目的和要求（1）了解和掌握谷胺酰胺转胺酶的生产工艺；（2）了解发酵生产中几种培养基：斜面菌种保藏培养基，种子培养基，发酵培养基的配置和不同。熟悉无菌操作的要求，初步掌握无菌操作技术；（3）掌握10L小型发酵罐各部分的结构和功能。了解微生物发酵罐培养的具体操作过程，掌握发酵罐的管路灭菌和空罐灭菌以及发酵罐加入培养基后实罐消毒的方法；（4）掌握微生物发酵罐培养的方法以及在发酵过程中的各种控制方法；（5）利用监测发酵液中还原糖和蛋白质的含量，了解微生物对主要底物的利用情况。根据菌体浓度，了解发酵过程；（6） 掌握蛋白质物质的离心、超滤浓缩、有机溶剂沉淀、冷冻干燥等常用工业制备技术的原理和操作方法；（7）掌握比酶活和收率的概念，初步掌握对酶提取工艺的评价。3.实验材料和仪器3.1实验材料轮枝链霉菌（Streptoverticilliummobaraense）3.2主要仪器设备（1）GBJS-10系列机械搅拌玻璃发酵罐、BIOF-6000型生物发酵罐（2）SYNDER-UF101型超滤装置；SYNDER-UF101蠕动泵，配套超滤膜芯（分子量为10000Da）；抽滤瓶、漏斗（3）高速冷冻离心机61（4）真空冷冻干燥机（5）循环水真空泵（6）722型分光光度计（7）秒表（8）pH计（9）电热恒温水浴锅（10）圆口磨底烧瓶、回流冷凝器3.3试剂（1）孢子培养基是高氏一号培养基：可溶性淀粉：2%KNO3：0.1%NaCl：0.05%K2HPO4：0.05%MgSO4.7H2O：0.05%FeSO4.7H2O：0.001%琼脂1.5-2.0%pH7.4（2）种子培养基：甘油2%（质量体积比）蛋白胨：2.5%酵母膏：0.5%MgSO4.7H2O：0.2%K2PO4.3H2O：0.2%pH7.4注：发酵培养基视具体实验安排待定。（3）3,5－二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)：甲液——溶解6.9克结晶酚（苯酚）于15.2毫升10％氢氧化钠中，并稀释至69毫升，再此溶液中加入6.9克亚硫酸氢钠。乙液——称取255克酒石酸甲钠，加到300毫升10％氢氧化钠中，再加入880毫升1％3,5－二硝基水杨酸溶液。将甲液和乙液相混合即得黄色试剂，保存于棕色试剂瓶中，在室温下放置7－10天后使用。（4）0.1％葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，保存于冰箱备用。（5）微生物谷氨酰胺转氨酶(MTGase)的活性测定试剂：试剂A：0.2M的Tris-HCl（pH6.0），0.1M羟胺，0.1M的DTT，0.03M的CBZ-Gln-Gly试剂A：与试剂A相比，除了少了0.03M的CBZ-Gln-Gly外，其余的与试剂A相同。反应终止B液：含5%FeCl的TCA溶液。，624. 实验方法与流程图4.1实验方法与步骤4.1.1谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵按操作进行发酵罐的空消，配制发酵培养基进行实消，活化的轮枝链霉菌菌种以5～10％（v：v）的量接种，培养条件为：温度，30℃；罐压0.02～0.03MPa；搅拌转速为300rpm；pH7.0～7.5；通气量，0.06vvm。发酵过程中注意监测发酵罐的T、pH、溶氧等状态，每隔4h取样，测定发酵液的酶活、残糖含量和生物量。4.1.2生物量的测定取发酵液2ml于离心管中，再吸取4ml2mol/l的盐酸与之混匀后3000rpm离心20min，去上清在105℃烘箱中烘干至恒重，等冷却到室温再称重。4.1.3微生物发酵产物的分离纯化(一)用八层纱布过滤发酵液。(二)将滤液用循环水真空泵抽滤，注意整个抽滤装置的密封性，滤纸要大小适中。(三)用SYNDER-UF101型超滤装置对抽滤液进行超滤，使用前后用蒸馏水和NaOH清洗装置，操作过程中注意调节压力，滤出液通过多层复合的滤膜排出，收集浓缩液。按滤出液体体积记录浓缩倍数，并测定浓缩液的酶活和蛋白质含量。(四)将超滤液留下，用冷酒精沉淀，酒精的用量与超滤液的体积比选择几个不同的比值来沉淀，如1：0.5，1：1，1：1.2，1：1.5等。(五)放置一段时间后，冷冻离心（4000rpm）后弃上清，用50％（占沉淀的酶液体积量）的Tris-Hcl（pH6.0）洗下沉淀，取1ml沉淀液加入1ml缓冲液混合测酶活和蛋白质含量。其余各组沉淀液混合置于冰箱保存。(六)冷冻干燥1．沉淀液以1ml/瓶的量分装在干燥瓶中，预冻过夜。2.打开冷冻干燥机的制冷装置，等到干燥机的温度降到-50℃时再打开真空泵，抽真空约30分钟。3.将样品放入冷冻干燥机内，干燥瓶口一律朝上，并稍稍打开瓶盖，千万不能封死。4.调节冷冻干燥机抽吸处的真空阀至真空状态。5.冷冻24小时左右，等样品中的水分完全失去（可取出一干燥瓶轻轻敲打，若瓶中样品出现粉末或颗粒状，而且无任何粘性，可以确定冷冻干燥完成）。6.收集冷冻干燥的样品，封死干燥瓶口，置于干燥箱中保藏待用。7.取干燥的粗酶粉用1ml缓冲溶液（或蒸馏水）混合均匀，测定酶活和蛋白质含量。 634.2实验流程图斜面菌种菌种活化空气过滤器与管路消毒（选）发酵培养基的配制三角瓶种子扩大空罐消毒加入到发酵罐中实罐消毒接种纱布过滤滤纸过滤底物浓度（还原糖）测定超滤产物测定（蛋白质浓度酶活测定）生物量测定发酵罐清洗与检查 冷冻干燥酶活性检测5.注意事项5.1发酵罐使用的注意事项（1）必须确保所有单件设备能正常运行时使用本系统。（2）在空消或实消时必须将安全防护罩装上，以免因玻璃筒损伤，但未察觉，引起玻璃筒破坏，造成不必要的人员伤亡。（3）在过滤器消毒时，流经空气过滤器（金属滤芯）的蒸汽压力不得超过0.17MPa，否则过滤器芯会被损坏，失去过滤能力。（4）在操作过程中，罐压不得超过0.12MPa，防止引起设备的损坏。（5）注意：在空、实消升温过程中不要开控温仪开关，否则当上、下限设定值设定在培养温度时，冷却水会自动通冷却水，不仅会影响升温速度、浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，造成培养液的浪费。（6）在空、实消结束后冷却时，发酵罐谷氨酰胺转胺酶(MTGase)沉淀分离和冷冻干燥的注意事项（1）要注意在操作过程中的温度控制。因为我们的目标产物是一种酶，而酶是一种对温度相当敏感的生物活性大分子蛋白质。一般酶都有一个活性高的最适温度，一般65在4℃时，蛋白质物质活性都处于比较稳定的状态，所以我们在实验操作过程中，要注意温度的控制，最好使实验环境的温度在10℃左右，所以我们的所有实验操作都尽可能的在冷藏室在超滤和酒精沉淀过程中应注意什么事项，针对实验结果、数据有何分析？8.参考文献（1）微生物学实验沈萍等主编高等教育出版社（2）生物化学实验指导北京大学生物系高等教育出版社（3）微生物工程曹军卫主编科学出版社（4）生化生产工艺学梅乐和主编科学出版社（5）生物工艺学俞俊唐主编华东理工大学出版社（6）生化工程伦世仪主编化工出版社（7）生物化学实验原理和方法李建武主编 北京大学出版社669.实验结论和报告摘要Abstract1.前言2.材料与方法3.结果与分析4讨论参考文献一、谷氨酰胺转胺酶发酵批报罐批________接种时间____年____月_____日放罐时间____年____月_____日二、谷氨酰胺转胺酶纯化步骤评价指标67附录一微生物发酵系统简介发酵设备是微生物工程中最重要的设备之一，一个优良的培养装置应设计为具有严密的结构，良好的液体混合性能，高的传质和传热速率，以及可靠的检测及控制仪表，才能获得最大的生产效率。按发酵是否需要氧气把发酵设备分为好氧发酵罐和厌氧发酵罐。但是生产中实际应用的主要以好氧微生物发酵为主，所以好氧发酵罐的种类最多，研究最为透砌。一、厌氧发酵罐主要用于酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等的生产及固定化细胞发酵。装料系数可以达到0.8-0.9。罐体一般为立式圆锥形，用钢板或钢筋混凝土制成，盖及底为碟形或锥形，罐高一般为直径的1-1.5倍。二．好氧发酵罐好氧发酵罐通常采用通风和机械搅拌来增加氧的溶解速率，满足微生物的代谢和产物的积累。按能量输入的方式，将好氧发酵罐分成三类：内部机械搅拌型，外部液体搅拌型和空气喷射提升式发酵罐。①内部机械搅拌型发酵罐：有标准式发酵罐（机械搅拌发酵罐或通用式发酵罐），伍式发酵罐，机械搅拌自吸式发酵罐等几种类型。②外部液体搅拌型发酵罐：此类发酵罐是依靠外部循环泵来搅拌发酵液，或是在液体进入发酵罐处装有文丘里管，依靠液体的高速流动，吸入空气，使气液混合。③空气喷射提升式发酵罐：此类发酵罐是依靠压缩空气作为能量输入，使发酵液上下翻动混合。如高位塔式发酵罐和深井曝气污水处理罐。以下以机械搅拌发酵罐为例，介绍其主要结构部件及其主要功能：2.1 发酵罐的基本条件机械搅拌发酵罐也称标准式或通用式发酵罐，它是利用机械搅拌器的作用，使空气和发酵液充分混合，并溶解在发酵液中，以保证微生物的生长繁殖所需要的氧气。为了使发酵罐发挥最大的生产效率，发酵罐必须满足几个要求：①发酵罐必须能承受一定的压力。②发酵罐要有适宜的径高比。③发酵罐的搅拌通风设备能使气液成分混合，实现传质传热作用，保证微生物发酵过程中所需的溶解氧。④发酵罐应具有足够的冷却面积。⑤发酵罐内应尽量减少死角，避免藏污积垢，保证68灭菌彻底，防止染菌。⑥搅拌器的轴封要严密，减少泄露。2.2机械搅拌发酵罐的几何尺寸其几何尺寸如下：H/D=1.7∽4,d/D=1/2∽1/3,W/D=1/8∽1/12,B/D=0.8∽1.0,(s/d)2=1.5∽2.5,(s/d)3=1∽2式中：H-发酵罐筒身高度（m）；D-发酵罐通用型发酵罐的几何尺寸比例d式中：P为搅拌器的功率，n为搅拌器的转速，d为搅拌器的直径。3.3挡板作用：克服搅拌器运转时液体产生的涡流，将径向流动改为轴向流动，促使液体激烈翻动，69增加溶氧速率。全挡板条件：指在一定转速下再增加罐环形管式的分布装置以环径为搅拌器的0.8倍较有效，罐口向下，但是这种空气分布装置空气分散效果不及单管式分布装置，同时由于喷口容易堵塞，故现在很少用这种类型的空气分布装置。分散器：在空气分布装置下部，为不锈纲，是为了防止吹管吹入的空气直接喷击罐底，加速罐底腐蚀，起到延长罐底寿命的作用。一般而言，喷口的直径越小，气泡直径越小，而氧的传质系数也越大。3.7 轴封70作用：是发酵罐与转动的搅拌轴之间能够密封，防止泄露及杂菌污染。类型：(1).填料函式轴封：有填料箱底，填料底承套，填料压盖等不见构成。优点：结构简单缺点：死角多，很难彻底灭菌，容易泄露及染菌轴的磨损情况严重，功率消耗大，寿命短，耗工时多，需经常维修。(2).端面轴封：（机械轴封）密封作用是靠弹性元件如弹簧的压力是垂直于轴线的动环和静环光滑表面紧密配合，并做相对运动起到密封作用。优点：清洁，密封可靠，无死角，不易发生泄露和染菌的现象，使用寿命长，功率消耗少。3.8换热装置类型：夹层式换热装置：多用于容积较小的发酵罐和种子罐。夹层的高度比静止液面高度高即可，无须进行冷却面积的设计。优点：结构简单，加工容易，罐缺点：传热壁较厚，冷却水流速低，降温效果差。蛇形管换热装置：容积在5m3（50升）以上的发酵罐采用。分组分装在发酵罐标准发酵罐的结构示意图71附录二3,5－二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定还原糖一．原理3,5－二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，再一定范围一将上述各管溶液混后，在紫外可见分光光度计上用绿色滤光片(520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零，记录光密度值。以光密度值为横坐标，以葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。四.定糖72根据所取样品的个数来确定所需的试管数，在这里以7支试管为例，分别按表二顺序来加入各种试剂。将各管混匀后，按制作标准曲线时的同样方法的操作，测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出还原糖含量。还原糖%=(还原糖毫克数´样品稀释倍数)/培养基中总含糖量´100表二附录三 Folin－酚法测定蛋白质含量一.原理Folin－酚试剂法是测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简便、迅速、灵敏度高，较双缩脲法的灵敏100倍。Folin－酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜—蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸—磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸容易被酚类化合物还原而呈蓝色反应，而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可以发生此呈色反应，颜色的深浅与蛋白质的浓度成比例。故可以用比色法测定蛋白质的含量。此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，Folin－酚试剂B中磷钼酸—磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜—蛋白质溶液时，必须立即混合均匀，以确保还原反应能正常进行。二.实验器材７２１型分光光度计，试管及试管架，吸管及洗耳球（０.５ml、１ml、５ml）三.材料与试剂１.Folin－酚试剂Ａ：将１g碳酸钠溶解于５０ml０.１mol／Ｌ的氢氧化钠，另将５g硫酸铜溶解于１０００ml１％酒石酸钾钠溶液中，使用当天将５０ml碳酸钠和１ml硫酸铜73—酒石酸钾钠溶液混合即得溶液Ａ，即.Folin－酚试剂Ａ。２.Folin－酚试剂Ｂ：在一个２０００ml的磨口圆底烧瓶中加入１００g钨酸钠，２５g钼酸钠，７００ml蒸馏水和５０ml８５％的磷酸，１００ml浓盐酸，充分混合均匀后，接上回流冷凝器，连续加热回流１０h，小心除去冷凝器，加入１５０g硫酸锂，５０ml蒸馏水，数滴溴（加溴应在通风橱内操作），充分混合，继续加热烧瓶２０min除去多余的溴，冷却后，加水稀释到１０００ml，混合均匀，溶液应是黄绿色的。３.牛血清蛋白0.5mg/ml四.实验操作方法１.标准曲线的制作取７支试管，做好标记，按下表一顺序加入试剂。将各管混合均匀，室温下放置１５分钟，向每支管中加入Folin－酚试剂Ｂ０.５ml，立即混合均匀，在室温下放置３０分钟，以０号管作空白，于５００nm波长下测各管的吸光度，以吸光度为横坐标，以牛血清白蛋白溶液为纵坐标，绘制牛血清白蛋白的标准曲线。表一２.样品中蛋白质含量的测定正确吸取０.２ml样品溶液，再加入０.８ml蒸馏水使样品体积达到１ml，加入５mlFolin－酚试剂Ａ１５分钟后，再加入Folin－酚试剂Ｂ０.５ml，放置３０min后，以０号管为空白，于５００nm波长下测定吸光度，由标准曲线查出样品的蛋白质浓度。 74附录四微生物谷氨酰胺转氨酶(MTGase)的活性测定一.实验目的测定MTGase的活性，酶液从Streptoverticilliummobaraense的发酵液中分离纯化所得。二.实验原理谷氨酰胺转胺酶的活性可以通过将伯胺羟基引入到合成基质CBZ-Gln-Gly,然后测量生成的氧肟酸的量则可通过测定它与FeCl3—TCA形成的红色络合物在525nm的吸光度而测得。第一步:TG-CH2O-CO-NH-CH-CO-NH-CH22O-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH2CH2CH2CH2NH2OHNH3NH2羟胺C=OOHCBZ-Gln-Gly苯甲基氧化碳酰L-谷氨酰甲酼基甘氨酸第二步：FeCl3-TCA氧肟酸三价铁络合体（测定525nm的吸光度）三.实验器材氧肟酸漏斗，具塞试管，水浴锅，721紫外可见分光光度计，移液管（2ml），枪及枪头。四.实验试剂1.A液：准确称取0.01molNH2-OH·HCl，0.01mol盐酸-L-Cys，0.03molCBZ-Gln-Gly，于100ml烧杯，加50mlH20，用磁力搅拌器混合均匀(约20min)。加0.02molTris，药品完全溶解至透明。用1mol/LHCl调节pH为6.0.将混合物移至100ml容量瓶中加H2O定容至100ml，此即为100mlA母液。根据需要，可将100ml母液稀释5倍（用pH6.0,0.2mol/L的Tris-HCl），成500mlA液。2.B液：由3mol/L的HCl溶液、12%三氯乙酸（TCA）、5%FeCl3(溶于0.1mol/LHCl溶液)按1:1:1的比例混合而得。3.酶液：由发酵所得。4.Tris-HCl缓冲液（0.2mol/L、pH6.0）：称取24.228gTris于1000ml烧杯，加600mlH2O，用磁力搅拌器混匀，用2mol/LHCl调pH至6.0，将混合物移至1L容量瓶加H2O定容至1L。75五.实验步骤（一）.酶活的测定：1.打开水浴锅，将其温度调节并保持在37℃。2.将发酵摇瓶中发酵液过滤.3.准确吸取2mlA试剂于样品管，2mlB液于空白管中，37℃保温10min.（如图12 3号为样品管，4为空白管）4.按图所示顺序，每间隔30s，准确吸取200ul样品于样品管和空白管中，每管需振荡混合均匀。5.1号管反应10min时，按相同顺序，每间隔30s，样品管中准确加入2mlB试剂，空白管中准确加入2mlA试剂，每管需振荡混合均匀。6.继续在37℃水浴6min，使反应彻底终止。7.过滤每支管反应液。8.将过滤液于525nm下，在紫外可见分光光度计下用对照调零，测OD值。9.MTGactivity(U/ml)=OD×5×3.5（二）.标准曲线的绘制1称取64.8mg的标准品L-谷氨酸-γ-单异羟肟酸（MW=162.1）加10ml0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（pH6.0,0.2mol/L）。2用0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液通过2倍稀释法依次稀释5个梯度。3准确加入2mlA试剂于每试管，振荡混合器混合均匀，水浴10min。4每间隔30s，分别吸取200ul每种标准溶液于试管中，空白管加入200ul水，37℃保温10min。5以加第一支管为准，10min后，加入2mlB试剂于每管，振荡混合器混合均匀。6过滤每支管反应液。7在525nm下测定过滤液OD值。8以吸光度比氧肟酸的量做直线，由直线的斜率得到一个转换系数K，在样品酶活的测定中得到吸光度后就可以通过K计算出氧肟酸的生成量。六.实验注意事项1.水浴锅的温度必须保持在37℃。2.A液必须预热。3.在加酶液和反应终止液的时候必须把握好其中的时间间隔，保证每支管的反应时间为10min。 76附录五SYNDER—UF101型超滤使用说明书简介超滤是一种以分子量来分离物质的先进过滤方法，在生物工程、食品饮料、医药、化工等行业中用于产品的分离、浓缩、纯化、回收、具极佳的效果。SYNDER—UF101型超滤装置是一小型的超滤设备，滤膜采用1.5英寸的卷式超滤膜，适合于科研机构，工矿企业进行科学研究，产品开发研制，小批量新品试制，贵重产品纯化等的应用。主要技术参数（一）滤芯滤芯型号：SYNDER.UF—1512滤芯材质：PS—聚砜PES—聚醚砜PVDF—聚偏氟乙烯滤芯尺寸：ø35mmX250mm有效过滤面积：0.1m2截留分子量：1000、3000、5000、10000、30000、50000、100000使用温度范围：5℃~60℃使用pH范围：25℃：pH1~13；60℃：pH2~9最高耐压：0.7Mpa（二）装置材质：滤宅/机架：304不锈钢；管路：硅橡胶。泵：蠕动泵，220V、60/60Hz使用说明一、滤芯安装：1.松开滤宅固定夹，取下滤宅。2.松开滤宅下方端盖上的卡箍，取下端盖。3.将滤芯具有O型圈的一端插入到端盖的圆管内。4.将滤芯插入滤宅内，放妥密封圈，用卡箍将端盖与滤宅卡紧。5.将滤宅放回机架上，卡紧滤宅固定夹。二、过滤操作：按装置示意图所示，将管道连接妥当，并与泵相联。过滤的料液须先预处理，除去其中的颗粒杂质，以免造成对滤膜的堵塞和损伤。1.将经预处理的料液放入滤液桶。2.将泵的电源接通，将泵的转速调至最低位次，回流控制阀开大，再开泵的启动开关，然后慢慢调高泵的转速至适当。3.调节回流控制阀，使超滤压力在0.1~0.15Mpa。4.随着过滤的进行，料液的浓度逐渐增高，滤出液通量随之下降，当滤出速度降至很低时，77须先清洗滤膜。5.超滤停止时，先将泵的转速调至最低，再关闭泵的开关。6.超滤结束后应立即将系统滤芯贮存时须注意：1. 不能干放，以免滤膜材质变性受损；2.避免长菌而造成滤芯堵塞，因此滤芯在不使用时应浸泡在防菌的保护液中。常用的保护液有以下几种：①pH2—2.5左右的磷酸溶液②pH10—12的NaOH溶液③1%的甲醛溶液④含20ppm氯的水溶液⑤1.2%偏亚硫酸钠18%（W）甘油溶液⑥3.6%丙酸50%（W）甘油（用NaOH调pH至4.5）溶液贮存时间过长，以上溶液应经常更换。滤芯的贮存温度以5~45℃为宜，当贮存温度低于时应考虑防冻，采用⑤、⑥保护液具有防冻作用。78附录六10L不锈钢发酵罐BIOF使用说明书一、发酵罐介绍1罐体部分罐体带有夹套，用于培养基预热和温度控制。罐体中下部有几个Φ25专用口，分别为DO、pH传感器、取样阀接口和一个温度传感器接口。罐体正面装有矩形视镜，照明灯配用可观察罐内状况和培养过程。SF—取样阀：罐体中下部的取样阀SF，与蒸汽管道连接以达到灭菌、取样的目的（顺时针方向开）。HF—放料阀：罐体底部装有放料阀HF，并与蒸汽管道连接以达到灭菌、放料的目的（顺时针方向关）。3—测温电极（1）：测量指示罐内的温度13—测温电极（2）：测量指示加热器的温度11—水位电极：检测加热器水位，防止加热器缺水1—DO电极：检测发酵液的溶解氧浓度2—pH电极：检测发酵液pH值2罐盖部分罐盖上有搅拌电机、搅拌轴、机械密封；罐盖上多个安装口分别作为接种、添加酸碱、消泡、消泡电极、液位电极等安装之用。进气过滤器10用于过滤空气中细菌。此前应加空气预过滤器，以保证空气是无油无水无杂质的。冷凝器用于回收尾气中蒸发的水分。4—液位电极：发酵前调整液位电极的高低，发酵时选择自动补液功能便可控制液位。一旦进入发酵状态，液位电极再往下调整可能会导致染菌。5—泡沫电极：发酵前调整泡沫电极的高低，发酵时选择自动消泡功能便可控制泡沫的位置。一旦进入发酵状态，泡沫电极再往下调整可能会导致染菌。3 进气部分9—气体流量计：发酵时指示气体通量。GP—气体稳压器：具有油、水分离与压力调节作用。如用户用的不是无油无水空压机，此前还必须安装预过滤器。G1—气体流量调节阀：可手动调节流量。自动调节功能应在采购时选定。A1—进气调节阀：与G1的作用相同，区别在于A1可承受较大的压力和温度。所以用A1切断蒸汽反冲的通路，而用G1调节气体的流量。ES—富氧电磁阀：当通入空气满足不了发酵的溶解氧时，用于通入纯氧以提高溶氧度（采购时应说明是否需要此功能）。7980S22—出气调节阀：调节罐内和尾气流量。GS—进气控制阀：将阀杆插下去且锁定，空气可通入罐底；灭菌时拔起阀杆并锁定，蒸汽对过滤器灭菌。P1—过滤器前压力：与罐内压力的差值就是过滤器的阻力。P3—罐内压力：当P3安装于尾气管路上时也有代表罐内压力。DX—单向阀4 水路部分EW—进水电磁阀：罐体降温、夹套补水时自动打开。PU—循环泵：控制水循环，有三挡流量可调。W1—冷凝器进水阀：调节冷凝器冷却水流量。W2—夹套进水隔离阀：灭菌时必须关闭，以防止夹套蒸汽进入循环泵。发酵调温时必须打开，否则冷热水不能循环。W4—夹套回路隔离阀：灭菌时必须关闭，以防止夹套蒸汽进入加热器。发酵控温时必须打开，否则冷热水不能循环。W3—夹套手动进水阀：进水电磁阀EW无法打开时用此阀进行手动冷却。WS—水、汽排放阀：夹套、加热器排水，循环泵放气。12—储水器：循环系统水位限制，将溢出的水排放掉。14—加热器：对罐体加温，冷却时用自来水。5蒸汽部分S11—过滤器进蒸汽阀：对过滤器正向灭菌时用。操作此阀须小心，稍有不慎，会造成过滤器堵塞。另外，此阀打开时必须关闭A1阀，否则要损坏流量计。S12—夹套进汽阀：对罐体进行加热时用。S13—取样口进汽阀：对取样口灭菌时用。S14—放料口进汽阀：对放料口灭菌时用。S21—过滤器排水排汽阀：排放过滤器中的冷凝水及反向灭菌时排放蒸汽。S22—出气调节阀：调节罐压和尾气流量。S23—取样口出汽阀：对取样口灭菌时调节排放蒸汽量。S24—放料口出汽阀：放料口灭菌时排放蒸汽。P2—进罐前蒸汽压力AN1—夹套安全阀：当夹套中的压力大于0.3mpa时自动释放压力。AN2—罐体安全阀：当罐体中的压力大于0.3mpa时自动释放压力。6辅助设备空气压缩机—气源，通气及使罐内保持正压蒸汽锅炉—蒸汽源，罐、阀及管道的灭菌高压灭菌锅—对培养基、酸、]碱、消泡液、补料瓶、接口插针、胶管的灭菌817系统安装·发酵罐应安装在通风良好、空气洁净的房间，房间内应经常消毒。·将罐体与控制电箱放置在平整地面上，调节支撑脚确保水平与垂直度。·连接进水、排水、空气进水管，并用卡箍固定夹紧，进水要加水过滤器。·将搅拌电机、pH电极、DO电极、消泡电极、测温电极、水位电极、加热器、电磁阀的电缆接头与控制箱上相应处相连接。·安装好黄绿接地线，保证罐体有良好的接地。二、发酵罐的灭菌1灭菌准备工作·作保压试验，确保罐体的密封是有否有效。保压试验：检查取样阀、放料阀是否关闭，检查罐体上所有接口、螺丝和堵头，保证就位正确。关闭尾气调节阀S22，关闭所有蒸汽阀。使空气经GP、G1、DX、A1进入罐内，使压力升高到0.05-0.08MPa(即0.5-0.8kg)时关闭A1。观察罐压，一小时内罐压损失不大于0.01MPa时比较理想。·打开S22—尾气调节阀，释放罐内压力。·取下8—放料口套，打开HF—放料阀，清洗罐体内壁，放尽罐内液体后关闭HF。·打开水、汽排放阀WS·对pH、DO电极校检备用。空罐灭菌时，pH、DO电极应取下。·关闭罐体与管路上所有阀门，特别是W1、W2、W4。若W1没有关闭，会造成冷凝器灭菌不彻底；若W2、W4没有关闭，蒸汽会进入循环泵、加热器，使之损坏。·将GS—进气选择阀拔起并锁紧（使过滤器与液体脱离，以防止液体反冲到过滤器内而损坏过滤器）。注意：如果这一步漏做，将堵塞进气过滤器。·调整好液位电极和消泡电极的位置并旋紧。注意：所有电机、电极的插头严禁与水或其他污染物接触，防止由此造成的电路故障。·关闭水源开关。·准备提供蒸汽。注意：应保证锅炉所提供的蒸汽压力≤0.35MPa. 822空罐灭菌按1做好准备工作833实罐灭菌空消结束后，将配好的培养基加入罐内即可进行实罐灭菌：844罐体灭菌过程注意事项·发酵罐灭菌应在完成试车、保压密封试验后进行。保压密封试验：使罐内增压到0.08MPa，闭罐后1小时内泄压小于0.01MPa，12小时内泄压小于0.02MPa，24小时内泄压小于0.03MPa均属于合格。·灭菌过程中要时刻注意观察罐压，通过调整S14、S21、S22阀门，将罐压控制在0.11-0.15MPa之间。严禁超压！·灭菌中要仔细检查有关配件、管阀设备的位置、状态的正确性有否安全隐患，要及时处理不安全因素。·实罐灭菌培养基容量中，要考虑蒸汽冷凝水的增加量和培养基浓度。·灭菌后罐体冷却，特别是实罐灭菌后压力下降很快，一定要保持罐压为正值，通过调节进出气量，使罐内压保持在0.03-0.05MPa间。·各种电极校正、就位，必须在实罐灭菌之前完成。·灭菌时罐体和有关管阀件温度较高，应增加相应保护措施（如手套、栅栏、警示牌等）防止烫伤。·罐体灭菌后应对罐体及有关设备装置进行检查调整，如：各电极头、堵头、接口是否有松动。·正式培养前需对设备再次进行检查，如：罐体、罐顶盖、控温、供气和补料系统的阀门，管道以有关设备、装置的就位、状态是否良好正常。5发酵罐运行·开车运行与培养（由实罐灭菌后待培养状态进入）。·取样后对pH电极进行校正，对DO进行设定。·将经过灭菌的补料瓶胶管安装在对应的蠕动泵上。注意蠕动泵的运转方向与胶管安装的方向。·根据工艺要求调整罐压与空气流量，适当开启W1阀门，使冷凝器保持在冷却状态。 ·按照培养工艺要求，菜单中选择编辑栏目进入设置参数。85·进入发酵培养运行。·观察各控制参数显示情况，适当修正灭菌后参数偏差值。6接种、补料、取样、移种及放料(1)接种·当各测量参数显示正常且稳定，罐温稳定在设定（接种）温度，就可进行接种工作。·准备合格的菌种液。·灭菌酒精盘内倒入医用无水酒精，点燃就位。慢慢打开接种盖，为了防止罐内气体将火焰吹灭，可将酒精盘适当抬高；然后将接种盖放在盛有究竟的容器中。·将菌种瓶口放在火焰上烧一会儿，并在火焰下拔下瓶塞，小心而迅速将菌种到入发酵罐。·盖上接种盖拧紧，灭掉火焰，并用酒精棉擦洗干净接种口周围。·按工艺要求调节通气量、罐压。(2)培养基与酸、碱、消泡剂添加（补料、换液）·将酸、碱、消泡剂、培养基等放入洗净补料瓶拧紧瓶盖。·夹紧长端出口软胶管（防止灭菌过程掺液）。·把不锈钢插针放入保护套且与胶管补料瓶一起放入、高压灭菌锅，灭菌30-45分钟。灭菌后冷却待用。注意：补料瓶不能倒下，口朝上、一定要放稳固；呼吸过滤端一定不能堵塞。·将补料瓶的连接胶管与相应的蠕动泵连接就位。·选择补料输液口，取下补料口Φ19堵头，用酒精棉花沾些无水酒精涂在补料口上点燃，迅速取出待用不锈钢插针插入补料口并拧紧。(3)取样·打开S23、S13，对取样阀进行灭菌，S23阀应微开，保持15分钟左右，之后，关闭S13。用火焰封住取样口，打开取样阀（顺时针），把预先灭菌的取样瓶置于火焰上，拔去瓶塞取样。·取样后，关闭取样阀，再打开S13、S23进行短时灭菌，待取样阀内的残液放尽后，关闭S13、S23。(4)移种·如选择了带有种子罐的发酵设备，就要进行移种。本设备采用压差移种，即在种子罐压力大于发酵罐压力的条件下将种子转移到发酵罐内。·发酵罐经实消冷却后即可移种。·移种前，对移种管路，阀门用蒸汽灭菌20分钟。·移种时，向上拔起进气控制阀，使种子罐保持0.08MPa，发酵罐保持0.03MPa，打开移种管路上的阀门，种子在压差作用下，由种子罐转入发酵罐。·移种结束后，对移种管路需用蒸汽冲洗干净。·移种结束后，应立即清洗种子罐，防止发酵物料凝结在管路、阀门及罐壁上。(5)放料86·开启S14、S24阀对放料阀进行灭菌，保持15分钟后，关闭S14、S24阀。·取下放料口套，打开HF放料。·关闭蒸汽源。·放料后，根据工艺要求对发酵罐及管路空消或清洗。7清洁保养方法(1) 清洗工作注意：培养结束和再次使用前都必须及时清洗罐体及相关部分，清洗时应注意电器元件、电极接口，不能进水、受潮。清洗前应取出pH、DO电极并按其要求保养存放。清洗罐内可配合进水进气、电机搅拌、加温一起进行，如多次换水还不能清洁干净，则要打开顶盖用软毛刷刷洗罐内部件。方法如下：1）关闭控制开关与电源开关，取下顶盖电极、电机及其连线插头。拔下进气胶管冷凝器快速接头拆下进气过滤器胶管与接头。2）拧下罐盖紧固螺丝，小心垂直向上取出罐盖横置于平整桌面，垫好、不要碰撞轴和叶轮，用中性洗涤剂刷洗罐体各部件。注意：罐盖搬动清洗时只能抓住轴套或顶盖，不能抓搅拌轴、叶轮和其他易变形部件。如果在购买时选择了开盖提升装置，则开盖就容易多了，搅拌轴也不容易损坏。3）清洗后要检查罐上各密封圈、硅胶垫的情况，如有破损要及时更换，安装一定要到位。4）拧紧罐盖六个紧固螺丝，用力要平衡并注意罐盖与罐座之间的间隙均衡情况。(2)试车·将电极、电机、电缆、进出气软管、冷凝器进出水接头安装就位。·安装完毕后要对罐体内通气（0.05-0.08MPa）作密封性试验。·对系统进行2-3小时试运行，如有问题作相应处理后，方可正式使用。87附录七GBJS-10B玻璃发酵罐的使用说明书一、设备组成GBJS-10B发酵系统由发酵罐、空气处理系统、蒸汽净化系统、电气控制系统、恒温系统及管道、阀门等组成。二、工艺流程三、安装要求1．配套空气压缩机应安装于通风良好、空气干净的房间内。2．发酵罐应置于通风良好、空气洁净、有进排水设施的房间内。3．本设备为台式安装；放置于平整的桌面上，桌面高度以70cm为宜，四周留出操作空间。4．空气管道的连接：发酵罐与空气压缩机的连接采用Φ8×1的尼龙管或硬质塑料管；连接方法：将减压分水过滤器的进气接头螺母旋下，穿过尼龙管，并将尼龙管插入接头，拧紧螺母。5．蒸汽管道连接：发酵罐与蒸汽源的连接采用Φ8×1的紫铜管或不锈钢管；连接方法：将蒸汽进口螺母旋下（注意：螺母内有球形卡套，请勿丢失），将铜管穿过螺母及球形卡套，并将管道插入接头内，拧紧螺母。如图所示。6． 冷却水管道的连接：采用Φ12加强塑料管或Φ10优质橡胶管；将管道插入进出水口的宝塔嘴接头，并用喉箍（获细铁丝）固定。水源与进水口连接，水源与管道连接处应安装阀门，一边调节水流量；与出水口连接的管道通往排水处。7．电源要求：本设备采用单相电，电压220V±10％，频率50Hz，电线应能承受5A的电流，设备配有5A三眼扁插头，要求用户安装与插头配套的插座，并接上有良好接地性能的地线。以确保安全。四.操作方法设备使用前，操作人员应认真阅读本章节内容，必须搞清各管道、阀门的作用，在确保操作过程了解无误的情况下方可进行实际操作。（一）准备工作检查本系统各单件设备，应确保各设备能正常运行是方可开机。1．空气压缩机的检查主要检查润滑油是否正常、工作压力应在0.4－0.6MPa之间；排尽贮气罐内的水。其他88项目按照空气压缩机的使用说明书进行检查。2．管道、阀门的检查检查管道、阀门是否有泄漏。如有泄漏。应进行调整，至无泄漏为止。3．电气仪表的检查检查发酵罐温度显示是否正确；校检压力表，空气减压阀。校检pH、DO电极及仪表。4．控温仪温度设定值的调节本设备采用三位式温度控制仪，上限设定值控制冷却水电磁阀，下限设定值控制升温加热器；上限设定值为培养温度＋0.5oC，下限设定值为培养温度－0.5oC；调整上限温度值时，按住上限设定按钮，调节按钮右边旋钮，至显示值为上限设定值时，按住下限设定按钮，调节按钮右边旋钮，至显示值为下限设定值。注意：上限设定值一定要大于下限设定值，否则温度控制仪将无法实现。5．pH电极与仪表的校检及保养①.pH电极在不使用时应垂直浸泡在蒸馏水中，否则会引起电极老化和电解液的渗漏。②.将pH电极插入专用电缆线接头，并旋紧螺母；用pH标准液标定pH电极。调节方法见使用说明书。6．DO电极与仪表的校检及保养①.DO电极在不使用时应浸泡在蒸馏水中，否则会引起老化。②.将DO电极插入专用电缆线接头，并旋紧螺母；将电极插入DO仪表上部的“CALIB”（调零旋钮），使仪表读书为零。然后用蒸馏水洗净电极，将电极置于空气中，待仪表读书基本稳定后调节仪表下端“SLOPE”旋钮（斜调节旋钮）至最大，此时仪表读书应大于140。否则电极需要清洗。③.DO电极清洗：旋下压紧帽及透氧膜架，用金相砂纸打磨白金电极至发亮，并将“O”型圈套在导入器上，用导入器轻轻压住透氧膜，然后将“O”型圈推入固定槽内；在透氧膜架内加入约3ml电解液；将其拧在电极护套上；最后将压紧帽旋紧。④按②条再对DO电极进行检测7．安全防护罩的安装在空、实消情况下，为防止因玻璃筒意外损伤，而可能造成人员的损伤，必须安装安全防护罩。安全防护罩安装方法：将安全防护罩打开，包在玻璃筒的外面，合拢防护罩，并插上插销（如开箱时）。（二） 空气过滤器及空气管路的消毒1．关闭空气阀F11（图三）；打开蒸汽阀F1、F2，排尽冷凝水后F2调为微开。注意；此时蒸汽压力应在0.14－0.16MPa之间；压力过低将造成咩菌不彻底，压力过高则空气过滤器芯有可能被损坏而失去过滤能力。892．微开F13，打开F14蒸汽通过空气过滤器及以后的空气管道进入发酵罐内。3．开启空气压缩机，调节空气减压阀，使其出口压力在0.2－0.25MPa之间。4．消毒时间一般为30分钟。5．打开F11、F12、F13；排去冷凝水后，在将F12、F13转为微开；吹空气过滤器。6．吹干空气过滤器一般需20分钟左右。然后关闭F12、F13，保持空气管道及空气过滤器中是正压。（三）空消1．必须将安全防护罩装上。注意pH，DO电极应取下。2．打开F4、F22，排尽蒸汽管中的冷凝水后将F22转为微开；稍开F21，微开F14使蒸汽徐徐进入发酵罐；对发酵罐进行空消。3．注意在升温过程中不要开控温仪开关，否则当上下限设定值在培养温度时，冷却水管中会自动通冷却水，影响升温速度，同时也浪费蒸汽。4．在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.11－0.12MPa之间，严禁超压。罐压额控90制通过调节阀门F4和F14来实现。5．空消时间一般为30－50分钟。到时间后，关闭F4、F14。打开F22，排尽发酵罐内的冷凝水后立即关闭F22、F21。此时可取下防护罩。6．当蒸汽阀F4关闭后，发酵罐内的压力会迅速下降，为防止发生发酵罐内产生负压，必须微开F13，并调节F14，使罐内保持在0.03－0.05MPa之间。（四）加培养液1．按工艺要求配制培养基原液。2．打开排气阀F14，关闭进气阀F13，卸去罐内压力；打开罐盖上的加料口，将培养基原液加入发酵罐内，并加水至所配培养基液的总量的45－75％左右（视环境温度、蒸汽压力及接种量而定，其余25－35％为蒸汽冷凝水和种子量）。3．拧紧加料口螺母（注意：不要拧的太紧，否则 会损坏密封圈）。4．将校检好的pH、DO电极插入发酵罐中，并用螺母旋紧。（五）实消1．必须将安全防护罩装上。2．打开F4、F22，排尽蒸汽管中冷凝水后即关闭F22；稍开F21，使蒸汽徐徐进入发酵罐；开始升温。3．接通电源，打开电源开关和搅拌开关，调节搅拌电机的调速器，慢速搅动培养基，使培养基均匀的升温，同时可降低灭菌时的噪音。此时应关闭F13，并将排气阀调为微开。4．当培养液温度达到95－100oC后可关停搅拌器，停止搅拌。在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.1－0.11MPa之间，严禁超压。罐压的控制通过调节阀门F4和F14来实现。5．注意在升温过程中不要开控温仪开关，否则当上下限设定值设定在培养温度时，冷却水管中会自动通冷却水，不仅会影响升温速度，浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，引起培养液浓度的变化。实消时间一般为30分钟，到时间后，关闭F4、F21、F14。自然冷却10分钟左右。6．通冷却水进行冷却，操作如下：开控温仪电源，调整控温仪上下限设定值（调节方法见（一）第4条），此时起即进入控温状态。取下防护罩。7．当蒸汽阀们关闭以及通冷却水后，发酵罐的罐压将迅速下降，当罐内压力降至0.01MPa时，必须间隙开启进气阀F13，让空气进入发酵罐内，并保持内压力在0.03－0.05MPa之间。8．当罐内温度降至70o以下时，调节搅拌机的调速器，慢速调搅动培养基，加快冷却速度；同时可稍开进气阀F13和调节排气阀F14，使罐内压力保持在0.03－0.05MPa之间。（六）接种1．当发酵罐温度降至接种温度时即可进行接种。2．准备合格的摇床菌种。913．用酒精棉擦洗罐顶接种口，并在接种口四周围上酒精棉。接种者的双手也要用酒精擦洗消毒，晾干。4．调进气阀F13，减少进气量）不能关闭，否则罐压跌零，引起污染），拧松接种口螺母；检查罐内压力是否在0.01MPa以下（如果不在应开大排气阀F14或调节进气阀F13，减少进气量），点燃接种口四周的酒精棉；拧下接种口螺母，并将其放进预先准备的盛有酒精的培养皿中。用烧杯罩住仪表盘。5．将菌种瓶的瓶口在火焰上烧一会，并在火焰下拔下瓶塞，迅速将菌种倒入发酵罐内。6．盖上接种口螺母，灭火焰，拧紧螺母；并用酒精棉将接种口擦洗干净。7．调节进气阀F13及排气阀F14，达到工艺要求的通气量及保持罐压在0.05MPa左右。（按工艺要求）（七）培养1．按工艺要求调节通气量，培养温度及搅拌转速。2．通气量的调节：要加大通气量，则需开大进气阀F13，反之则调小进气阀F13的开度；阀F14要做出相应的调整，以保持罐压。通气量的测量：通过流量计进行检测。3．培养温度的调整：按（一）中第4条所述方法进行调整。4．搅拌转速的调整：调节搅拌电机的调速旋钮，达到所显示的电机转速。5．调节溶氧仪的“SLOPE”旋钮，至100。6．将预先准备好的碱液和灭过菌的消跑剂、流加物料及硅胶管与蠕动泵及发酵罐连接好；注意：操作过程必须保证无菌。7．调节pH调节仪的设定旋钮至所需的pH控制值。打开pH调节开关，此时pH调节蠕动泵会按照时间比例进行控制。当稳定后，如果测量值高于设定值，则需调小设定值，反之则需调大设定值。8．如果发酵过程中泡沫高度超过泡沫传感器，则会发出声音报警，此时可打开消泡开关，加入消泡剂。（八）取样1．取样口的消毒：打开阀门F4；微开取样阀F22，保持20－30分钟；关闭F22，F4（图三）。2．取样：打开阀门F21、F22放出少量培养液后关闭取样阀F22；用火焰封取样口，把预先灭过菌的取样瓶瓶口置于火焰上，拔去瓶塞，瓶口对准取样口，开取样阀F22，至所需取样量后即关闭取样阀F22；盖上瓶塞，关阀门F21。3．取样口再灭菌：同1.条（九）出料1．必要时将优质橡胶管套在出料口，引至盛料容器或下道工序。2．出料管的灭菌：打开阀门F4，，微开出料阀（取样阀）F22，保持20－30分钟；关闭F22、F4（图三）。3．调小排气阀F14，调节进气阀F13，使罐压保持在0.05－0.1MPa之间的某一值（视需要 92而定）。4．出料：打开F21、F22。发酵液通过管道输送到盛料容器或下道工序。5．出料完毕后用蒸汽消毒出料管，方法同2.条。6．取出pH、DO电极，并按（一）中第5、6条进行电极的保养。7．发酵罐应及时清洗干净。8．如果发酵罐暂时不用，则需排尽罐内及各管道内的余水。（十）发酵罐的清洗1．发酵罐在使用前和使用后，必须及时清洗。清洗时应注意罐盖顶部的电气接口不能进水，否则可能会引起电气元件的损坏或数据测量错误。2．发酵罐使用前，放入自来水，通压缩空气，并搅拌至洁净；打开阀门F21、F22。放净发酵罐内水即可。3．发酵完毕放罐后或使用前发酵罐较脏，自来水通气搅拌仍然不能清洗洁净，应按以下操作过程进行开盖清洗（4－11条）。4．关闭电源，旋下电机及各传感器的连线插头；拧开罐盖上部进气管与发酵罐及空气过滤器的连接螺母，向上取出该进气管。5．拧下罐盖周边的四个螺母，小心地将罐盖垂直向上取出（取出时应注意罐盖地方位，以免在安装时装错。同时因罐盖上固定部位较多，在取罐盖时，请不要转动罐盖，以免相互碰撞，损坏部件），横置于平整地桌面上，并将其垫好，防止滚动。注意：在搬动和放置时，应抓住电机固定座，不要抓搅拌轴，以免影响机械密封和轴地转动稳定性。6．关闭阀门F21、F22，在罐内加入适量水，用软毛刷刷洗罐内部件；刷洗完毕后打开阀门F21、F22，放净罐内水。如果维未洗干净，重复该操作。7．如果搅拌轴及机械密封装置不干净，则可用水冲刷。8．清洗干净后，检查罐盖与发栏之间地密封圈；将罐盖按原位轻轻放入发酵罐；拧上罐盖周边地四个螺母；注意：四个螺母松紧应基本一致，不要太紧，否则会引起搅拌轴地倾斜和密封圈的损坏。9．安装进气管：将进气管按原位插入罐盖及过滤接口，拧上螺母，注意：不要太紧，以不漏为原则。10．传感器、电机电线插头的安装：航空插头在安装时应对准插头与插座之间的槽口，插入后方可拧紧固定螺母。11．安装完毕后，在发酵罐内通入空气（0.05MPa），检查管道及发酵罐的密封性；如有泄漏，则需调整后方可使用。六、维护与保养1．空气压缩机应按其使用说明书进行定期维护与保养。2．接地线保持可靠接地。933．精密过滤器及金属过滤器的滤芯，一般使用期限为一年。如果过滤阻力太大或失去过滤能力，影响正常生产，则需更换或再生。4．发酵罐清洗时，请用软毛刷刷洗，不要用硬器刮擦。5．压力表、控温仪、pH仪、DO仪，调压阀等仪表每年应校正一次，确保正常使用。6．电器、仪表、传感器等电器设备严禁直接接触水、汽。7．设备停止使用时，应清洗干净，排尽发酵罐及各管道中的余水；松开发酵罐罐盖螺丝，防止密封圈产生永久变形。七.注意事项1.必须确保所有单件设备能正常运行时使用本系统。2.在空消或实消时必须将安全防护罩装上，以免因玻璃筒损伤，但未察觉，引起玻璃筒破坏，造成不必要的人员伤亡。3.在过滤器消毒时，流经空气过滤器（金属滤芯）的蒸汽压力不得超过0.17MPa，否则过滤器芯会被损坏，失去过滤能力。4.5.在操作过程中，罐压不得超过0.12MPa，防止引起设备的损坏。注意：在空、实消升温过程中不要开控温仪开关，否则当上、下限设定值设定在培养温度时，冷却水会自动通冷却水，不仅会影响升温速度、浪费蒸汽，更重要的是会引起冷凝水过多，造成培养液的浪费。6.7.8.在空、实消结束后冷却时，发酵罐内严禁压力产生负压，以免损坏设备活造成污染。在发酵过程中，罐压应维持在0.03－0.05MPa之间，以免引起污染。在各操作过程中，必须保持空气管道中的压力大于发酵罐的罐压，否则会引起发酵罐的液体倒流到过滤器中，堵塞过滤器芯或失去过滤能力。94八.常见故障及排除方法 95羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇螇蝿羃蒅螆袂腿莁螅羄羂芇螄蚄膇芃螃袆肀薂螂羈芅蒈螂肀肈莄螁螀芄芀莇袂肇膆蒆羅节蒄蒅蚄肅莀蒅袇芀莆蒄罿膃节蒃肁羆薁蒂螁膁蒇蒁袃羄莃蒀羆膀艿薀蚅羂膅蕿螈膈蒃薈羀羁葿薇肂芆莅薆螂聿芁薅袄芅膇薄羆肇蒆薄蚆芃莂蚃螈肆芈蚂袁芁膄蚁肃肄薃蚀螃羇葿虿袅膂莅蚈羇羅芁蚈蚇膁膇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