2011分子生物学总复习

2011年《分子生物学基础》本科生答疑专用一、PPT11、1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型2、DNA双螺旋结构模型的意义：DNA复制的明显方式——半保留复制。Waston和Crick在1953年就指出：DNA可以按碱基互补配对原则进行半保留复制。而在此之前对复制方式人们一无所知。基因和多肽成线性对应的一个可能的理由：DNA核苷酸顺序规定该基因编码蛋白质的氨基酸顺序；DNA中的遗传信息就是碱基序列；并存在某种遗传密码(geneticcode)，将核苷酸序列译成蛋白质氨基酸顺序。该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。该模型的提出是本世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。二、PPT21、原核生物特点：①遗传物质仅一个环状DNA；②无核膜；③无细胞器,无细胞骨架；④以无丝分裂或出芽繁殖。包括：支原体,细菌,兰藻,螺旋藻(人类未来的蛋白质食物新来源)2、真核生物三大结构体系：膜系统：质膜,内膜系统,细胞器；细胞核系统：遗传信息表达系统；骨架系统：细胞质,细胞核等的骨架系统3、类核体：通常含有一个折叠成类核体附着在质膜上的环状染色体。4、质粒：携有一定遗传信息的质粒，包括小分子的脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、核糖体：合成蛋白质的场所5、原核生物表面的纤毛作用：可使细胞能够附着在其他细胞的表面上；而鞭毛的作用是：旋转运动可使细胞游动。6、溶酶体：是小的有膜包围的细膜器，从高尔基体出芽而成，并且含有各类能降解蛋白质、核酸、脂类和糖类的消化酶。溶酶体起着从细胞外带进大分子或来自损伤细胞器的大分子的回收中心的作用。7、微体：乙醛酸循环体是特定的植物过氧化物酶体，进行乙醛酸循环。溶酶体、过氧化物酶体和乙醛酸循环体合称微体8、大小和密度不同的细胞器，例如细胞核与线粒体、可以根据它们的沉降系数值不同由差速离心法互相分离并与其他细胞器分开。9、通常在DNA样品的分析中，往往选用测量样品的吸光度来鉴定其浓度和存度，DNA的吸收峰在260nm，蛋白质的吸收峰在280nm。纯净的DNAA260/A280比值约为1.8，纯净的RNAA260/A280比值约为2.0。10、HGP是人类基因组计划（HumanGenomeProject）。三、PPT31、大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。2、生物体内的氨基酸类别：蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸其中稀有的蛋白质氨基酸。蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。10 非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。3、氨基酸的性质：（1）两性解离和等电点。（2）光学性质。（3）重要化学反应a.与茚三酮反应：用于氨基酸定量定性测定。b.与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）：用于蛋白质N-端测定。c.与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应），用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。sanger反应：氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应Edman反应：氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应4、蛋白质的一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primarystructure)。这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。5、蛋白质的二级结构（secondarystructure）：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元．主要有以下类型：(１)α－螺旋(２)β－折叠(３)β－转角(４)无规则卷曲6、蛋白质四级结构：是指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。7、论述：蛋白质的主要功能是什么？催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能……酶：除了少数有催化活性的RNA分子外，几乎所有的酶都是蛋白质。酶可以将生化反应速度提高几个数量级。底物与特殊氨基酸侧链间的结合是通过各种非共价相互作用。这些相互作用包括范德华力、氢键、盐桥和疏水力。结合的特异性极高，像只与单一底物结合（例如葡萄糖氧化酶只与葡萄糖结合），或者是基团特异性的（例如己糖激酶与各种己糖结合）。侧链也可以直接参与催化，例如可作为亲核体或质子供体或受体。信号传递：细胞膜上的受体蛋白质可以与来自细胞外介质的配体（如激素）结合，通过最终的构象改变，在细胞内启动配体的反应。配体结合与底物结合很相似，但配体通常保持原形。转运与贮存：血红蛋白在红细胞中转运氧气，转铁蛋白转运铁：转铁蛋白+Fe→进入肝脏→转铁蛋白结合以铁蛋白的形式储存于肝脏。摄入的脂肪在血液中以脂蛋白形式转运。许多其他分子和离子也都以蛋白质结合形式转运和贮存，这样在需要用它们之前，可以增加溶解性、减小反应活性。结构与运动：胶原蛋白是皮肤、骨骼和结缔组织中主要的蛋白质头发主要由角蛋白组成。细胞内还有许多结构蛋白，例如细胞骨架中的许多蛋白质。主要肌肉蛋白肌动蛋白和肌球蛋白组成了滑行丝，成为肌肉收缩的基础。营养：酪蛋白和卵清蛋白分别是奶和蛋中主要的蛋白质，被用来为发育中的后代生长提供氨基酸。种子蛋白质也为萌发的植物胚提供营养。免疫：可以识别并结合细菌、病毒和其他外源物质（抗原）的抗体，也是蛋白质。调节：转录因子与DNA结合并调节其功能。许多其他蛋白质通过与其他分子的结合修饰其功能。8、论述：蛋白质纯化方法凝胶过滤层析（Gelfiltrationchromatography10 ）：采用填充有特定孔径的颗粒悬浮液的柱子（分子筛）进行，将样品上样在柱子顶端时，比孔径大的蛋白质分子很快被洗脱至底部，因为它们被排除在颗粒之外，因而所需缓冲液洗脱体积相对较少。比孔径小的分子可以进入颗粒，因而需要相对较多的缓冲液洗脱体积。将小分子在大分子之后从柱上洗脱下来。超速离心：超速离心时，蛋白质在高速离心场中的沉降速度（S值）随它的大小和形状不同而异。超速离心不仅可以用于分离蛋白质而且也是研究蛋白质结构的有力分析工具。依据蛋白质所带净电荷采用电泳和离子交换层析来分离和纯化该蛋白质。依据疏水性不同：在高离子强度溶液中，蛋白质和柱中含有的芳香族或脂族烷基物质之间的疏水相互作用会增强。通过一个逐渐增加的离子强度梯度，蛋白质会在不同阶段被洗脱下来。亲和性：酶与底物、受体与配体和抗体与抗原反应的高度特异性，意味着可依据这些特性对蛋白质进行完全纯化。例如一个用与激素胰岛素共价结合的支持物制成的层析柱可以特异地结合胰岛素受体而不是别的蛋白质。由于酶的竞争性抑制剂不会被要被纯化的酶所降解，故常被用作亲和配体。重组技术：在一个适合的宿主细胞中过量表达重组蛋白质，产量的提高大大简化纯化过程。例如将编码蛋白质的基因插入一个在强启动子控制下的噬菌体或质粒的表达载体，并将其转化大肠杆菌，该蛋白质的合成量可以占细胞总蛋白质的30％。通过在基因的5’或3’端加入6个组氨酸密码子，形成用于纯化的标签，可进一步加速纯化进程。这种情况下被合成的蛋白质会在N或C端有一个六组氨酸标签，这使得在含有固定金属离子如可与组氨酸结合的Ni2+的亲和柱上，对蛋白质进行一步纯化成为可能。标签通常对蛋白质功能没有什么影响。四、PPT1、RNA的类别：信使RNA（messengerRNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用；·核糖体RNA（ribosoalRNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome）,核糖体是蛋白质合成的场所；·转移RNA（transforRNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。2、原核生物mRNA的结构特点及功能先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列真核生物mRNA特征：“帽子”（m7G-5´ppp5´-N-3´p）+单顺反子+“尾巴”（PolyA）3、真核生物mRNA的结构特点及功能4、请指出原核生物与真核生物mRMA的不同之处。5、核酸的某些理化性质u核酸的两性解离性质u核酸的紫外吸收特性（λmax=260nm）u核酸的变性、复性和分子杂交u核酸的熔解温度（Tm）10 u核酸的沉降特性：沉降系数（s）6、核酸分子杂交：不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例：southern印迹法7、Tm值：DNA的变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中A260达到最大值一半时的温度称为该DNA的熔解温度，用Tm表示。Tm的大小与DNA分子中（G+C）的百分含量成正相关，测定Tm值可推算核酸碱基组成及判断DNA纯度。五、PPT1、DNA的突变：DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变2、遗传重组：不同DNA分子之间的交换而引起的3、突变的类型：沉默突变：错义突变：无义突变：移码突变：癌变：v沉默突变：如果它发生在DNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基位置，并不影响掺进蛋白质中的氨基酸。v错义突变：如果改变了基因产物的1个氨基酸，则是错义突变。错义突变的效应可以是无作用的，也可以是致死的，这取决于被影响的氨基酸。v无义突变：形成新的终止密码子的突变是无义突变，结果会产生截短了的蛋白质产物。移码突变：插入或缺失涉及一个或多个碱基的增加或丢失，这会引起基因的移码突变。移码突变的结果是所翻译出的蛋白质序列从突变点起至C末端都完全被改变了。v癌变：影响细胞生长或细胞死亡过程的突变可以引发癌变。4、复制的忠实性：DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制5´109碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点：·DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则，但错配率为7´10-6）·DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）·起始时以RNA作为引物5、填空：物理诱变剂：紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation)：紫外线引起相邻嘧啶碱基产生嘧啶二聚体。化学诱变剂：如碱基类似物(baseanalog)、碱基修饰剂(basemodifier)、嵌入染料(intercalationdye)、烷化剂等。Ø碱基类似物(baseanalog)：改变碱基配对特性的正常碱基衍生物，可诱发直接诱变。Ø亚硝酸：使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，从而和腺嘌呤配对，引起随后复制中发生G·C向A·T转换。Ø烷化剂：如甲烷磺酸甲酯（methylmethanesulfonate，MMS）、乙基亚硝基尿（ethylnitrosourea，ENU）及芳基化剂须经修复才能防止给转录及复制过程带来严重破坏Ø嵌入剂：会产生插入突变和缺失突变。绝大部分化学诱变剂是致癌剂，诱发癌症7、某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤8．简述DNA复制的忠实性9．诱变剂的类型与作用10．DNA的修复：？？？10 六、PPT-1DNA克隆：通过将生物体基因组DNA片段作为自主复制载体的一部分进行独立复制的方式，使对该片段的分离及操作简单化。解决这一难题的方法是将基因组中携有该基因或其他相关序列的较小片段连接到一段可以自主复制的DNA即载体上，形成通常可以在另一宿主中进行复制的重组DNA，这种复制是独立于原初基因组的。带有重组DNA的宿主细胞的增殖构成了一群具有遗传一致性的个体，或称为单克隆。这一系列操作过程就被称作DNA克隆。细菌质粒：是独立于宿主基因组复制、编码抗生素抗性基因的小型环状DNA分子、运载克隆DNA的常用载体转化：用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化：转化率：转化率定义为每毫克转化的质粒DNA所产生的具抗生素抗性的克隆数。转染：DNA转入真核细胞的过程，称转染。杂交扣留：cDNA克隆可与mRNA样品进行杂交以阻止或抑制某些mRNA随后的翻译。密码子(codon)：mRNA上每3个相邻的核苷酸编码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或三联体密码。遗传密码：DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系称为遗传密码。PPT6-31、质粒特点：染色体外的小型环状分子，大小约为2—200kb，通常以多拷贝(可多达几百个)形式存在于宿主细胞中。质粒含有复制起点(ori)用以保证质粒的自主复制正常复制依赖宿主细胞中的聚合酶及其他成分。质粒一般仅携有几个基因抗生素物质的抗性基因。质粒最常见的抗性基因是amp+基因（氨苄青霉素）和另一种常见抗性基因是tetA基因。质粒提取的原理：1）裂解：菌体沉淀重悬于悬浮缓冲液→必要时加入的1.溶菌酶（能降解菌体细胞壁）→加入2.细胞裂解液，含去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)的碱性NaOH溶液。SDS的作用是破碎细胞膜及引起蛋白质变性；碱性条件会引起DNA变性及水解RNA。2）中和沉淀蛋白：用高浓度pH5的乙酸钾溶液中和。其作用是沉淀已变性蛋白质和染色体DNA及大部分去污剂(十二烷基硫酸钾不溶于水)→再次离心→上清(裂解液)中含有质粒DNA（小型闭合环状的质粒DNA在碱处理后很易复性）→此时的溶液中还含有大量小分子RNA及少量蛋白质。3）酚抽提：去除剩余蛋白。酚相与水相不相溶，当剧烈振荡然后静置或离心分相后，变性了的残余蛋白会沉降出来处于酚相与水相的界面。4）乙醇沉淀：留在水相中的DNA和RNA可由无水乙醇沉淀得以浓缩。这是常用程序，可应用于任何核酸溶液。异丙醇也可沉淀核酸。75%乙醇洗1－2次，去除核酸中的杂质。5）离心沉淀核酸，干燥后再溶于更少的体积，或溶于含新成分的缓冲液中。溶液中含Tris·HCl以缓冲溶液酸碱度(通常为pH8)，还含有低浓度的EDTA用来螯合Mg2+以保护DNA免受核酸酶降解，因大多数核酸酶工作都需要Mg2+。核糖核酸酶A(RNaseA)可同时被加入溶液中以降解残余的RNA污染。该酶降解RNA又不损伤DNA，也不需Mg2+参与反应。6）小量法制备质粒的过程（一般掌握）携有目的质粒的大肠杆菌菌株10 ↓数毫升液体培养基（LB）↓增殖至稳定期(过夜培养)↓离心↓菌体沉淀↓小量制备法提取质粒随机挑取生长于LB平板上的数个白色的菌落分别接种于含100μg/mlAmp的LB液体培基中，37℃振荡培养过夜。各取1.5ml培养液微量离心管中，10000g离心30秒，尽弃上清，将沉淀重悬于100μl预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HClpH8.0，10mmol/LEDTA)中，剧烈振荡以分散沉淀的细胞；再加入200μl新配制溶液II(0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配)，快速颠倒离心管数次以混合内容物，确保整个内表面与溶液II接触；然后加入150μl溶液III(5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2028.5ml)，温和振荡数次，使溶液III分散均匀，置冰上3~5分钟后，4℃12000g离心10分钟，取上清加入等体积的酚/氯仿、氯仿各抽提一次，取上层水相加入2倍体积的无水乙醇-20℃沉淀30分钟，4℃12000g离心15分钟，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后真空干燥。沉淀用适量含RNA酶(20μg/ml)TE(10mmol/LTris-HCl,1.0mmol/LEDTApH7.6)溶解，37℃作用15分钟。取2μl进行琼脂糖电泳分析。乙二醇法纯化方法：取3ml冰预冷的5mol/LLiCl溶液加到上述制备的质粒DNA溶液中，充分混匀后12000g4℃离心10分钟。弃沉淀，将上清转移到另一个离心管中，加入等体积的异丙醇充分混匀后，8000g室温离心10分钟。小心去掉上清，倒置离心管控干残留液滴，于室温下70%乙醇洗涤，干燥后，加入500μl含RNA酶(20μg/ml)的TE溶解沉淀。将核酸溶液转入1.5mlEppendorf小管，置室温作用30分钟后，加入500μl含13%（W/V）PEG8000的1.6mol/LNaCl溶液，充分混匀。12000g4oC离心10分钟，吸出上清，加400μlTE重新溶解质粒DNA沉淀。酚/氯仿、氯仿分别抽提两次和一次，收集水相，加入100μl10mol/L乙酸铵和2倍体积的乙醇，充分混匀，于室温静置10分钟。12000g4℃离心10分钟，弃上清，沉淀以70%乙醇洗涤，真空干燥后，加入200μlTE(pH8.0)溶解沉淀。 病毒DNA提取方法？PPT6-41、限制性内切酶：来自细菌，可将DNA酶切(水解)成特定的、可再生的片段。在细菌中限制性内切核酸酶是抵抗外源DNA侵入的限制修饰防卫机制的一部分。限制性内切核酸酶是进行基因克隆的基本工具。2、同裂酶(isoschizomers)有些来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列，这类限制酶称为同裂酶。同裂酶产生同样切割，形成同样的末端，酶切后所得到的DNA片段经连接后所形成重组序列，仍可能被原来的限制酶所切割。同裂酶之间的性质有所不同(如对离子强度、反应温度以及对甲基化碱基的敏感性等方面可能有所差别)。3、同尾酶(isocaudomers)有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。EcoRI和MunI属于同尾酶。4、DNA甲基化酶：该酶可以对细胞DNA的相应识别序列内的C或A10 碱基上加一个甲基。这种修饰作用可以保护宿主细胞DNA不被内切酶降解。5、琼脂糖凝胶电泳原理当电场加载于具导电性的缓冲液中的琼脂糖凝胶上后，DNA片段在凝胶中依据其大小和形状以一定的速率向正极方向移动(DNA具有很高的负电性)(图G3．3)。较小的线性片段比较大片段移动得快，因为较大片段会被构成凝胶的琼脂糖纤维网的障碍所阻滞。7、琼脂糖凝胶电泳迁移速率的决定因素：1、DNA的分子大小：线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。（2）琼脂糖浓度：一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%，DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。（3）3、DNA分子的构象：相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。（4）4、电源电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。（5）5、嵌入染料的存在：荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。（6）6、离子强度影响　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。PPT6-51、T4DNA连接酶：可以修复双链DNA骨架的断裂，催化限制酶酶解反应的逆反应，使退火的互补黏性末端共价连接在一起，形成新的DNA分子。主要是催化双链DNA一端的3’-OH与另一双链DNA5’端的磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘末端或平端的DNA末端连接起来。2、碱性磷酸酶：用碱性磷酸酶处理线性载体分子，以除去5’—磷酸基团，使载体在没有目的片段插入的情况下不能连成环状，从而降低反应物中载体自身环化的比例。该酶可从DNA分子的5’端去除磷酸基。3、转化：用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化。质粒通过转入具有特定遗传性状的大肠杆菌菌株而被克隆。用Ca2+处理大肠杆菌细胞，可使之成为易接受质粒DNA的感受态细胞。将这样的细胞涂布于琼脂平板，会长出单克隆或多个克隆。4、筛选转化子的增殖与保存：从转化平板上挑取单克隆，接种于含有选择标记抗生素的液体培养基中培养，然后将部分菌液冻存于含一定浓度甘油的保存液中备用。3．论述DNA的克隆：含有目标克隆序列的质粒DNA的提取↓用限制性内切核酸酶将质粒酶切成不连续的片段↓10 经琼脂糖凝胶电泳分离片段↓纯化目标片段↓将目标片段连接在一新质粒载体上，形成新的重组分子↓将连接好的质粒转入某一大肠杆菌菌株(转化，transformation)↓转化细菌的筛选↓重组质粒的分析PPT6-6：1、PCR的原理及方法在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。1、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。2、退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。3、延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。PCR特点：n高度敏感性n高度的特异性n操作简便、快速n适用样品广泛2、PCR反应体系：10×PCRbufferdNTPmix引物1引物2DNA模板Taq酶加双蒸水至总体积为100μl3、PCR注意事项：v注意事项：PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行v纯化模板所选用的方法要简单有效v防止核酸和核酸酶的污染v试剂配制应该以大体积配制、分装、储存，以确保实验与实验之间的连续性。逆转录（ReversetranscriptionPCR,RT-PCR）：以细胞内总RNA或mRNA为模板，采用olig-dT或随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA作为模板，通过特异性引物，PCR扩增目的基因。4、荧光PCR原理：qSYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位qSYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光q变性时，DNA双链分开，无荧光10 q复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。PPT6-71、核酸分子杂交名词解释：用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。2、核酸分子杂交特点：n灵敏度高（<1pg互补序列）n速度快（<24h）n简单易行应用：n基因克隆的筛选n酶切图谱制作n基因组中特定基因序列的定量和定性检测n基因突变分析n疾病的诊断、微生物病原体检测3、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。n引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。n加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。n变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。2、复性n在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。n在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。第一步是两条单链随机碰撞形成局部双链，这种局部的双链是暂时的，若周围的碱基不能配对就会重新解离，一旦找到正确的互补区，则其局部双链形成核（成核反应），然后核两侧的序列迅速配对，形成完整的双链分子。3、杂交n来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。n杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。n核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。简述影响核酸分子杂交的因素：v10 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。v离子强度：高离子强度溶液中，正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，削除相互间的静电斥力，有利于杂交分子形成。v温度：通常在低于Tm20-25℃的温度下进行杂交。v添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸等，因其表面可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。v杂交条件的严谨性：指杂交反应体系中，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。它主要与杂交反应的温度、离子强度和洗膜的温度有关。实际操作时，一般采用较低严谨性杂交以提高反应速率，以较高严谨性洗膜以尽量洗去非特异性结合和配对较差的探针，以提高特异性。名词解释：预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交。核酸探针定义：核酸探针是指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带有特殊的标记物。原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。名词解释转录：以DNA为模板的RNA的酶促合成。这是基因表达全过程的第一步，并最终导致由基因所编码蛋白的合成。转录由RNA聚合酶催化，它需要双链DNA模板与前体核糖核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP有义链：通常两条DNA链中只有一条会转录成RNA，RNA的序列就是有义链上脱氧核苷酸序列的直接拷贝(以U替代T)。反义链：也称模板链，因为它用作RNA合成过程中核糖核苷酸碱基配对的模板RNA聚合酶负责RNA的合成(转录)，其核心酶由2α、1β、1β’，和1ω亚基组成，负责转录延伸。σ因子对于转录的正确起始是必需的。因此核心酶加上σ因子所组成的完整的酶称为全酶。－10序列：－10序列是几乎所有启动子都含有的一个6bp的序列。该六聚体通常位于转录起点上游10bp处。共有的－10序列是TATAAT。－35序列：－35序列是另一个在大多数启动子中都可找到的6bp序列。该六聚体一般位于转录起始点上游35bp处。共有的－35序列是TTGACA。论述题：论述：蛋白质合成体系。论述：原核生物的转录论述：原核生物蛋白质合成的机理10