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实验二培养基制备和灭菌技术一、实验目的1.学习一般培养基的制备方法。2.掌握高压蒸汽灭菌技术,了解几种常用的灭菌方法。二、实验原理(一)培养基培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质,用人工的方法配制而成的一种基质。它是微生物的生活环境,各种微生物对养分和培养基的物理、化学要求条件不一样,为了分离、培养、鉴定、保藏和研究不同种类的微生物,就应当根据它们的需要,配制合适的培养基。微生物在培养基上生长发育,必须在一定的最适酸碱度范围才能表现出它们最好的生命活动力。不同的微生物对酸碱度的要求不同,因此,我们在配制培养基时,必须调节培养基的pH值。培养基的种类繁多,根据培养基的成分、物理性状不同,可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。1.天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质配制而成,如马铃薯、玉米粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等,这些复杂天然有机物质的成分不完全了解,每次所用的原料,其中各成分的数量也不恒定的天然有机物质配制成的培养基,如牛肉膏蛋白胨、马铃薯、麦芽汁培养基。它适用于生产上大规模培养微生物。2.合成培养基:合成培养基是用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基,也称化学成分明确的培养基,例如高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、代谢、分类鉴定、生物测定、菌种选育和遗传分析等工作。3.半合成培养基:在以天然有机物作为微生物营养来源的同时,适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长,因此,应用广泛,如马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基,大多数霉菌都生长良好。4.固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基,常用凝固剂有洋菜、明胶、硅胶,硅胶用于配制自养微生物的固体培养基;对于其他多数微生物来讲,洋菜最为合适,一般加入1.5~2.5%即可凝固成固体,如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保存等。5.半固体培养基:在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基,如加入0.2~0.7%洋菜作为凝固剂。用来观察细菌运动特征、菌种鉴定、菌种保存和噬菌体的效价测定等。6.液体培养基:不加任何凝固剂配好后成为液体状态的培养基。如糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。常用于大规模的工业发酵生产、遗传学研究、生理代谢等基本理论的研究工作。根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
(1)基础培养基:含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质,常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基,也是作为某些特殊培养基的基础成分。(2)加富培养基:是在基础培养基中加入血、血清,动物、植物组织提取液,主要用于对培养某些微生物要求比较苛刻的营养。(3)选择培养基是根据某一类或某一种微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。一种是根据某些微生物对碳、氮源等营养的特殊要求所设计的选择性培养基,就可以分离到能分解某些物质的微生物。如以纤维素作唯一碳源的选择性培养基,可以分离到分解纤维素微生物;无氮培养基可以分离到固氮微生物。另一种是根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性而设计的培养基,最常用的是在培养基中加入某些化学物质,以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时,在培养基中添加10%的酚或链霉素数滴可抑制细菌和霉菌的生长,又如分离霉菌的马丁氏(Martun)培养基。(4)鉴别培养基是在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂,某种微生物在这种培养基上培养后,它所产生的某种代谢产物与某种化合物或化学试剂能发生某种明显的特征性反应,根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别开来,如糖发酵培养基、伊红美蓝培养基等。(二)灭菌消毒与灭菌两者有不同的概念。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言,而不能杀死全部芽孢,因此,消毒只是一种常用的卫生措施;灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子,因此,灭菌后的物品是无菌的。灭菌的方法很多,有加热、过滤、照射和化学药品等。1.加热法:又分干热灭菌和湿热灭菌两种。(1)干热灭菌:有火焰烧灼和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具(如镊子)等,无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。我们通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内灭菌,此法适用于玻璃器皿(如吸管和培养皿)等的灭菌,在热空气160~170℃下保温2小时进行灭菌。(2)湿热灭菌:①高压蒸汽灭菌法。此法时将物品放在高压蒸汽灭菌锅内1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3℃保持15~30分钟进行灭菌,时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化,以到达彻底灭菌为目的。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。②间歇灭菌法。有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏,则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌,将灭菌培养基放入灭菌器内,每天加热100℃,30分钟,连续3天,第一天加热后,其中的营养体被杀死,将培养物去出放37℃下培养18~24小时,使其中的芽孢发育成营养体,第二天再加热100℃,30分钟,发育的营养体又被杀死,但可能仍有芽孢,故再重复一次,以达到彻底灭菌。③煮沸消毒法。注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间10~15分钟,人用注射器和手术器械在有条件的地方,一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。表2-1蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含量/%30分钟内凝固所需的温度/℃50562574~801880~90
61450160~170表2-2灭菌锅留有不同分量空气时,压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度/℃2/3空气排出时的温度/℃l/2空气排出时的温度/℃l/3空气排出时的温度/℃空气全不排出时的温度/℃MPaKg/cm2Ib/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121_3126.2130.0l34.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121现在法定压力单位已不用磅和kg/cm2表示,而是用Pa或bar表示,其换算关系为:1kg/cm2=98066.5Pa;1Ib/in2=6894.76Pa。表2-3干热湿热穿透力及灭菌效果比较温度/℃时间/h透过布层的温度/℃灭菌20层10层100层干热130~140湿热105.343861017210170.5101不完全完全2.过滤除菌;3.紫外线灭菌;4.化学药品灭菌等三、实验用品(一)器材台秤、三角瓶、试管、漏斗、电炉、搪瓷杯(铝锅)、试管架、玻璃棒、滴管、称量纸、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、棉线、灭菌锅、干燥箱等。(二)试剂NaCl、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、K2HPO4、HCl、NaOH、洋菜(琼脂)、葡萄糖、蔗糖、NaSO4、黄豆芽、马铃薯等。四、实验操作1.一般培养基的配制(1)称量:按照培养基配方,称取各种成分。(2)熔化:在容器中先加入所需蒸馏水水量的一部分,依次将各成分加入,使全部溶解,最后补足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物质配制培养基时,需加热溶解,并补足因蒸发而减少的水分。配制固体培养基时,先将上述配好的液体培养基加热到快沸时,再将称好的洋菜(琼脂)加入,继续加热到琼脂完全溶化,在加热溶解过程中要不断搅拌,以免洋菜(琼脂)糊底,同时控制火力,防止培养基沸腾时外溢。(3)矫正pH值:初配制好的培养基,往往不能符合所需求的pH值,因此必须矫正,用精密pH试纸,以1NHCl或1NNaOH调节至所需要的pH值。
(4)过滤:用滤纸、棉花或双层纱布过滤。(5)分装:根据不同的需要,可将制成的培养基分装于三角瓶或试管内,分装时取玻璃漏斗一只,装在漏斗架上,漏斗下连接橡皮管与一根玻璃管相接,橡皮管上夹一只弹簧夹,将培养基到入漏斗内,用左手拿空试管的中部,并将漏斗下玻璃管插入试管内,以右手拇指和食指开放弹簧夹,中指及无名指夹住玻璃管上端,使培养基流入管内。注意不要使培养基沾污上段管壁及管口,保持棉塞的干净。分装量根据试管大小和实际需要而定。制备试管斜面培养基时,每支的分装量约为管高1/5左右为度,液体培养基分装试管的量以管高的1/4左右为宜,三角瓶的分装量,不宜超过三角瓶的一半。图2-1培养基的分装图2-2斜面的摆法(6)棉塞的制作与灭菌:棉塞要做的形状、大小、松紧完全合适,紧贴管壁不留缝隙,正常的棉塞,头稍大些,约有2/5在外,3/5在试管内,塞好棉塞后,用牛皮纸包扎,置高压蒸汽灭菌锅中灭菌。
图2-3棉塞制作(引自沈萍等,2001)(7)斜面培养基的制作:固体培养基经灭菌后,如果要做成斜面,则在取出试管后略为冷却,而后放置桌上,管口端放在木条上或其他支持物上,使其倾斜,倾斜度以培养基正好形成斜面为准。(8)无菌试验:培养基经灭菌后,必须先放进37℃恒温箱内,经24小时后,若无微生物生长才能使用。2.灭菌灭菌是微生物生产和实验的基本操作技术,其方法很多。因灭菌对象及设备条件不同而适当选用。下面分别介绍几种常用的灭菌方法。(1)干热灭菌这种灭菌法是利用热空气使物体升温,而导致物体上所带的微生物由于干热脱水而死亡。常用于空玻璃器皿、金属用具等的灭菌,对于带胶皮的物品、液体及固体培养基等不能使用此法灭菌。使用步骤:①将要待灭菌的器皿(培养皿、吸管等)包扎好,放入恒温干燥箱内。②接通电源,打开开关;将恒温调节器调至160℃,当达到此温度时,借助恒温调节器的自动控制,保持恒温两小时。③两小时后,关掉电源,当温度降至与室温差不多时,打开箱门,去出灭菌物品。
1.门拉手2.箱门3.观察窗4.风量调节5.隔板6.铭牌7.密封圈8.温控9.开关10.指示灯图2-4恒温干燥箱注意事项:①灭菌的器皿必须干燥,否则容易破裂。若没有干燥需预热烤干。②灭菌的温度不能超过180℃,否则棉花、报纸、牛皮纸要烧焦,甚至发生事故,所以在使用时,要随时检查温度情况,以防自动恒温调节器失灵。③灭菌后,假如温度没下降就打开箱门,冷空气突然进入箱内,玻璃器皿就要破裂;同时,热空气冲出,有灼伤皮肤的可能。因此,必须在温度降至与室温差不多时方可开箱门。(2)高压蒸汽灭菌此种灭菌方法的原理是在一密闭容器内,煮沸时形成的蒸汽不能扩散到容器外面去,而堆积在密闭的容器内,使蒸汽压力升高,随着水的煮沸,温度也就相应地增高。利用过热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性,以致失去生命力,从而达到彻底灭菌的效果。高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3℃保持15~30分钟进行灭菌,就可杀死一切微生物细胞及其芽孢或孢子。进行高压蒸汽灭菌的仪器叫高压蒸汽灭菌锅。灭菌对象是培养基、玻璃器皿和各种不因高温处理而变质的物品材料。但对一些不耐高温、高压的溶液或培养基不宜用此种方法。①锅内加入适量的水,使水面与三脚搁架相平为宜。②打开灭菌锅盖,把要灭菌的材料装入锅内,注意不要放得太挤,以防碍蒸汽的流通,影响灭菌效果。③
盖好灭菌锅锅盖,按对角线形式均匀拧紧锅盖上的螺栓,螺栓松紧一致,切勿漏气。④打开排汽开关,以排除锅内的冷空气。⑤打开电源,排除冷空气。水沸腾后,灭菌锅内就逐渐充满蒸汽,并将冷空气排出,待冷空气完全排尽后,关闭排汽阀。让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升,当锅内压力升到所需压力时。控制热源,维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2(15磅/英寸2),121.3℃保持15~30分钟。⑥灭菌所需时间到后,关闭热源。⑦让灭菌锅内温度自然下降,当压力降至“0”时,打开排汽开关。⑧打开灭菌锅盖,拿出已灭菌的物品及培养基。⑨将取出的灭菌培养基放入37℃恒温箱中培养24小时,经培养若无微生物生长,即可使用。⑩注意事项:如果压力未降到“0”时,打开排汽阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。图2-5立式灭菌锅(3)间隙灭菌有少数培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等,用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌营养均会受到破坏,则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌,将灭菌培养基放入灭菌器内,每天加热100℃,30分钟,连续3天,第一天加热100℃,30分钟后,其中的营养体被杀死,将培养物去出放37℃下培养18~24小时,使其中的芽孢发育成营养体,第二天再加热100℃,30分钟,发育的营养体又被杀死,但可能仍有芽孢,故再重复一次,以达到彻底灭菌。(4)紫外线灭菌紫外线是一种很强杀菌剂,其波长在2000Å~3000Å之间都具有杀菌作用,其中以2500Å~2800Å者杀菌力最强。它的杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成,从而抑制了DNA的复制;另一方面,由于辐射能使空气中的氧电离成[O],再使O2氧化成O3或使水H2O氧化生成H2O2,O3和H2O2
均有杀菌作用。它的杀菌作用随剂量的增加而增加,不同微生物对紫外线的敏感性是不同的。一般细菌经紫外线照射5~10分钟,即可死亡。接种室和接种箱常紫外线灯光作空气灭菌。由于紫外线穿透力不强,故一般只适用于物体表面和环境的灭菌。为了加强紫外线的灭菌效果,在开灯以前,可以在接种室内喷雾苯酚溶液。也可将室内的桌面和坐凳可用0.1%新洁尔灭溶液擦洗,然后再开紫外线灯光照射20~50%分钟(视接种室大小而定),以杀死空气中各种微生物细胞及芽孢为原则,必要时,可做无菌检查,以检查灭菌效果。(5)微孔滤膜过滤除菌(1)组装、灭菌将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中,旋紧压平,包装灭菌后待用(0.1MPa,121.5℃灭菌20min)。(2)连接将灭菌滤器的入口置于在无菌条件下,以无菌操作方式连接在装有待过滤溶液(2%葡萄糖溶液)的注射器上,将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。(3)压滤将注射器中的待过滤溶液加压并缓缓挤入过滤到无菌试管中,滤毕,将针头拔出。压滤时,用力要均匀,切不可太猛太快,以免细菌被挤压通过滤膜。(4)无菌检查无菌操作后吸取除菌滤液0.1ml于牛肉膏蛋白胨平板上,用三角涂棒均匀涂布,置37℃温室中培养24小时,检查是否有细菌生长。(5)清洗弃去塑料滤器上的微孔滤膜,将塑料滤器清洗干净,并换上一张新的微孔滤膜,组装包扎,再经灭菌后继续使用。整个过程应在无菌条件下严格无菌操作,以防污染。过滤时应避免各连接处出现渗透现象。五、实验建议1.使用灭菌锅应严格按照操作程序进行,避免发生事故;灭菌时,操作者切勿擅自离开;务必待压力下降到零后,才可打开锅盖。2.干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤,以免阻碍空气流通而影响灭菌效果;灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触,以防包装纸烤焦起火。3.过滤除菌时应注意检查过滤装置各连接处是否漏气,以防污染。六、实验报告及作业1.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高,时间长?请设计干热灭菌与湿热灭菌效果比较实验方案。2.高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要把灭菌锅内的冷空气排尽?灭菌完毕后,为什么要待压力下降到“0”时才能打开排气阀,开盖取物?3.细菌营养体和细菌芽孢对紫外线的抵抗力一样吗?为什么?书是我们时代的生命——别林斯基
书籍是巨大的力量——列宁 书是人类进步的阶梯———高尔基 书籍是人类知识的总统——莎士比亚 书籍是人类思想的宝库——乌申斯基 书籍——举世之宝——梭罗 好的书籍是最贵重的珍宝——别林斯基 书是唯一不死的东西——丘特 书籍使人们成为宇宙的主人——巴甫连柯 书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔 人的影响短暂而微弱,书的影响则广泛而深远——普希金 人离开了书,如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫
书不仅是生活,而且是现在、过去和未来文化生活的源泉——库法耶夫 书籍把我们引入最美好的社会,使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯 书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的,是富有启发性的养料。而阅读,则正是这种养料———雨果