临床微生物学检验

1．临床微生物学的概念是什么？临床微生物学是研究微生物的形态、结构、分类、生命活动规律的一门科学，包括细菌学、病毒学、真菌学等。是临床医学的基础之一，指导感染性疾病的诊断、治疗和预防。2．临床微生物学实验检查大概分几步骤？①从患者标本分离培养微生物。②对标本中分离到的微生物进行培养、鉴定。③进行药物敏感性试验，解释和预报结果。④阶段性分析药物敏感性实验，预测耐药趋势，监控和指导临床合理用药。3．什么是感染性疾病及影响因素？凡是由病原微生物引起的疾病统称为感染性疾病，而感染性疾病的发生主要与病原体的侵袭力及宿主的抵抗力密切相关。别外，临床上抗生素的大量滥用，引起了正常菌群失调和大量耐药菌株的出现，从而加重了机体的内源性感染机率，这一定程度又加重了感染性疾病的发生。4．临床医师主要需要从临床微生物学实验室得到什么？①能为临床提供医学决策的相关信息。②指导临床正确收集标本的原则。③安全及时的送检标本。④微生物的正确鉴定和药物敏感性试验结果。⑤能快速地报告实验结果，并做出相关的结果解释。⑥能及时反馈医院内细菌感染分布、耐药状况和流行趋势等。5．临床医师应如何避免感染性疾病的爆发流行？①遵循病原学诊断，避免无指症用药。②正确及时的采集标本，按要求及时送检微生物实验室检查。③重视实验室的鉴定及药敏结果，结合临床患者病情合理使用抗生素。④注意经验性治疗与靶向治疗相结合，依据病原学诊断及时调整治疗方案，改为针对性治疗。⑤加强同临床微生物实验室交流沟通，积极配合实验室做好院内感染监测、预防和控制工作。6．临床标本采集的一般原则是什么？①在最适宜的时间收集标本，最好在使用抗生素之前或感染急性期采集。②采集标本要有代表性和针对性，不同情况应区别对待，适宜地采取相应的方法收集标本，如尿液标本疑为厌氧菌感染时，应行耻骨上缘穿刺术取膀胱尿培养。③采集标本必须来自实际感染的部位，严格无菌操作尽可能避免外源性污染。④收集标本应当使用合适的收集器材、容器和培养基，以保证最大限度的发现微生物。⑤标本采集、运送过程中要有专人负责，避免人为操作失误。⑥采集标本不仅要防止被污染，同时也要注意安全，防止传播和自身感染。7．采集过程中需要加抗凝剂的标本应注意什么？对任何容易形成凝块的标本都应使用抗凝剂，因为如微生物被已凝固的物质包围，生长较困难。另外，像胸水、腹水等液体标本一旦凝固，很难接种培养，直接影响微生物的培养鉴定。目前，微生物学标本最常用的抗凝剂是多聚茴香脑磺酸钠SPS（Sodiumpolyanetholsulfonate），但其浓度不得超过0.025%(W/V)，否则会抑制一些奈瑟菌和厌氧性链球菌的生长。肝素也是常用抗凝剂之一，主要用于病毒培养，因为它能抑制革兰氏阳性菌和酵母菌的生长。柠檬酸盐和乙二胺四乙酸通常不用于微生物学标本。8．标本运送过程中应注意些什么？30 标本采集后，除了要及时送检外，另外在运送过程中要注意尽量保持标本的原有性状。对于不能及时送检的要用专用运送培养基运送，而对一些含有脆弱细菌的标本，需加入特别的保存剂。例如，尿液中加入硼酸能有效地抑制细菌生长，较好的保持尿液中菌落的数量；粪便中加入磷酸盐缓冲液有助于保持粪便中像志贺菌、沙门菌等的脆弱细菌。此外，甲醛溶液、绍丁溶液有助于保存寄生虫的滋养体和包囊，使其维持便于识别的形态。8．如何采集血液标本及注意事项？疑为菌血症或败血症时，一般情况下应在病人发热初期或发热高峰时采集，原则上应在抗菌治疗前尽早取血做细菌培养。若已用抗菌药物或疗效不佳时，在可能条件下停药24小时后再做血培养。连续做血培养3次，各次采血应在不同部位的血管穿刺，禁从静脉插管内抽血。当骨髓炎时或长期使用抗菌药物患者，抽取骨髓培养阳性率会远高于血液培养。对成人每瓶血培养应采血8～10ml，婴儿为1～2ml，儿童3～5ml，骨髓为1～2ml。如不能及时送检，应将已注血的培养瓶在室温存放，并不得超过12小时。注意事项：①不能用碘酒消毒瓶盖，只需70％酒精消毒瓶盖。②严格作好患者抽血部位的无菌操作。③同时作厌氧和需氧培养时应先将标本接种到厌氧瓶中，然后再注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。④如不能及时送检应于室温存放，切勿放冰箱存放。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　10．采集痰标本时应注意些什么？当疑为呼吸道感染性疾病时，应让患者取晨痰送检。取痰前用清水反复漱口后用力自气管咳出第一口痰于灭菌容器内，立即送检。对于痰量少或无痰的患者可采用支气管镜或气管穿刺法取得。为了避免污染菌的干扰，最好连查3次。注意事项：①采集标本以清晨为佳，为减少口腔正常菌群污染标本，采集前应充分漱口。②取痰标本应是深部的痰液而不是唾液，否则会影响检查结果。③作结核分枝杆菌检查，痰量要多或留取24小时痰液，婴儿肺结核要用胃管取痰。④约有1／4～1／2肺部感染患者可能发生菌血症，应同时作血培养。⑤对一些特殊患者可采用支气管镜采集法及气管穿刺法取痰。11．如何采集尿液标本及注意事项？临床上有泌尿系统感染、肾结核、结石和无症状性菌尿等疾病指征时，通常应采集晨起第一次尿液（中段尿）送检。原则上应选择在抗菌治疗前采集，若已用药应停药一周后采集尿液送检。采集标本前，女性先以肥皂水清洗外阴部，再以灭菌水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗尿道口，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌容器内，立即加盖送检。男性先用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗，就可采集中段尿。包皮过长者，为防止污染，可将包皮翻开冲洗，再取中段尿。疑为尿道炎时，可将最初3～4ml尿收集在灭菌容器中。如反复检查为同一细菌，也应考虑为病原菌。必要时可采用膀胱穿刺术取尿。注意事项：①尿液标本的采集和培养中最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作。②尿液标本采集后应尽快送检（1－2小时内），否则会影响细菌检查的正确性。③多数药物均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液均宜在用药之前进行。④尿液中不得含有防腐剂或消毒剂。⑤疑为结核分枝杆菌时，可用清洁容器，留24小时尿取其沉渣10～15ml送检。12．穿刺液包括哪些？采集中应注意些什么？穿刺液主要包括脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等。在正常人体中，上述体液均是无菌的，有感染的情况下检出的细菌，应视为病原菌，应给予及时正确的治疗。怀疑为脑膜炎的病人，用腰穿方法采集脑脊液2ml左右，在常温下15分钟内送检。标本不可置冰箱内保存，否则会使病原菌死亡。胆汁及其它穿刺液采集到无菌针管或无菌试管内立即送检。注意事项：①标本采集应在用药之前。②严格无菌操作，避免污染。③作脑脊液培养时，建议同时作血培养。④为防止穿刺液的凝固，最好在无菌试管中先加入灭菌肝素。30 13．创伤和化脓性标本采集方法是什么？软组织的急性化脓性炎症、化脓性疾病、脓肿和创伤感染等疾病可根据临床要求取标本送检。对开放性感染和已溃破的化脓灶，标本采集前先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用灭菌拭子采取脓液及病灶深部的分泌物。如为慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，　　可取感染部位下的组织，研磨成组织匀浆后送检。闭锁性脓肿可行手术引流或穿刺法取标　本于灭菌容器或灭菌注射器内送检。注意事项：①尽可能在用药前采集标本，采集前一定要作好清洗、消毒工作。②不能立即送检的标本，应放4℃保存；培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。③深部脓肿常由包括厌氧菌在内的混合细菌感染所致,若有条件应作厌氧菌培养，采集标本应遵守厌氧菌感染标本的采集原则。14．粪便标本培养应如何采集？腹泻为大便送检的重要指征，婴幼儿和小儿可见高热惊厥。当疑为细菌性痢疾、肠炎、肠结核和顽固性腹泻时，应在急性期采集，亦最好在用药之前，以提高检出率。肠热症患者应在两周以后采集。采用自然排便法或直肠拭子法，挑取有脓血，粘液部位的粪便2－3ｇ置于无菌容器中送检。注意事项：①为提高检出率，要采集新鲜粪便作培养。②腹泻病人应尽量在急性期采集标本（3天以内），以提高阳性率。③虽粪便含有多种杂菌，但应尽量采用无菌容器。15．生殖道标本的采集原则和注意事项是什么？当疑为生殖道感染性疾病时，首先排除是否有不洁性交史，然后根据症状确定检查方向。对于男性患者来讲，先检查尿道是否有脓性分泌物，再依次是前列腺液、精液。采集标本时应清洗尿道口，再用无菌拭子擦取尿道口脓性分泌物或深入尿道内2-4厘米取分泌物，检查精液患者应禁欲5天以上，采用体外排精法射精于灭菌容器送检。对于女性患者，先用窥器扩张阴道，然后用灭菌棉拭子取阴道后穹隆处或宫颈分泌物作培养或涂片镜检。注意事项：①生殖器是开放性器官，标本采集过程中应遵循无菌操作以减少杂菌污染。②阴道内有大量正常菌群存在，采取宫颈标本应避免触及阴道壁。③疑产妇有宫腔感染，待胎儿娩出后取宫腔分泌物，并同时取婴儿耳拭子一同送检。④沙眼衣原体在宿主细胞内繁殖，采集时尽可能多的取上皮细胞。16．哪些标本不能作厌氧菌培养及如何运送标本？痰、支气管镜采样(无特殊保护套)、咽拭子、排出的尿及阴道拭子不能做厌氧菌培养，粪便标本厌氧菌培养，只能做难辨梭菌的培养。在运送中最常用的是注射器运送法，此外还有无氧小瓶运送法、棉拭运送法、组织块运送法、大量标本运送法。标本采集后应尽快送到实验室，最迟不超过半小时。标本不应放在冰箱里，因为低温对一些厌氧菌有害。17．细菌的超微形态及革兰氏阳性和阴性菌的区别如何？细菌是一类原核细胞型微生物，体积微小，基本形态有球形、杆形和螺形三种。之所以称原核是指其核则不是一个具体的结构，没有核膜。细菌的基本结构包括细胞壁、细胞膜、细胞浆、核质和胞浆颗粒等。除动物细胞无细胞壁外，各类生物的细胞具有不同的细胞壁。例如，植物的细胞壁由纤维素构成，霉菌的细胞壁则为几丁质，细菌细胞壁的成分为肽聚糖、垣酸和脂多糖。革兰氏阳性菌细胞壁厚，肽聚糖骨架通过四肽侧链和五肽桥连接成为三维空间。不含有芳香氨基酸和含硫氨基酸。革兰氏阴性细菌的细胞壁薄，除少量肽聚糖构成细胞壁的内层外，由大量脂多糖构成其外层，并有脂蛋白形成镶嵌结构，其中含有芳香氨基酸和含硫基酸。30 18．细菌的特殊结构都有哪些？其功能是什么？细菌的特殊结构主要有鞭毛、菌毛、荚膜和芽胞。鞭毛是细菌的运动器官，由简单的角蛋白–肌蛋白组成。菌毛分为普通菌毛及性菌毛两种，普通菌毛能与宿主细胞表面的菌毛受体相结，发挥粘附作用，而性菌毛中空呈管状，能在细菌之间通过接合传递遗传物质，故性菌毛与细菌的遗传变异有关。荚膜是细胞壁外的一层多糖物质具有抗原性，能抵抗机体吞噬细胞的吞噬作用。芽胞是某些细菌的繁殖体，在一定环境条件下，由于胞浆脱水浓缩而成一个圆形或卵圆形小体，具有多层膜结构，对外界理化因素抵抗力强，可潜伏数年或几十后重新繁殖生长。19．什么是L型细菌？其形成原因？L型细菌是一类细胞壁缺陷的细菌，形态各异大小不一，染色时不易着色，且着色不均匀，革兰阳性菌和革兰阴性菌均可形成，又称为“原生质体和原生质球”，凡能破坏肽聚糖结构都可诱导细菌形成L型，其表现为具有明显的多形性，革兰染色阴性，能通过细菌滤器，对渗透压敏感。L型细菌的主要意义在于仍有致病性，能引起间质性炎症。而且是临床上感染漏诊的主要原因之一。20．脂多糖由哪几部分组成？其功能是什么？脂多糖是由类脂和多糖组成，是革兰阴性菌的内毒素，包括类脂A、核心多糖和特异多糖等三部分。类脂A是内毒素的毒性分子，与细菌的致病性有关，无种属特异性，故不同的革兰阴性菌感染时，其毒性大致相同。核心多糖具有细菌属和组的特异性，同一属和组的细菌，其核心多糖均相同。特异性多糖是脂多糖的最外层，构成重要的菌体表面抗原，从而决定了种或型的特异性。21．如何才能更好的发现和鉴定微生物？首先，选择适合特定标本类型的初次培养基，为了发现所有潜在的重要致病菌，还应选择适当的孵育温度和气体。其次，对初次培养基上所发现的分离物应确定它们进一步鉴定的内容。最后，在已鉴定的细菌中确定哪种要进行抗微生物敏感性试验。22．正常菌群的含义是什么？人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种通道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。它们在与宿主的长期进化过程中，微生物群的内部及其与宿主之间互相依存、互相制约，形成一个能进行物质、能量及基因交流的动态平衡的生态系统习惯称之为正常菌群（Normalflora）。正常菌群大部分是长期居留于人体的又称为常居菌，也有少数微生物是暂时寄居的，称为过路菌。23．正常菌群的生理作用是什么？①生物拮抗作用：正常菌群通过粘附和繁殖能形成一层自然菌膜,是一种非特异性的保护膜,可促机体抵抗致病微生物的侵袭及定植,从而对宿主起到一定程度的保护作用。正常菌群除与病原菌争夺营养物质和空间位置外，还可以通过其代谢产物以及产生抗生素、细菌素等起作用。可以说正常菌群是人体防止外袭菌侵入的生物屏障。②刺激免疫应答：正常菌群释放的内毒素等物质可刺激机体免疫系统保持活跃状态，是非特异免疫功能的一个不可缺少的组成部分。③合成维生素：有些微生物能合成维生素，如核黄素、生物素、叶酸、吡哆醇及维生素K等，供人体吸收利用。④降解食物残渣：肠道中正常菌群可互相配合，降解末被人体消化食物残渣，便于机体进一步吸收。24．什么是条件致病菌和菌群失调？30 在一定条件下，正常菌群中的细菌也能使人患病：①由于机体的防卫功能减弱,引起自身感染。例如皮肤粘膜受伤（特别是大面积烧伤）、身体受凉、过度疲劳、长期消耗性疾病等，可导致正常菌群的自身感染；②由于正常菌群寄居部位的改变，发生了定位转移，也可引起疾病。例如大肠杆菌进入腹腔或泌尿道，可引起腹膜炎、泌尿道感染。因此，这些细菌称为条件致病菌。在正常情况下，人体和正常菌群之间以及正常菌群中各细菌之间，保持一定的生态平衡。如果生态平衡失调，以至机体某一部位的正常菌群中各细菌的比例关系发生数量和质量上的变化，称为菌群失调。25．引起菌群失调的原因有哪些？菌群失调的常见诱因主要是抗生素、同位素、激素的不合理使用，另外患有慢性消耗性疾病时肠道、呼吸道、泌尿生殖道的功能失常也是重要原因。去除诱因后一般可使菌群复常，也有长期失调难于逆转的情况。26．临床上常见菌群失调症有哪些？临床上常见的菌群失调症有：①耐药性葡萄球菌繁殖成优势菌而发生腹泻，偶尔发生致死性葡萄球菌脓毒血症；②变形杆菌和假单胞菌生长旺盛并侵入组织发生肾炎或膀胱炎；③白色念珠菌大量繁殖，引起肠道、肛门或阴道感染，也可发展成全身感染；④艰难梭菌在结肠内大量繁殖，并产生一种肠毒素及细菌毒素，导致假膜性肠炎。27．常用培养基有哪几种？其成分主要是什么？常用培养基有普通培养基、营养培养基、选择培养基和增菌培养基。培养基的主要成分有氮源、碳源、无机盐、水分及一些生长因子，它们主要为细菌的生长繁殖提供营养和生长环境。28．通常培养基中根据需要可加入哪些抑制剂和指示剂？依据细菌生长代谢特性，可选择性的加入某些抑制剂和指示剂。常用抑制剂有胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠、亚硒酸钠、某些染料以及多种抗生素物质。常用指示剂有酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、溴酚红、中性红、中国蓝、甲基红、酸性复红等。29．标本接种技术有几种？①平板接种法：初次接种成功后，连继划线或分四区划线接种。②液体接种法：将试管倾斜30度角，接种环触到试管的内壁研磨数次，然后让试管回复到原来的直立位置淹没接种部位，这样可以避免气泡的产生。③琼脂斜面接种法：首先将接种针插入斜面正中，垂直刺入底部，抽出接种针令其在斜面琼脂上作S形划线。④穿刺接种法：本法多用于双糖、半固体或明胶等高层培养基的接种，由培养基中央刺到距管底约半厘米处，然后沿穿刺线退出接种针。⑤倾注培养法：该法常用液体标本的细菌定量计数。方法是用无菌吸管吸取原标本或经适当稀释的标本各1ml，分别置于直径为9cm的无菌平皿内，倾入已融化并冷至50℃左右的培养基约15ml，立即混匀待凝固后倒置于35±1℃培养18～24小时，做菌落计数。30.细菌产生耐药性的机制有哪些?①细菌产生可破抗生素或使之失去抗菌作用的酶。如β-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、拓扑异构酶等。②对抗菌药物的渗透性降性。主要表现：外膜通透性降低及药物泵出系统。③抗生素作用靶位的改变。如细菌的青霉素结合蛋白改变，导致对β-内酰胺类抗生素的耐药。④代谢途径的改变。如在肠球菌培养基中加入亚叶酸，肠球菌利用亚叶酸后可对磺胺-甲氧嘧啶由敏感转为耐药。30 31．β-内酰胺酶的分类及作用机制是什么？β-内酰胺酶是一群酶，根据分子学结构可将其分为四群。①A群β-内酰胺酶为丝氨酸蛋白酶，主要作用于青霉素类药物，编码基因位于染色体或质粒上，可从一个细菌转移至另一个细菌。②B群β-内酰胺酶为金属酶，其活性部位为结合锌离子的硫醇基。③C群β-内酰胺酶主要是头孢菌素酶，存在于革兰氏阴性菌染色体上，可被诱导或重组。④D群β-内酰胺酶为苯唑西林酶。大量试验证实，β-内酰胺类抗生素和细胞壁前体的存在都可以诱导β-内酰胺酶的合成，其作用机制为β-内酰胺酶与催化细菌细胞壁肽聚糖合成的青霉素结合蛋白空间结构相似，可竞争性水解药物β-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性，其水解效率是细菌耐药性的主要决定因子。32．临床上重要的β-内酰胺酶主要有哪几种？①超广谱β-内酰胺酶，主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌产生，对第三代头孢和氨曲南耐药，而对碳青霉烯类和头霉烯类敏感。②对β-内酰胺抑制剂敏感性下降的β-内酰胺酶，主要原因之一是菌株β-内酰胺酶的过度表达，另一机制就是产生诱导耐酶抑制剂的β-内酰胺酶，常表现对酶抑制剂复合药的敏感性下降，而对第一代头孢菌素敏感。③质粒介导的AMPC酶，常见于克雷伯菌、弗劳地枸椽酸杆菌、阴沟杆菌、奇异变形和蜂房哈夫尼菌等，表现对一代至三代头孢菌素、头霉素类、氨基糖苷类耐药，但对碳青霉烯类、四代头孢菌素和喹诺酮类敏感。④水解碳青霉烯类的β-内酰胺酶，常见铜绿、鲍曼等非发酵菌属，表现以碳青霉烯类和单环β-内酰胺类抗生素为代表的多重耐药。33．耐酶抑制的广谱β-内酰胺酶的产生机制是什么？如何筛选鉴别？大量含酶抑制复合药的使用，可诱导原本对酶抑制剂敏感的酶大量产生，使细菌对酶抑制剂的敏感性下降；另一机制产生了源于TEM-1、TEM-2、SHV-1和OXY-2的耐酶抑制剂的β-内酰胺酶(IRT)，大肠埃希菌最易产生IRT。区分是TEM-1、TEM-2或SHV-1的大量表达还是IRT，可用头孢菌素敏感试验鉴别，纸片法表型为阿莫西林和替卡西林耐药，对阿莫西林/克拉维酸和替卡西林/克拉维酸中介或耐药，而对头孢菌素敏感。34．常用β-内酰胺酶抑制剂有哪些？又有何区别？β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺酶有较高的亲和性，以竞争性和不可逆的抑制方式发挥作用，与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。常用β-内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。克拉维酸可由链霉菌培养液中分离得到，除了对β-内酰胺酶有抑制剂作用外，同时也可作用青霉素结合蛋白靶位，与β-内酰胺类抗生素共同影响细菌生长。舒巴坦是半合成的酶抑制剂，其抑酶作用和克拉维酸相似，但穿透革兰阴性菌外膜能力差，可抑制由质粒或染色体介导的β-内酰胺酶(Ⅰ型染色体介导酶除外)。他唑巴坦也是半合成酶抑制剂，其抑酶作用范围广，抑制作用优于克拉维酸和舒巴坦。35．β-内酰胺类抗生素的作用机制是什么？青霉素类乃至整个β-内酰胺类抗生素的作用机制是阻断肽聚糖合成的最后阶段即肽聚糖链的组装和三维结构的构建。该阶段反应通常由几种酶催化完成，如转糖基酶(催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间形成β-1,4糖苷键)、转肽酶(催化四肽侧链与五肽桥形成D-丙氨酰D-丙氨酸肽链)、羧肽酶、内肽酶等。不同的β-内酰胺类抗生素在不同程度上抑制上述酶的作用，从而抑制细菌细胞壁的完整性，使菌体形成丝状体或球形体，最终溶解死亡。36.氨基糖苷类抗生素的作用机制是什么？30 氨基糖苷类由链霉菌属和小单胞菌属发酵滤液中提取，能与细菌核糖体30S亚基发生不可逆的结合，抑制MRNA的转录和蛋白质合成，导致细菌死亡，同时该类抗生素还能依靠其离子的吸附作用，吸附在菌体的表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏使胞内的K+、嘌呤等重要生命物质外漏，为杀菌类抗生素。与细胞壁合成抑制药物联合使用时可产生协同作用，破坏细胞壁完整性，使药物易于进入菌体而达到核糖体作用靶位。37.喹诺酮抗生素的作用机制？喹诺酮类抗生素作用于DNA旋转酶，DNA旋转酶在原核细胞DNA复制过程中引入负超螺旋结构，使复制叉移动时不因张力太大而不能前进。由于药物拮抗了该酶干扰了细菌DNA复制、修复和重组，药物还能通过革兰阴性菌的外膜微孔和借助磷脂渗透作用进入细菌细胞，对繁殖期的细菌均有杀菌作用。38．糖肽类抗生素的作用机制？肽类抗生素是由氨基酸通过肽键连接而成化合物，结构上具有较大异源性，抗菌谱窄，但抗菌作用强，具有肾毒性不良反应。作用机制是与肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D丙氨酸末端形成复合物，可阻断肽聚糖合成过程中转糖基酶、转肽酶及羧肽酶的作用，从而阻止了细胞壁的合成。39．大环内酯类抗生素作用机制是什么？该类抗生素的分子结构中具有14-16原子的大脂肪内酯环，可逆的结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上抑制肽酰基转移酶，影响核蛋白位移，抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。现常用有克拉霉素、阿齐霉素等抗菌活性强、抗菌谱广的药物。40．抗菌药物敏感性试验(AST)意义方法有哪些?AST的意义：①可预测抗菌治疗效果，即AST试验结果为敏感时，治疗可能有效；试验结果为耐药时，治疗一定失败；而中介意味着高于常规治疗剂量或药物浓度集中的生理部位可能有效。②指导临床医生合理选择抗生素，可依据实验结果调整经验性治疗于靶向治疗。AST的方法：①测量药物最小抑菌浓度的琼脂稀释法和肉汤稀释法。②测量含药纸片周围直径大小的K-B纸片琼脂扩散法。③结合扩散法和稀释法原理特点的E试验。④最低杀菌浓度的测定。⑤联合药物敏感性试验，可为临床选用最有效的抗菌药物组合提供实验依据。41．耐药性的产生机理是什么？抗微生物药物对微生物群体有很强的选择压力，使天然能耐受它们的微生物或经诱导变异产生抗药抗性的微生物存活下来。微生物的变异是其进化基础，变异有多种机制，小的变异包括碱基对的点突变，可以改变抗微生物药物的作用靶点和干扰它们的活性。大的变异是一大段DNA作为一个整体重新排列，这种变化常由在染色体中可以独立移动的特殊基因单位，即转座子或插入序列产生。细菌基因的变异还可通过质粒，噬菌体或可转移的基因单位获取外源性DNA而产生。耐药性可通水平或垂直传插在不同种或同种间扩散。这种现象发生的例子如葡萄球菌盒式染色体SCCmec在获得性耐药中发挥了很重要的作用。其中SCCmec可称为抗生素耐药岛：它包含对甲氧西林产生耐药的mecA基因，有的SCCmec还包含对非β-内酰胺抗生素和重金属产生耐药的质粒和转座子。还有四环素抗性转座子在淋球菌、人支原体之间的传播。这些机制使细菌具有能产生抗任何微生物药物抗性的能力。30 42.常用的生化鉴定培养基有哪些？（一）糖发酵培养基（1）成分蛋白胨水或肉膏液（pH7.4）100ml所需糖、醇或糖苷类物质0.5～1.0g16g／L溴甲粉紫乙醇溶液0.1ml（2）制法①将上述各物质加热溶解后，分装试管。②高压（55.161kPa）灭菌15分钟，备用。③如需观察产气反应，应于分装前在试管中加一倒置的小玻管。④亦可制成半固体发酵管，即于上述成分中加入4～6g／L的琼脂，加热溶化后分试管。（3）用途观察细菌对糖、醇或苷发酵能力，用于鉴定细菌。（二）氧化－发酵（O－F）培养基（1）成分蛋白胨2g氯化钠5gK2HPO40.3g葡萄糖10g2g／L溴麝香草酚蓝溶液12ml水1000ml（2）制法①将蛋白胨、盐类加水溶解后，校正pH至7.2。②加入葡萄糖、琼脂，加热溶解后，加入指示剂，分装试管。③高压（68.95kPa）灭菌15分钟，使成高层琼脂，备用。（3）用途测定细菌分解葡萄糖的代谢类型用。（三）克氏铁琼脂（1）成分蛋白胨或多胨　20g牛肉膏3g酵母浸膏3g乳糖10g葡萄糖1g氯化钠5g拘橼酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂14g酚红0.025g水1000ml（2）制法①将上述各成分（酚红除外）混合，加热溶解，校正pH至7.4，加入酚红。②分装试管，每管约3ml。③高压（68.95kPa）灭菌15分钟，趁热取出，立即置成深底层斜面（斜面及底层约各占一半），凝固后备用。30 （3）用途鉴别肠杆菌科细菌（四）三糖铁琼脂（1）成分多胨或胨10g牛肉膏3g氯化钠5g乳糖10g蔗糖10g葡萄糖1g硫代硫酸钠0.3g硫酸亚铁0.2g琼脂15g水1000ml4g／L酚红溶液6ml（2）制法①除酚红外，将上述各成分混合。加热溶解，校正pH至7.4，加入酚红。②分装试管，每管3～4ml，高压（68.95kPa）灭菌15分钟。③趁热取出，置成底层较深的斜面，凝固后备用。（3）用途鉴别肠杆菌科细菌。（五）胰蛋白胨水（1）成分胰胨或其他含色氨酸丰富的胨1g氯化钠0.5g水100ml（2）制法①将胰胨、氯化钠加入水后，加热溶解，校正pH至7.2～7.4，分装试管。②高压（68.95kPa）灭菌15分钟即成。（3）用途细菌靛基质试验用。（六）葡萄糖蛋白胨水（1）成分蛋白胨0.5g葡萄糖0.5g磷酸氢二钾0.5g水100ml（2）制法①将上述成分混合于水中，加热溶解后校正pH至6.8～7.2，分装试管。②高压（68.95kPa）灭菌15分钟即成。（3）用途细菌甲基红，V－P试验用。（七）构橼酸盐培养基（1）成分枸橼酸钠（含2H2O）0.2g硫酸镁（含7H2O）0.02g磷酸二氢铵0.1g磷酸氢二钾0.1g30 氯化钠0.5g琼脂2g水100ml2g／L溴麝香草酚蓝乙醇溶液4ml（2）制法①将上述各成分（溴麝香草酚蓝除外）混合加热溶解，校正pH至6.8，再加入指示剂混匀，分装试管。②高压（103.43kPa）灭菌15分钟后，趁热取出置成斜面，备用。（3）用途细菌构橼酸盐及无机铵利用试验用。（八）氨基酸脱羧酶培养基（1）成分氨基酸1.0g蛋白胨0.5g酵母浸膏0.3g葡萄糖0.1g吡多醛盐酸盐0.5mg水100ml16g／L溴甲酚紫乙醇溶液0.1ml（2）制法①将上述各成分（溴甲酚紫除外）混合加热溶解后，校正pH至6.8，加入指示剂，混匀。②分装小试管，每管约0.5～1.0ml，于每管内加入液体石蜡一层（约5mm）。③高压（103.43kPa）灭菌15分钟后，备用。（3）用途鉴别肠杆菌科及弧菌科细菌用。（九）尿素培养基（1）成分蛋白胨1g氯化钠5g磷酸二氢钾2g葡萄糖0.1g尿素2g水1000ml4g／L酚红溶液3ml（2）制法①将上述各成分（酚红除外）混合，加热溶解，校正pH至6．8，再加入酚红混匀，分装试管。②高压（68．95kPa）灭菌15分钟，备用。（3）用途　鉴定细菌能否产生尿素酶。（十）Thornley精氨酸培养基（1）成分L－精氨酸1.0g蛋白胨0.1g氯化钠0.5g30 K2HPO40.03g琼脂0.3g水100ml酚红0.001g（2）制法①将上述成分（酚红除外）混合加热溶解后，校正pH至7.0～7.2，加入酚红混匀，分装小试管。②高压（103.43kPa）灭菌15分钟后，备用。③同时配制不含精氨酸的培养基作为对照。（3）用途用于检测细菌能否产生精氨酸双水解酶，主要用于肠杆菌科，假单胞菌属及非发酵菌的鉴定。（十一）甘油品红培养基（1）成分牛肉膏10g蛋白胨20g水1000ml甘油1ml100g／L碱性品红乙醇溶液0.2ml100g／L无水亚硫酸钠水溶液（新鲜配制）1.66ml（2）制法①将牛肉膏、蛋白胨、水加热溶解后，校正pH至8.0，加入甘油混匀。②高压（103.43kPa）灭菌15分钟后，备用。③临用时，加入碱性品红及亚硫酸钠液，分装试管。（3）用途鉴定沙门菌属细菌用。（十二）马尿酸钠培养基（1）成分马尿酸钠　1g肉浸液（pH7.4）100ml（2）制法①将马尿酸钠溶于肉浸液内，分装于小试管内。②高压（103.43kPa）灭菌15分钟后备用。（3）用途鉴定B群链球菌用。43.常用的生化鉴定试验有哪些?一、碳水化合物的代谢试验（一）糖类发酵试验（1）原理各种细菌含有不同的分解糖（醇、苷）类的酶，分解糖类的能力各有不同，且不同细菌分解同一种糖的代谢产物也不一定相同。细菌分解糖类后形成的代谢产物随细菌种类而异，有的产酸，有的产酸产气。可根据糖分解的特性鉴别细菌。（2）种类种类很多。常用的单糖类有：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。双糖类有乳糖、麦芽糖、蕈糖等。多糖类有菊糖、淀粉、糊精。醇类包括甘露醇、甘油、侧金盏花醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇等。30 （3）方法细菌经分离纯化后，根据待检菌的分解特性选择合适的含糖培养基，将纯种细菌接种该培养基中，置温箱内培养数18-24小时，取出观察结果。（4）结果能分解糖产酸的细菌，培养基中指示剂是否呈现酸性反应。。不能分解该糖则无颜色变化。产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒置小管内出现气泡，固体培养基则出现裂痕。（5）应用糖分解试验是细菌生化试验中最常用的生化反应。可依据细菌分解糖的能力各异而区分和识别不同的细菌。如沙门菌能发酵葡萄糖，但不发酵乳糖，大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖。脑膜炎球菌能分解葡萄糖和麦芽糖，而淋球菌只能分解葡萄糖，不分解麦芽糖。（二）氧化－发酵试验（OF试验）（1）原理细菌在分解糖的过程中，根据有无分子氧参加，分为氧化型和发酵型。能在无氧环境中不能分解葡萄糖，称为氧化型。可进行无氧降解的，称发酵型。发酵型细菌在有氧和无氧的环境中都能分解葡萄糖。兼性厌氧菌为发酵型细菌。不分解葡萄糖的细菌称产碱型。（2）方法取2支HL(Hugh-Leifson)培养管,用接种针挑取少许纯培养细菌，穿刺接种至两支培养基的管底，将其中1支在接种后加无菌液体石蜡或者凡士林在培养基表面，高度约1cm。然后将两支培养管置35℃孵育48小时后观察结果。（3）结果培养基由绿色变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，颜色不变表示不分解葡萄糖。两管培养基均变黄色为发酵型，若加液体石蜡的一管颜色不变而另一管变黄色为氧化型，两管均不变色为产碱型。（4）应用OF试验可区分细菌的代谢类型，有助于鉴别区分细菌。如肠杆菌科细菌都是发酵型细菌，绝大多数的非发酵菌为氧化型或产碱型细菌。葡萄球菌为发酵型而微球菌为氧化型。（三）七叶苷水解试验（1）原理七叶苷经细菌水解生成七叶素，七叶素能与培养基中构橼酸铁的二价铁离子结合生成黑色的化合物，使培养基变黑。（2）方法将细菌接种于七叶苷培养基上，在35℃孵育过夜。（3）结果细菌生长并使培养基变黑为阳性。（4）应用主要用于区分肠球菌、D群链球菌和其他链球菌，前两者阳性。也可用于革兰氏阴性杆菌和厌氧菌的鉴别试验。（四）淀粉水解试验（1）原理细菌产生淀粉酶可将培养基周围琼脂中的淀粉水解。加碘液后，菌落周围形成无色透明区。而琼脂中没分解的淀粉与碘作用产生蓝色。试剂可用卢戈碘液或革兰染液中的碘液。（2）方法30 将细菌划线接种或点种在淀粉血清琼脂平板或水解酪蛋白琼脂（M－H琼脂）平板，经35℃培养过夜，在菌落上滴加碘液。（3）结果菌落周围出现透明区，而其他部位培养基呈蓝色为阳性。（4）应用某些细菌如白喉杆菌具有淀粉酶，本试验呈阳性，可用此试验鉴别细菌。（五）β半乳糖苷酶试验（1）原理某些细菌具有β半乳糖苷酶，该酶可分解邻－硝基苯－β－D－半乳糖苷(ONPG)，生成黄色的邻硝基酚。（2）方法用接种环在三糖铁培养基上刮取一环新鲜菌龄的菌苔，加于无菌盐水0.25ml中制成浓菌悬液，加入甲苯1滴，充分振摇，将试管置于37℃水浴中5分钟，加入ONPG溶液0.25ml，在37℃水浴中保温，于20分钟、4小时、18小时和24小时观察结果。（3）结果出现黄色为阳性反应，不变色为阴性反应。通常在20～30分钟内显色。（4）应用此试验是测定不发酵或迟发酵乳糖的细菌是否产生半乳糖苷酶。由于细菌分解乳糖要有两种酶，一是半乳糖昔渗透酶，另一是半乳糖苷酶。当缺乏渗透酶时，乳糖不能进入细胞，乳糖分解就不能进行。这两种酶都是在乳糖存在的条件下诱导细菌产生。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG为阳性，如埃希菌属、枸橼酸杆菌属。不发酵乳糖的细菌为阴性，如沙门菌属、变形杆菌属。可用本试验作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。（六）甲基红试验（1）原理细菌在糖代谢过程中,能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸代谢为乳酸、乙酸、甲酸等,使培养基的pH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂即显红色。某些细菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少，培养基酸碱度在pH值5.4以上，加入甲基红指示剂呈黄色。甲基红变色范围为pH值4.0～6.0。（2）方法将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置35℃培养2～4天。2天后取出部分菌液滴加2滴试剂，若为阴性结果，继续培养至4天再试。（3）结果红色为阳性，橘红色为弱阳性,黄色为阴性。（4）应用可鉴别肠杆菌科内各菌属。沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、埃希菌属为阳性，肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性。较常用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的区别，前者阳性，后者阴性。（七）VP试验（4）原理30 某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步脱羧成为乙酰甲基甲醇。后者在碱性环境中被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰可与培养基中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。若培养基内含胍基太少，可加入少量肌酸、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反应。（2）培养基葡萄糖蛋白胨水培养基。（3）试剂a.奥梅拉试剂：氢氧化钾40g溶于水10ml，加肌酸0．3g。b.贝立脱试剂：甲液：6％α萘酚乙醇溶液。乙液：40％氢氧化钾。（4）方法a.奥梅拉法：将细菌接种在上述培养基内，置35℃培养48小时。在培养液2ml中加入奥梅拉试剂0.2ml，置50℃水浴中2小时或37℃4小时，充分振摇，观察结果。b.贝立脱法：接种及温育同上。在培养液2ml中加入贝立脱试剂甲液1ml及乙液0.4ml，混合后置37℃中30分钟观察结果。如为阴性应继续置37℃4小时再观察。（5）结果呈红色为阳性。（6）应用常与甲基红试验一起使用。可区别肠杆菌科细菌。本试验阳性，甲基红试验阴性，反之亦然。大肠埃希菌VP阴性而产气肠杆菌阳性。注：试剂甲液在室温阴暗处可保存1个月，乙液可长期保存。（八）甘油复红试验（1）原理细菌分解甘油产生丙酮酸，丙酮酸脱羧而为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，显紫红色。（2）方法将细菌接种于甘油复红肉汤培养基，在35℃培养8天，每天观察结果。将未接种的培养基在35℃培养，作为对照。（3）结果紫色为阳性（＋＋），紫红色为阳性（＋），与对照管颜色相同为阴性。（4）应用主要用于沙门菌属菌种间的鉴别。二、蛋白质和氨基酸的代谢试验（一）吲哚（靛基质）试验（1）原理有些具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。（2）试剂柯凡克（Kovac）试剂：对二甲基氨基苯甲醛5g，戊醇75ml，浓盐酸50ml。将对二甲基氨基苯甲醛加入乙醇内，振摇使溶，徐徐加入浓盐酸，边加边摇即成。欧氏（Ehrlich）试剂：对二甲基氨基苯甲醛4g，95％乙醇380ml，浓盐酸80％ml。配法与柯凡克试剂相同。（3）方法将细菌接种于蛋白陈水培养基中，置35℃培养1～2天，沿管壁徐徐加入柯凡克试剂或欧氏试剂0.5ml，试剂浮于培养基之上，使成两层，即刻观察结果。（4）结果两液面交界处呈现红色为阳性，无红色为阴性。（5）应用30 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。注：有些细菌产生吲哚量少，需用乙醚或二甲苯提取后才能与试剂起反应。如黄杆菌。（二）硫化氢试验（1）原理某些细菌分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。（2）方法将细菌接种于醋酸铅培养基或克氏铁、三糖铁琼脂培养基中，置35℃培养24～48小时，但惟赫夫尼亚菌需培养7天。每天观察颜色变化。（3）结果醋酸铅培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。KI或TSI琼脂在底层和斜面交界处出现黑色沉淀为阳性。（3）应用主要用于肠杆菌鉴别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属硫化氢试验阳性，但沙门菌属中也有部分菌为阴性。此外，腐败谢尔瓦菌是非发酵菌中唯一能产生硫化氢的细菌。（三）尿素酶试验（1）原理某些菌能产生尿素酶，此酶能分解尿素形成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。（2）方法将细菌接种于尿素培养基，置35℃过夜培养观察结果，阴性反应者应观察4天。（3）应用主要用于肠杆菌科的鉴定。其中变形杆菌、克雷伯菌、摩氏摩根菌、和结肠耶尔森菌、雷极普罗菲登斯菌为阳性。（四）明胶液化试验（1）原理细菌分泌的胞外蛋白水解酶，能分解明胶为氨基酸，使之失去原有的凝固力而液化。（2）方法将细菌接种于明胶培养基，在20℃培养7天，每天观察结果。若室温较高，培养基自行融化时，可在冰箱内放置30分钟后取出观察结果。明胶平板法：在营养琼脂中加入1％明胶倾注平板，可分成4个区，每区划线接种1种细菌，经1～2天培养，在培养基表面加氯化汞溶液（氢化汞12g，水80ml，浓盐酸16ml），在菌落周围出现透明带，表示细菌液化明胶。（3）结果明胶培养基半固体变成液体为阳性。明胶平板法菌落周围出现透明带为阳性。（4）应用根据细菌能否液化明胶，可有助于细菌的种、属的鉴定。如阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、沙雷菌、铜绿假单胞菌等为阳性。（五）苯丙氨酸脱氨酶试验（1）原理30 细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与氯化铁作用形成绿色化合物。（2）方法将待检细菌大量接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面,在35℃培养过夜。滴加10％三氯化铁4～5滴，由斜面培养物上方流下。立即观察结果,延长反应时间会引起退色。（3）结果斜面显示绿色为阳性。（4）应用本试验特异性较高。变形杆菌属、摩根菌属及普罗菲登斯菌为强阳性，其他肠杆菌科细菌大多为阴性。可用于肠杆菌科细菌的鉴定。（六）氨基酸脱羧酶试验（1）原理细菌如具有某种氨基酸脱羧酶，能使氨基酸脱羧、产生胺和CO2，使培养基变碱，指示剂变色。（2）培养基最常用的有3种：赖氨酸脱羧酶培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基、精氨酸脱羧酶培养基及对照培养基。（3）方法将细菌接种在上述含氨基酸的培养基及不含氨基酸的对照培养基中，接种后用无菌石蜡油覆盖，高度至少5mm。在35℃培养4日观察结果。（4）结果开始阶段培养基由于葡萄糖分解呈酸性而呈黄色，以后变为紫色为阳性结果，若仅发酵莆萄糖显黄色为阴性。对照管应为黄色。（5）应用本实验可以作为肠杆菌科细菌鉴定的重要方法，对链球菌和弧菌科细菌鉴定也有重要作用。（七）精氨酸双水解试验（1）原理某些细菌可降解精氨酸为瓜氨酸和胺，瓜氨酸可降解为鸟氨酸、氨和二氧化碳。鸟氨酸又可受脱羧酶的作用，生成腐胺和二氧化碳。氨和腐胺可使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。（2）方法将细菌穿刺接种在索恩利（Thornley）培养基，并封以灭菌石蜡油，在35℃培养1～4天，每天观察培养基颜色变化。（3）结果培养基转为红色为阳性。三、碳源和氮源利用试验（一）枸橼酸盐利用试验（1）原理当细菌利用铵盐作为惟一氮源，并利用枸橼酸作为惟一碳源时，便可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸钠，生成碳酸钠，使培养基呈碱性。（2）方法将细菌接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，在35℃培养1～4天，每天观察培养基颜色变化。（3）结果30 西蒙氏枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，且培养基变蓝色为阳性；培养7天无细菌生长，培养基颜色不变保持绿色为阴性。柯氏枸橼酸培养基斜面变红色为阳性，保持淡黄色不变色为阴性。（4）应用常用于肠杆菌科细菌各菌属之间鉴别。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属、耶尔森菌属为阴性，枸橼酸杆菌、沙门菌、克雷伯菌属、沙雷菌为阳性。此外，也有助于假单胞菌、气单胞菌的鉴定。（二）丙二酸盐利用试验（1）原理细菌能利用丙二酸盐作为惟一碳源时，则能分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变碱性。（2）方法将细菌接种于丙二酸盐培养基培养基，置35℃培养过夜后观察结果。（3）结果培养基由绿色变成蓝色为阳性，无颜色改变是阴性。（4）应用本试验有助于鉴别肠杆菌科细菌。克雷伯菌属和亚利桑那菌为阳性，肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反应，其他菌属为阴性。（三）马尿酸钠水解试验（三氯化铁法）（1）原理某些细菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸钠水解，产生苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。（2）方法将细菌接种于马尿酸钠培养基中，置35℃培养48小时后，离心沉淀，取上清液0.8ml，加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀，经10～15分钟观察结果。（3）结果出现恒定的沉淀物为阳性，若有沉淀物出现，轻摇后就消失为阴性。（4）应用B群链球菌能分解马尿酸盐，呈阳性反应，其他链球菌为阴性。（四）马尿酸钠水解试验（茚三酮法）（1）原理细菌水解马尿酸钠后形成的甘氨酸，在强氧化剂茚三酮的作用下，氧化脱氨基，生成氨、二氧化碳和醛，茚三酮则生成了还原型茚三酮。氨、二氧化碳与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。（2）方法将菌液0.4ml和等量的1％马尿酸钠溶液混合后，于35℃培养2小时，加入0．2ml茚三酮试剂混匀，出现紫色为阳性。（4）应用B群链球菌能分解马尿酸盐，呈阳性反应，其他链球菌为阴性。四、细菌酶类试验（一）触酶（过氧化氢酶）试验（1）原理细菌的呼吸酶使细菌在代谢过程中形成过氧化氢，若细菌同时产生触酶，则可把过氧化氢分解为水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。30 （2）方法挑取纯培养菌落1接种环，置于洁净的玻片上或小试管内，滴加适量3％过氧化氢溶液。在1分钟内见有大量气泡产生，判为阳性结果。（3）应用葡萄球菌和微球菌属呈阳性，链球菌和肠球菌呈阴性。可用于革兰阳性球菌的初步区分。（二）氧化酶试验（1）原理氧化酶也称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。在本试验中，氧化酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C氧化，随后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。（2）试剂a盐酸四甲基对苯二胺1g、抗坏血酸1g，水100ml，盛于棕色瓶内，避光在4℃保存。b萘酚1g、95％乙醇95ml、盛于棕色瓶内，在4℃避光保存。（3）方法a取滤纸一小块，涂抹菌苔少许，加试剂a，立即呈粉红色，迅速转为紫红色者为阳性。b在滤纸上先滴加少许试剂a，再滴加等量的试剂b，然后涂抹待测菌，立即呈现蓝色者为阳性，2分钟无颜色变化为阴性。（4）应用主要用于奈瑟菌属和非发酵菌的鉴定，绝大多数菌为阳性，也用于肠杆菌科细菌的确定，该科细菌氧化酶试验都为阴性。本试验也有助于识别气单胞菌和邻单胞菌。注：试剂在空气中易发生氧化，加入抗坏血酸可减缓氧化，未加抗坏血酸的试剂需每星期新鲜配制。实验时避免接触含铁的物质。因葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性，实验菌苔不宜采用含葡萄糖的培养基上的菌落。（三）硝酸盐还原试验（1）原理硝酸盐培养基中的硝酸盐（NO3）可被某些细菌还原为亚硝酸盐（N04），后者与醋酸作用生成亚硝酸。亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与α萘胺结合成红色的N-α萘胺偶氮苯磺酸。（2）试剂a甲液：对氨基苯磺酸0.8g；5mol／L乙酸100ml。b乙液：α萘胺0.5g；5mol／L乙酸100ml。c锌粉：少许。（3）方法将待检菌接种于硝酸盐培养基(内置一小倒管)，置35℃温育1～4天，每天吸出培养液少许，试验前临用时等量混合试剂甲液和乙液，在培养液中加1～2滴混合试剂，阳性者立即出现红色。并观察小倒管，如有气泡产生，表示有氮气产生。若加入硝酸盐还原试剂不出现红色，可加入锌粉少许，如出现红色证明产生芳基肼，表示硝酸盐仍存在；如不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氮和氨。（4）应用30 本试验是细菌鉴定中的重要生化反应。肠杆菌科细菌为阳性反应（极少数例外，如痢疾志贺菌Ⅰ型为阳性）。如铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气。而不动杆菌属均为阴性。（四）磷酸酶试验（1）原理磷酸酶可使单磷酸酯水解。反应基质若是磷酸酚酞，经该酶水解后可释放出酚酞，在碱性条件下呈红色。（2）方法将被检细菌接种磷酸酚酞平板上，置35℃培养18～24小时，在平板盖内加1滴浓氨水熏蒸片刻。观察菌落，呈粉红色为阳性。（4）应用本试验有助于致病葡萄球菌与其他葡萄球菌的鉴别，前者呈阳性，后者呈阴性。（五）凝固酶试验（1）原理致病性葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集。葡萄球菌产生的凝固酶有两种，一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，可用玻片法测出。另一种是游离凝固酶，此酶生成后释放于培养基中，可用试管法测出。（2）方法a试管法：于无菌试管内加入兔血浆0.5ml，再加入葡萄球菌16～18小时肉汤培养物0.5ml，轻轻转动试管，使混匀。置37℃水浴中3～4小时，结果观察，凝固者为阳性。b玻片法：取未稀释的兔浆1滴及盐水1滴分别置于清洁载玻片上，挑取试验菌分别与盐水及血浆混合，立即观察结果。如血浆中有明显颗粒出现而盐水中无自凝现象者为阳性。结合凝固酶试验也可用纤维蛋白原致敏的红细胞与试验菌作玻片凝集试验，则更为敏感。若以血浆－IgG双标记胶乳试齐可同时测定A蛋白和纤维蛋白原的亲和因子，更可提高金黄色葡萄球菌的检出率，而且较简便快速。（3）应用用于鉴定葡萄球菌的种，金黄色葡萄球菌和中间葡萄球菌为阳性结果，其他葡萄球菌为阴性。（六）DNA酶试验（1）原理DNA酶可水解DNA长链，形成数个单核苷酸组成的寡核苷酸链。长链DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸可溶于酸。在菌落平板上加入盐酸后，若在菌落周围出现透明环，而其他部位呈浑浊，表示该菌具有DNA酶。（2）方法将待测菌在DNA琼脂平板上做点状接种，经35℃培育过夜，在平板加适量1mol／L盐酸。观察在菌落周围有透明环出现，判为阳性结果，无透明环为阴性。（3）应用金黄色葡萄球菌及肠杆菌科中的沙雷菌、变形杆菌为阳性。30 44．孤菌科包括哪几个菌属？包括一群氧化酶阳性、具有极端鞭毛、动力阳性的细菌，其有4个菌属：弧菌属、气单胞菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属。45．与人类感染相关的弧菌有哪些？01群霍乱弧菌（V．choleraeO1group）O139群霍乱弧菌（V．choleraegroup）非O1群霍乱弧菌（V．choleraenon－O1group）副溶血性弧菌（V．parahaemolyticus）霍利斯弧菌（V．hollisae）拟态弧菌（V．minicus）河弧菌（V．fluvialis）创伤弧菌（V．vulnificus）溶藻弧菌（V．alginolyticus）少女弧菌（V．damsela）麦氏弧菌（V．metschnikovii）辛辛那提弧菌（V．cincinnatiensis）弗尼斯弧菌（V．furnissii）46．弧菌属细菌的生物学特性是什么？本属细菌为发酵型，革兰染色阴性，形态呈直的、弯曲、月牙形或逗点形。大部分菌种为兼性厌氧。氧化酶试验阳性。细菌生长对营养要求不高，可分解多种碳水化合物、有机酸盐和氨基酸。钠离子可刺激弧菌属所有菌种生长。各菌种具有极端鞭毛，运动活泼如穿梭状。广泛分布于淡水及海水中，人体肠道中也偶有这类细菌存在。47．弧菌属同气单胞菌属和邻单胞菌属如何区分？试验弧菌属气单胞菌属邻单胞菌属O/129敏感试验S/SR/RS/STCBS生长试验+--耐盐试验0%NACL-/+++6%NACL+--48．霍乱弧菌的生化特性是什么？兼性厌氧。营养要求不高，在普通琼脂上生长良好。16℃～44℃均可生长，以37℃为最适宜。具耐碱性，在pH8.2～9.0的碱性胨水或碱性平板上生长迅速。根据该特性初次分离常选用pH8.5的碱性胨水进行选择性增菌培养，可抑制其它杂菌生长。经35℃4h～6h增菌后可在液体表面大量繁殖形成菌膜。常用的选择性培养基有硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平(Thiosufale-citratebilesalts-sucrose，TCBS)。霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色；含亚碲酸钾的选择平板双洗琼脂平板、庆大霉素琼脂平板，霍乱弧菌在平板上生长并将培养基中的碲离子还原成元素碲，形成灰褐色菌落中心。49．霍乱弧菌的初步诊断方法有哪些？（1）直接涂片悬滴检查：取患者粪便制成悬滴标本（亦可用压滴法），检查细菌的动力。霍乱弧菌无论是古典生物型或E1－tor生物型均呈现极活泼的穿梭状运动。O130 群霍乱多价血清制动试验阳性，可作早期推测性报告。染色检查：取米泔样粪便的絮状物、粘液部分涂片2张，干燥后用乙醇固定，分别用革兰染色及1∶10稀释的石炭酸复红染色，油镜下观察有无呈鱼群样排列的革兰阴性弧菌。（2）玻片凝集试验：自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清(即O1群霍乱多价血清)做玻片凝集试验，所用血清的效价应在80～160之间，如过浓则稀释后再作凝集。将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混于血清内，即刻(一般不超过10秒)出现肉眼可见的明显凝集者为阳性，同时作生理盐水对照试验(阴性)。为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集试验。50．用于霍乱弧菌的初筛试验有哪些？（1）霍乱红试验：霍乱弧菌有色氨酸酶和硝酸盐还原能力。当将霍乱弧菌培养于含硝酸盐的蛋白胨水中时，分解培养基中的色氨酸产生吲哚。同时，还原硝酸盐成为亚硝酸盐，两种产物结合成亚硝酸吲哚。滴加浓硫酸后即呈现蔷薇色，判为霍乱红试验阳性。霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应。（2）O/129敏感试验：参照标准药敏纸片扩散试验的方法进行。将O/129(2,4-Diamino-6,-Diisopropylpteridine,2,4二氨基-6,7-二异丙基喋啶)药敏纸片10μg及150μg的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上，35℃18～24h孵育后，纸片周围任何大小的抑菌环均表现为敏感。O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感。但已有对0／129耐药的菌株出现。O139群对O／129耐药用此试验作鉴定时，需特别谨慎，需结合其他试验结果如耐盐生长试验等综合考虑。（3）粘丝试验（StringTest）：将0.5％去氧胆酸钠水溶液与霍乱弧菌混匀制成浓悬液。1min内悬液由混变清，并变得粘稠,以接种环挑取时可形成粘丝。弧菌属细菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反应。51.用于霍乱弧菌的鉴别试验有哪些？（1）多粘菌素B敏感试验：在溶化并已冷却至50℃的1.5%营养琼脂中加入50μ/ml多粘菌素B，混匀后倾注平板备用。取被检菌2～3h的肉汤培养物，接种于平板表面，35℃18～24h孵育后观察有无细菌生长。古典生物型对多粘菌素B敏感不生长，而El-Tor生物型不敏感,可生长出菌苔。（2）鸡红细胞凝集试验：在洁净的玻片上滴加生理盐水1滴，取18～24h的细菌培养物少许与生理盐水混匀成浓厚菌悬液。加入用生理盐水洗涤三次的2．5％新鲜鸡红细胞盐水悬液一滴，充分混匀，1min内出现凝集为阳性。古典生物型阴性，El-Tor生物型阳性。（3）第Ⅳ、Ⅴ组噬菌体裂解试验：取被检菌2～3h肉汤培养物0.2mL加入已溶化并冷却至50℃的4mL半固体琼脂中，混匀后倾注普通琼脂上制成双层平板，待凝固后滴加第Ⅳ或Ⅴ组噬菌体，35℃18～24h孵育后观察有无噬斑（出现者为阳性）。第Ⅳ组噬菌体可裂解古典生物型，不能裂解El-Tor生物型；第Ⅴ组噬菌体可裂解El-Tor生物型，而不能裂解古典生物型。（4）耐盐培养试验：霍乱弧菌能在不含氯化钠和含6％氯化钠培养基中生长。氯化钠浓度高于6％则不生长。52．霍乱弧菌强致病性的原因是什么？正常情况下，胃液中的胃酸可消灭食物中的霍乱弧菌不致于致病，30 但在胃酸降低时；或摄入大量的霍乱弧菌，可以通过胃进入肠道。进入肠道的霍乱弧菌通过鞭毛运动穿过肠粘膜表面的粘液层，接近肠粘膜上皮细胞，通过普通菌毛的作用定值。肠道内的环境有利于霍乱弧菌的繁殖，产生由染色体编码、对热不稳定的霍乱肠毒素（choleratoxin，CT），CT由A和B两个蛋白质亚单位组成。A亚单位分子量为21812Da，由240个氨基酸组成，在成熟过程中由蛋白水解酶切割成A1和A2两部分，以二硫键相连。A1为毒素活性单位，通过B亚单位结合细胞膜上GM1受体的通道或“内吞”进入细胞内，激活腺苷酸环化酶（cAMP酶），使细胞内cAMP大量增加。从而促进肠粘膜细胞的分泌功能，造成肠液大量分泌，导致严重的腹泻和呕吐。致使体内水份和电解质大量丧失，机体陷于脱水和电解质、酸碱平衡紊乱状态。如治疗不及时可造成严重休克或死亡。52．霍乱弧菌如何分群和分型的？O1血清分群生物学分型血清学分型非O1群小川型霍乱弧菌古典型彦岛型稻叶型O1群小川型El-Tor彦岛型稻叶型53.副溶血弧菌的生物学特性是什么？副溶血弧菌是一种具有嗜盐性的细菌，常存在于近海海水及海产品里，是引起夏秋季食物中毒和急性腹泻的主要病原菌。该菌为革兰阴性杆菌，有鞭毛（极单毛），无荚膜，无芽胞。营养要求不高，但在培养基中必须加入适量的氯化钠，生长所需氯化钠的最适浓度为3.5％。在无盐培养基上不能生长，氯化钠含量超过8％不能生长。在碱性胨水中经6～9h增菌可形成菌膜。在TCBS琼脂平板上形成0.5～2.0mm大小，蔗糖不发酵而呈蓝绿色的菌落。在普通血平板上不溶血或只产生α溶血。但以兔血及以甘露醇为碳源的我妻（wagatsuma）琼脂培养基上产生β－溶血现象，称为神奈川现象（Kanagawaphenomenon，KP）。54．什么是厌氧菌及如何分类？厌氧菌（anaerobicbacteria）是指一大群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长的细菌。广泛分布于自然界和人体中，往往是体内正常菌群的组成成员，多为条件致病菌。可导致临床上许多不明原因的感染，且多为混合性感染。其种类主要可分为两大类，一类是有芽胞的革兰阳性梭菌，另一类是无芽胞的革兰阳性及革兰阴性的杆菌与球菌。55．厌氧菌的分布状况如何？厌氧菌广泛分布于自然界和人体中。除梭状芽胞杆菌能以芽胞的形式在自然界中长期存活外，其他绝大多数无芽胞厌氧菌均存在于人和动物体内，特别是口腔、肠道、上呼吸道、泌尿生殖道等处，同需氧菌与兼性厌氧菌共同构成机体的正常菌群。在人体正常菌群中厌氧菌占有绝对优势，例如肠道菌群中厌氧菌与非厌氧菌（包括需氧菌和兼性厌氧菌）的比例为1000∶1，即99．9％是厌氧菌，大肠杆菌等仅占0．1％。每克粪便含厌氧菌达1000亿个，皮肤、口腔、上呼吸道、女性生殖道的正常菌群中，也有80％～90％是厌氧菌。正常情况下菌群之间保持着微生态平衡，厌氧菌代谢产生的乙酸、乳酸等能抑制病原菌生长。如长期使用广谱抗生素、激素、免疫抑制剂等，在发生菌群失调或机体免疫力下降或细菌进入非正常寄居部位时，这些厌氧菌即可作为条件致病菌而导致内源性感染。56.厌氧菌感染的临床及细菌学指征有哪些？30 凡有下列情况者应怀疑有厌氧菌感染：①感染组织局部产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发音，是产气荚膜梭菌所引起感染的特征。②发生在粘膜附近的感染，口腔、肠道、鼻咽腔、阴道等粘膜，均有大量厌氧菌寄生，这些部分及其附近有破损，极易发生厌氧菌感染。③深部外伤如枪伤后，人被动物咬伤后的继发感染，均可能是厌氧菌感染。④分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。发红色荧光的分泌物，可能有产黑色素普鲁沃菌和不解糖紫单胞菌；分泌物或脓汁中有硫磺颗粒，为放线菌感染。⑤分泌物涂片经革兰染色，镜检发现有细菌，而常规培养阴性者；或在液体及半固体培养基深部长的细菌，均可能为厌氧菌感染。⑥长期应用氨基糖甙类抗生素治疗无效的病例，可能是厌氧菌感染。⑦最近有流产史者，以及胃肠手术后发生的感染。57.厌氧菌的临床微生物标本如何采集？在一般情况下，应从正常无菌部位或通过严格无菌技术采集标本，用无菌操作抽取无菌体液，包括有血液、胸腔积液、关节液、心包液、胆汁、脑脊液、腹腔液、和膀胱穿刺液等。采取标本时应尽量避免接触空气，多使用针筒抽取，减少标本与空气接触的机会。抽取时穿刺针头应准确插入病变部位的深处，一般抽取数毫升即够。抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。若病灶处的标本量较少，则可以先用针筒吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。标本采集后，将针头插入无菌橡皮塞或用专用培养基立即送检，最迟不超过半小时。不同部位标本采集法如下：肺部:下呼吸道分泌物肺穿刺术或用带有保护套的纤只镜采取。脓肿：封闭性脓肿采用针管抽取；如已破溃，用无菌棉拭子擦去表面脓液，去深部分泌物。女生殖道：后穹窿穿刺抽取。胸腔：胸腔穿刺术。窦道或深部创伤：用空针连着静脉注射的塑料导管穿人感染部位抽吸。组织：无菌外科切开。尿道：上阴部膀胱穿刺。58.厌氧菌标本采集时应注意些什么？如采集标本的部位有正常厌氧菌栖居，此等部位所培养出的厌氧菌，不一定是真正的致病菌，故下列标本无送检价值，不宜做厌氧菌培养：①鼻咽拭子；②齿龈拭子；③痰和气管抽取物；④胃和肠道内容物、肛拭，如果需要只能做难辨梭菌及肉毒杆菌；⑤接近皮肤和粘膜的分泌物；⑥褥疮溃疡及粘膜层表面；⑦排出的尿或导尿；⑧阴道或子宫拭子；⑨前列腺分泌物。如果一时来不及接种，可将标本置室温下保存。一般认为标本不要冷藏，因冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高。59.厌氧菌标本如何运送与处理？（1）针筒运送法针筒可用来运送各种液体标本，如血液、脓液、胸腹水等。用无菌针筒抽取标本后，排出空气，针尖插入无菌橡皮塞，隔绝空气，即可运送到实验室。（2）无氧小瓶运送法通常用来运送少量脓液，用无菌青霉素小瓶作采样瓶。瓶内装培养基0.5ml30 ，加入少量刃天青（resazarin）。后者是氧化还原指示剂，有氧时显粉红色，无氧时无色，其在培养基中的浓度为1mg/ml。（3）棉拭运送法一般不用，因棉拭子中有空气不利于厌氧菌生长，但有时不得不用。棉拭运送管分A、B两管。A管内充满CO2，管中插入1支连在橡皮塞下的无菌棉拭。用丁基橡皮塞（butylrubber）塞紧，因其它橡皮塞可能有毒性，且氧气可渗入。B管装有含还原剂的半固体培养基。棉拭自A管取出，浸泡分泌物后，插入B管后即可。（4）大量液体标本运送法装满标本瓶，即可驱除瓶中的空气，加盖密封即可运送。（5）组织块运送法组织块放在密封的厌氧罐中运送。罐内放人一团用酸化硫酸铜（0.25％的吐温80，加硫酸铜配制而成pH至1.5～2）浸泡过的钢丝绒，钢丝绒用酸化硫酸铜浸泡过，其表面附有金属铜，能迅速吸氧。（6）厌氧袋运送法可将预还原的血平板带到病人床边接种，然后将平板放入厌氧菌培养袋携回实验室。或放入无菌又不透气的普通塑料袋，袋中装有一团酸化硫酸铜处理过的钢丝绒以利吸氧。标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2h，以免其中兼性厌氧菌过度生长而抑制厌氧菌的生长。60.厌氧菌分离培养常用培养基有那些？①强化血琼脂平板（BAP）：即布氏琼脂或牛心、牛脑浸出液琼脂为基础培养基，补加酵母浸膏（0.5％）、动物血（5％～10％）、维生素k1（0.1μg／ml）和氯化血红素（5μg／ml）。本培养基是一种非选择性培养基，几乎能培养出所有的厌氧菌。②卡那－万古霉素冻溶血琼脂平板（KVLB）：可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期形成黑色素。后者正是亚铁血红素的衍生物，其形成速度与培养基中血红素含量有关。在普通血平板上，黑色菌落需4～5d才出现，而在溶血平板上只需2～3d。在此培养基上绝大多数类杆菌属、普雷沃菌属和紫单胞菌属都生长良好，梭杆菌和厌氧球菌不能生长。本培养基是分离口腔、头颈部、上呼吸道常见的产黑色素普雷沃菌常用的选择性培养基。血中以人血和兔血效果最好，溶血前先将血细胞放入－20～－70℃冰箱冻结数分钟，再放入30℃水浴箱立即溶血。卡那霉素含量为75～100μg／ml，万古霉素为75μg／ml。③七叶苷胆汁平板（BBE）：本培养基含20％胆汁（或20g／L牛胆盐），1g／L七叶苷和100μg／ml的庆大霉素。庆大霉素抑制需氧菌，胆汁抑制对之敏感的厌氧菌。只有耐胆汁的脆弱类杆菌组的细菌与可变梭杆菌和死亡梭杆菌不但不被抑制，反被刺激生长，菌落较大。除部分普通类杆菌和可变梭杆菌外，上述各菌还能水解七叶苷，故除菌落较大外，在菌落周围还能形成棕黑色的晕。而部分普通类杆菌和可变梭杆菌在菌落周围无棕黑色的晕。如培养时间延长，某些肠球菌也能生长，但菌落小而透明，染色性改变成革兰阴性。④卵黄平板（EYA）和兔血平板：用于选择产气荚膜梭菌。标本直接涂片如发现革兰阳性短粗钝圆杆菌，同时白细胞很少或破碎，有荚膜、不见芽胞，可能即是该菌。接种兔血平板，见有双溶血环，内环是与菌落一样大小的透明溶血环，外环是宽的甲型溶血，在室温中放半小时，可见菌落变绿色或褐色，同时可接种卵黄平板，以进行卵磷脂酶试验及聂格尔试验来鉴定产气荚膜梭菌。61.做厌氧菌分离培养时标本如何接种？30 为了能及时准确地分离培养出需氧菌，兼性厌氧菌，微需氧菌和厌氧菌；每份标本至少应接种3个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5％～10％CO2环境中培养。如仅要求厌氧菌生长，除接种上述培养基外，还应接种一种或几种选择性培养基，抑制其它细菌生长，以利于厌氧菌生长。同时应接种一支液体培养基增菌用，如平板无菌生长时，可用液体培养重新转种。如平板上菌生长良好，此液体培养即可弃去。接种时可用无菌注射器抽取标本1～2滴接种血平板，1ml接种到液体培养基的底部。接种后立即放入无菌容器厌氧法进行培养。为了便于在混合培养物中发现厌氧菌，一般将标本分3区划线接种于平板上，在1、2区交界处，贴一张含5μg／片的甲硝唑纸片。如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在，因为兼性厌氧菌对甲硝唑不敏感。62.如何初步鉴定厌氧菌？标本经48h初代培养后，用放大镜观察平板上的菌落性状。每个平板挑选5个不同性状菌落，每个菌落分别接种2～3个平板，每个平板划分4～6个区，分别作几个菌落的次代培养。然后分别放入有氧、无氧和含5％～10％二氧化碳环境中培养48h。如在有氧、无氧环境中均能生长为兼性厌氧菌；如在有氧、无氧环境中均不生长或生长不好，而在二氧化碳环境生长最好为需二氧化碳菌；如在有氧下生长而在无氧下不生长则为需氧菌；在有氧环境中不生长而仅在厌氧环境中生长即为专性厌氧菌。当在厌氧平板上有菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。同时可据厌氧菌的菌体形态、染色反应、菌落性状以及对某些抗生素的敏感性等作出初步鉴定。例如产气荚膜梭菌某些菌株可产生范围较大的溶血圈或双溶血圈;产黑色素普鲁沃菌，其菌落在紫外线（360nm）或Wood氏灯照射下，显示砖红色荧光。破伤风梭菌芽孢位于菌体顶端而使细菌呈鼓槌状。卡那霉素可将梭杆菌属(敏感)与类杆菌属(耐药)区分开来。63.厌氧菌的革兰染色应注意些什么？因为某些厌氧菌具有特殊的菌体形态，可通过革兰染色镜下观察作出初步鉴定。但应注意由于培养基种类和培养时间的不同，而染色结果也有较大差异，如痤疮丙酸杆菌，用pH7.0培养基时菌体为革兰阴性并呈多形性；若用pH6.0以下的培养基则为革兰阳性杆菌。厌氧菌的革兰染色，选择24h内幼龄菌较为理想。由于厌氧菌培养时间长，可能革兰阳性变为阴性，不易判断。这种现象常发生在梭菌、消化链球菌和优杆菌等属，可用氢氧化钾拉丝试验协助判定。64.什么是非发酵菌及主要菌属有哪些?非发酵菌（nonfermenters）主要是指一大群不发酵糖类、专性需氧、不产生芽胞的革兰阴性杆菌。在临床微生物学实验室遇到所有革兰阴性杆菌中，非发酵菌占约占15％，非发酵菌大多为机会致病菌，是引起医院内感染的重要致病菌。主要菌属有假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、莫拉菌属(Moraxella)、金氏杆菌属(Kingella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、艾肯菌属(EiKenella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas).65.从临床标本中分离到的非发酵菌常有那些？从临床标本中分离到的非发酵菌，大约占所有革兰阴性杆菌中的15％，其中铜绿假单胞菌占70％，其次是不动杆菌属，嗜麦芽黄单胞菌占第三位，木糖氧化产碱假单胞菌、荧光假单胞菌、洋葱假单胞菌、恶臭假单胞菌、斯氏假单胞菌较少见。假鼻疽假单胞菌、鼻疽假单胞菌是罕见的。66.假单胞菌属生物学特性有哪些？30 本属细菌对营养要求不高，普通培养基生长良好，一般能在麦康凯琼脂上生长。主要生物学特性是能产生水溶性色素，如青脓素（pyoverdin）或称荧光素，绿脓素（pyocyania）不发荧光，可用氯仿从培养液抽提获得。此外，尚有少数菌株可产生红脓素（pyorubin）、黑脓素（pyomelanin），也有不产色素的菌株。氧化酶阳性、精氨酸双水解酶阳性，利用枸橼酸盐，对多粘菌素敏感。氧化葡萄糖、蔗糖无反应。据统计，临床标本中铜绿假单胞菌不产绿脓素的菌株约占10％，既不产生绿脓素亦不产生青脓素的也占10％左右。67.嗜麦芽黄单胞菌生物学特性有哪些？原属rRNA同源群V嗜麦芽假单胞一黄单胞菌群，在临床标本中较为多见。该菌在血液琼脂或麦康凯琼脂培养基上生长迅速，SS琼脂受抑制，血液琼脂生长菌落呈淡黄或棕色，有氨气味，不溶血，但在菌落周围变成绿色。克氏双糖铁琼脂上不产酸、不产生硫化氢。在O－F基础培养基上氧化麦芽糖比葡萄糖迅速而明显。该菌的鉴定要点是通常氧化酶试验阴性（注意做该菌氧化酶试验应从M－H琼脂上刮取菌落），但有极少数菌株产生弱的阳性反应，水解七叶苷，产生赖氨酸脱羧酶，其他如明胶酶、DNA酶、β-半乳糖苷酶皆阳性。68.腐败谢瓦纳拉菌生物学特性有哪些？该菌有3个生物变种。为严格需氧性代谢，在克氏双糖铁琼脂高层，斜面皆不产酸，而产生大量H2S（是非法酵菌属中唯一产H2S的菌种）。这些黑色沉淀物掩盖培养基的显色（红色）反应，易与产生H2S的肠杆菌相混淆。在琼脂平板上集落棕黄到粉红色，轻度粘性和粘液状，氧化葡萄糖，但产酸微弱或延迟多日才出现，鸟氨酸脱羧酶和DNA酶阳性，大多数菌株最适生长温度为30℃。69.不动杆菌属分几类及生物学特性有哪些？该属主要包括醋酸钙不动杆菌（A．calcoaceticus）、洛菲不动杆菌（A．lwoffi）、溶血不动杆菌（A．haemolylius）、鲍曼不动杆菌（A．baumanii）、琼氏不动杆菌（A．junii）、约翰逊不动杆菌（A．johnsonii）、耐放射线不动杆菌（A.radioresistans）七种。其生物学特性为革兰阴性杆菌，镜下形态多为球状或球杆状，成双排列为主。革兰染色常不易脱色，无芽胞，无鞭毛。不动杆菌为专性需氧菌，生长不需特殊营养，普通琼脂及麦康凯琼脂培养基上生长良好。最适生长温度为30～35℃。不动杆菌氧化酶阴性，触酶阳性，硝酸盐阴性，该属菌种在初代培养时常呈球形菌体，当生长在含有青霉素或头孢菌素以及次代增殖培养时，即可证实是杆菌。本菌氧化酶阴性，动力阴性，球杆菌很容易与其他的非发酵菌区别。与肠杆菌科区别可利用硝酸盐试验，本菌阴性。70.产碱杆菌属如何分类？粪产碱杆菌A．faecalis皮乔特产碱杆菌A．piechaudii粪产碱杆菌Ⅱ型A．faecalistypeⅡ木糖氧化产碱杆菌A．xylosoxidans脱硝亚种subspdenitrificans木糖氧化亚种subsp．xylosoxidans71.产碱杆菌属的生物学特性？该属菌为革兰阴性短杆菌，大小为0.5～1.0μmX0.5～2.5μm，周身鞭毛1～8根，有动力。严格需氧代谢。菌落无色素，氧化酶阳性，触酶阳性，不水解七叶苷、明胶和DNA。在O－F30 基础培养基上不分解任何糖类，不产生脲酶，不液化明胶，苯丙氨酸脱氨酶，精氨酸双水解酶皆阴性，应被鉴定为不分解糖类的产碱杆菌属菌种。而符合上述某些特性，但在O－F基础培养基中氧化葡萄糖、木糖，还原硝酸盐和亚硝酸盐，枸橼酸盐阳性，能在42℃生长，Cetrimide琼脂上生长，鉴定为木糖氧化产碱杆菌木糖氧化亚种。此菌与放射土壤杆菌的鉴别是乳糖、麦芽糖、甘露醇、水解七叶苷、脲酶试验前者全部阴性。粪产碱杆菌在血琼脂上可形成灰色较大菌落，有水果味，菌落呈α溶血，边缘呈弥散状。72.分枝杆菌属生物学特性有哪些？分枝杆菌属（Mycobacterium），至今已发现50多种细菌，除结核分枝杆菌和麻风分枝菌，其他分枝杆菌统称非碘性分枝杆菌。因其繁殖时成分枝状生长故称分枝杆菌。目前，按照“伯杰系统细菌学手册”，将分枝杆菌分为缓慢生长，快速生长和特殊营养要求三种类型，后者是指麻风分枝杆菌。本属细菌有耐受酸和抗乙醇脱色的特性，故也称耐酸菌或抗酸菌。无鞭毛、无芽胞，为触酶阳性的需氧菌。73.结核分枝杆菌如何分类?结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）复合群包括人结核分枝杆菌（M．tuberculosis），牛分枝杆菌（M．bovis），非洲分枝杆菌（M．africanum）和田鼠分枝杆菌（M．microti）等，其中前三者对人类致病。人型结核分枝杆菌感染的发病率最高90%,其次为牛型。74.结核分枝杆菌菌体成分有哪些？①脂质此菌含有大量脂质，占胞壁干重的60％，包括磷脂、脂肪酸和蜡质（waxes），都与蛋白质、多糖形成复合物。其中蜡质所占比例最大，由分枝菌酸（mycolicacid）、索状因子和蜡质D组成。②蛋白质结核分枝杆菌含有多种蛋白质成分。结核菌素（tuberculin）就是其中之一，与蜡质结合能使机体致敏。其他蛋白质也有抗原性。③多糖结核分枝杆菌含有各种多糖，其致病作用尚不清楚。结核分枝杆菌具有免疫佐剂作用，其细胞壁骨架、蜡质D和核酸等均有佐剂作用。但最有效成分是胞壁酰二肽，其分子量小，毒性低，并能人工合成。75.结核分枝杆菌致病物质结核分枝杆菌不产生内、外毒素以及侵袭酶，其致病性可能是细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分产生的免疫损伤有关。结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白质。⑴荚膜荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋白质。其对结核分枝杆菌的作用有：①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3（CR3）结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的粘附与入侵；②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养；③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易进入。故结核标本用4％NaOH消化时，一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后，荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合。⑵脂质结核分枝杆菌的毒力与其所含的脂质成分有关，尤其是糖脂更为重要。①30 索状因子（cordfactor）：存在于有毒力的结核分枝杆菌细胞壁中，是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂，使细菌在液体培养基中能形成盘旋的索状生长现象。此因子与结核分枝杆菌的毒力密切相关。它的主要毒性是损伤细胞线粒体和抑制氧化磷酸化过程，且能抑制粒细胞的游走和引起慢性肉芽肿。②磷脂：能促进单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节。③硫酸脑苷酯（sulfatides）是有毒株细胞壁的成分，能抑制溶酶体同吞噬体的结合，减缓了溶酶体对结核分枝杆菌的分解、杀伤作用，使细菌在吞噬细胞内长期存活。④蜡质D：是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟发型超敏反应。⑶蛋白质有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并在形成结核结节中发挥一定作用。76.结核分枝杆菌培养特性是什么？结核分枝杆菌为专性需氧，3％～5％CO2能促进生长。营养要求较高，必须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。此菌最适生长温度为35℃～37℃，pH6.5～6.8。生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5w才出现肉眼可见的菌落。典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。菌落粗糙可能与菌体内含有高浓度的脂质有关。液体培养时生成菌膜。如培养液中加入吐温－80（Tween－80）可使细菌分散呈均匀生长。有毒株在液体培养基中呈索状生长。77.结核分枝杆菌致疾病性机理？结核分枝杆菌主要通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径感染机体，引起多种脏器组织的结核病，其中以肺结核为多见。含结核分枝杆菌的飞沫或尘埃经呼吸道侵入肺部后，其中90％的菌体可经粘膜纤毛运动而排除，只有一小部分进入肺泡，被肺泡中的巨噬细胞吞噬，因菌体的脂类等成分能抵抗溶酶体酶的作用，故细菌能够在巨噬细胞内繁殖，导致巨噬细胞裂解，释放出的结核杆菌可再度被巨噬细胞吞噬，通过巨噬细胞将细菌带至其他部位。从而导致原发性和继发性感染。原发性感染，包括原发灶、淋巴管炎及所属肺门淋巴结病变，好发于学龄儿童及未感染过结核杆菌的成人。机体免疫力低下时，原发感染灶恶化，结核分枝杆菌经气管淋巴道或血流播散，形成全身性粟粒性结核。当机体抵抗力强时，使感染灶形成结核结节，淋巴结病灶逐渐纤维化和钙化，不治自愈。但也可成为以后内源性感染的来源。继发感染亦可由外界新侵入的结核分枝杆菌引起（外源性感染），其特征为慢性肉芽肿炎症，形成结核结节、干酪化和纤维化，只有少数累及邻近淋巴结。继发感染常见于肺尖部位78.结核分枝杆菌微生物特性有哪些？结核分枝杆菌为细长杆状，略带弯曲，有时可见分枝状。本菌为典型的抗酸杆菌，通常难以着色，常用萋－尼染色法（Ziehl－Neelsentechnique）抗酸性染色法，经此法染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色。用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色。镜下常呈簇状、链状、索状排列，菌体内可含有一至数个异染颗粒。革兰染色不易着色，通常视为阳性。79.怀疑结核病患者标本如何采集？30 根据感染部位的不同，采集不同的标本。结核病人各感染部位的标本中大多数混有其他细菌，为此必须采取适宜并能抑制污染菌的方法。取来自病人的肺部痰，最好收集清晨第一口痰，盛清洁干燥的玻璃瓶内送检。尿液收集应取清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检。诊断尿路结核通常需3～5份标本。粪便，选取脓性部分粪便5～10g放于灭菌的广口瓶中送检。但国外不推荐作结核分枝杆菌的粪便检查。采集胃液可于空腹时抽取胃液或洗胃液（特别是儿童）置无菌瓶中送检。无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养。采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物。深部脓肿用无菌注射器抽取，置无菌试管送检。棉拭采集的标本应直接放置肉汤中培养。80.结核分枝杆菌检查方法有哪些？（1）直接涂片染色镜检：是一种临床常用的简易快速的检查方法。直接涂片法是用接种环取病人痰液中浓厚部分或离心沉淀（3000r／min，20min）的尿沉淀物2～3接种环涂片，涂片要厚。经自然干燥和火焰固定后进行齐－尼抗酸染色，或作金胺“0”荧光染色。（2）浓缩集菌涂片检查法：如果直接涂片镜检不易检出结核杆菌，应采用浓缩集菌涂片检查法，以提高结核杆菌的检出率。所谓浓缩集菌涂片即为将采集标本离心，取沉淀涂片，或是采用漂浮集菌法，集菌后标本经反复多次使涂层加厚，一般取3～4个接种环，涂抹面积大约直径在15mm即可，干燥固定后染色镜检。（3）核酸检测用PCR法快速诊断结核分枝杆菌感染。设计结核分枝杆菌特异rRNA片段的引物进行扩增，然后用结核分枝杆菌rRNA序列特异的DNA探针与之杂交。PCR技术的特异性与敏感性均大于95％。（4）抗PPDIgG的检测用ELISA法检测患者血清中抗PPDIgG，可作为活动性结核分枝杆菌感染的快速诊断方法之一。肺结核病人的血清阳性率为80％～90％。81.结核分枝杆菌如何分离培养？脑脊液、胸腹水等无杂菌污染的标本可直接或离心后取沉渣接种。痰和尿液等有杂菌污染的标本在接种到培养基之前须做适当的处理，以消除杂菌的干扰。（1）固体培养基培养法：将处理后的标本接种于选择性固体培养基中，常用罗琴培养基（Lwenstein－Jensenmedium）或青霉素血液琼脂培养基，培养基中所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长。37℃，5％～10％CO2培养8周，如果出现生长缓慢、干燥、呈颗粒状、灰白色菌落，涂片染色为抗酸阳性，则多数是结核分枝杆菌。若涂片结果为阴性或菌落有色素产生，同时菌落形态不典型，则需将接种物于24～33℃继续培养至12周。（2）液体培养法：分枝杆菌生长周期长，在常规人工培养基上不生长，是临床细菌室报告时间最长的一项检测。Bactec－460半自动分枝杆菌快速培养系统，用标记底物方法，试验灵敏度高，为临床提供快速阳性报告。全自动分枝杆菌快速培养系统（MB／BacT），具有自动培养、连续监测、自动分析的优点，在分离率、报告速度和操作方便程度方面均有很大的提高。阳性瓶中经涂片确认为分枝杆菌后应做NAP（P－nitro－α－acetylamino－βhydroxypropiophenome）抑制实验。NAP能抑制结核分枝杆菌的生长，对非结核分枝杆菌则否，由此可区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。同时可使用基因技术鉴定菌种。无污染标本可直接接种，而污染标本应预先处理，以除去污染菌。血液应破坏红细胞，离心后再接种。82.结核分枝杆菌鉴定试验有哪些？（1）PCR反向膜探针杂交ELISA法：该法是将PCR30 、分子杂交、酶联免疫显色三方面技术有机结合，经过两次特异性双向选择，其特异性相互补充和加强，对提高方法的特异性，消除假阳性起决定作用。（2）DNA探针：使用对分枝杆菌rRNA序列特异的DNA探针与分枝杆菌rRNA杂交。由于每个分枝杆菌细胞内有10，000个rRNA拷贝，故为杂交提供了一个天然的放大系统，提高了检测灵敏度。同时可将荧光素或同位素标记在探针上，通过检测荧光或放射性来鉴定菌种。（3）16srRNA基因序列测定：由于分枝杆菌的16srRNA基因序列是高度可变的，有种的特异性，即不同种的分枝杆菌其16srRNA基因序列是不同的，所以可通过测定16srRNA基因序列来鉴定菌种。（4）高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。参考文献1.俞树荣主编，微生物学和微生物学检验[M]（第二版）2.张秀珍主编，当代细菌检验与临床[M]3.刘锡光主编，现代诊断微生物学诊断[M]4.张卓然主编，微生物学和微生物学检验[M]（第三版）5.倪语星主编，细菌耐药性监测与抗感染治疗[M]6.黄德明主编，现代医学检验新技术与操作规程全书[M]30