微生物实验教案实验

湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验一细菌的形态与结构【目的要求】1、学会正确使用显微镜油镜及其保护法2、认识细菌的基本形态3、认识细菌的鞭毛、荚膜、芽胞【教学重点】油镜的使用和保护、细菌的基本形态、特殊结构【教学难点】油镜的使用原理及方法【思考题】1、如何识别油浸镜？油浸镜的使用步骤怎么样？2、镜下观察细菌染色标本时应注意哪些方面？【参考文献】　 湘南学院教师备课　1、刘晶星主编.医学微生物学与寄生虫学（第三版）.人民卫生出版社，2002，72、唐珊熙主编.微生物学与微生物学检验(卫生部规划教材).人民卫生出版社，2001，2。【板书设计】实验一细菌的形态与结构一、实验目的1、学会正确使用显微镜油镜及其保护法2、认识细菌的基本形态3、认识细菌的鞭毛、荚膜、芽胞二、实验内容（一）实验室规则（二）CAI课件学习（三）油镜的使用1、原理2、使用方法3、保护法（四）细菌的基本形态的观察（操作）（五）细菌的特殊结构的观察（操作）【教学步骤】导言:细菌的形态学检查是细菌检验的重要方法之一,可根据其形态、结构和染色性初步确定其种属，对及时选用抗生素治疗疾病有一定参考意义。实验一细菌的形态与结构一、实验目的1、学会正确使用显微镜油镜及其保护法2、认识细菌的基本形态 湘南学院教师备课3、认识细菌的鞭毛、荚膜、芽胞二．实验内容(一)实验室规则　　１．严肃认真，室内保持安静。认真听讲，仔细操作，课前预习，按时完成实验报告。　　２．注意安全，避免发生事故和实验室感染。穿好工作服,不要用手摸头面部，禁止将食物带入实验室或将实验室物品带出。用过的实验器材放在指定地方。若发生事故，应立即报告老师。离开实验室前，请洗手。　　３．爱护公物，节约使用实验材料。如有损坏应立即报告老师并进行登记，听候处理。　　４．实验后打扫卫生，关好水电门窗。(二)CAI课件学习细菌的三种形态、排列、镜下可见的三种特殊结构（三）显微镜油镜的使用及保护法1、油镜的识别“油”、“oil”、“HI”(HomogeneousImmersion)放大倍数“100×”2、油浸镜的使用原理（绘图讲解）香柏油的折光率近似于玻片的折光率，滴加香柏油能减少光线的折射。3、油浸镜的使用及保护法⑴低倍镜对光 湘南学院教师备课(光线宜强：用凹面采光；聚光器上升；光圈全部打开)。⑵滴油，转换油浸镜。（注意油量，载物台应平放）⑶调焦（先粗后细，注意油浸镜始终浸泡在油中）。保护法：干净纸→二甲苯(去油剂)→干净纸（一字法擦）。(四)细菌基本形态的观察(操作)1、葡萄球菌（G+，菌体球形，葡萄状排列）、2、痢疾杆菌（G-、杆状、短小、散在排列）3、水弧菌(G-，菌体弯曲成弧状、散在排列)(五)细菌特殊结构的观察(操作)注意菌体和各特殊结构的颜色，鞭毛的数目、形态、长短和位置，荚膜的厚度，芽胞的形态、大小、位置。1、鞭毛(变形杆菌)：周鞭毛，有的脱落了。菌体和鞭毛都呈红色。2、荚膜(肺炎球菌)：菌体成双排列，紫色，荚膜无色。3、芽胞(破伤风杆菌)：菌体G+杆状，顶端有一个圆形较菌体大的不着色的芽胞。小结：油浸镜的使用关键是：光线宜强，调焦过程中始终保持油镜头浸在油中，即油镜头与玻片间无空气段。课程名称：医学微生物学 湘南学院教师备课任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验二革兰氏染色法【目的要求】掌握革兰氏染色法、熟悉细菌涂片的制备【教学重点】革兰氏染色方法、结果【教学难点】脱色时间的把握授课时数：2学时讲授方法：实验教学法、示教法教具：示教用玻片、混合菌液、染液、显微镜、粉笔等板书设计：实验二革兰氏染色法（GramStain）一、实验目的二、实验器材1、混合菌液（葡萄球菌与水弧菌）、水弧菌2、染色液：结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%酒精,稀释复红 湘南学院教师备课3、其它：玻片、酒精灯、接种环、显微镜等三、实验原理（略）四、实验步骤及方法五、实验结果（绘图）六、临床意义七、注意事项教学步骤：导言：最经典、最常用的细菌鉴别染色法是革兰氏染色法。由丹麦学者革兰首创。实验二革兰氏染色法（GramStain）一、原理G+菌细胞壁致密、含粘肽多、95%的酒精不易进入，且能使细胞壁脱水浓缩、通透性减低，使胞内染料一碘复合物不易脱出，仍为紫色。而G一菌细胞壁疏松、含粘肽少、脂质多、95%的酒精溶解脂质后易进入细胞而使之脱色，复染后为红色。二、步骤1、制片：⑴涂片：要求薄而均匀⑵干燥：可自然干燥或在火焰上方利用热空气干燥⑶固定：涂膜面向上，在火焰外焰以中等速度通过三次，以玻片反面触及手背皮肤不烫为宜.(固定的目的是什么？) 湘南学院教师备课2、染色：⑴初染：结晶紫染液1分钟⑵媒染：卢戈氏碘液1分钟⑶脱色：95%酒精约30秒⑷复染：稀释复红1分钟3、结果：（绘图）染成紫色的为G+菌，染成红色的为G—菌4、临床意义（提问）5、注意事项：⑴涂片要薄而均匀⑵固定温度要适宜⑶脱色时间要把握好⑷染液的质量、菌龄等要注意（5）染液要均匀覆盖在菌膜上小结：革兰氏染色的关键在于严格把握脱色程度，此外，其结果与培养基成分，培养条件，菌龄及操作技术等有关。思考题：影响革兰氏染色结果的因素有哪些？参考文献：1、柴顺根主编.临床微生物学及检验实验指导.吉林科技出版社，19952、刘晶星主编.医学微生物学与寄生虫学（第三版）.人民卫生出版社，2002，7 湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验三细菌的生理【目的要求】1、了解培养基的制备程序。2、掌握细菌在液体、半固体、固体培养基中的生长现象。3、掌握细菌的接种法。【教学重点】细菌在液体、半固体、固体培养基中的生长现象【教学难点】细菌的接种法。授课时数：2学时讲授方法：实验教学法、示教法教具：培养基成分、菌钟、接种环、酒精灯等板书设计：实验三细菌的生理学一．实验目的 湘南学院教师备课1、了解培养基的制备程序。2、掌握细菌在液体、半固体、固体培养基中的生长现象。3、掌握细菌的接种法。二．实验内容(一)培养基的种类及制备程序（示教）(二)细菌的接种法(操作)(三)细菌培养法(四)细菌在培养基中生长现象的观察(示教)教学步骤：实验三细菌的生理学一、培养基的种类及制备程序（示教）（一）培养基的种类：1、按用途可分为：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基、厌氧培养基。2、按理化性状可分为：固体培养基、液体培养基、半固体培养基。（二）基础培养基的制备程序：调配→溶化→纠正PH值（目测比色法）→过滤澄清→分装→灭菌（此两步依具体情况而定）→检定(质量检验、无菌检验)→冰箱保存。1、调配 湘南学院教师备课量筒取800ml蒸馏水，先加入少量到三角烧瓶中、再按基础培养基配方用天平准确称取各成分，称好后连用纸一并放入三角烧瓶，然后再以剩余的水冲洗瓶壁。2、溶化用玻棒轻轻搅拌，并将称量纸轻轻挑出，也可放在电炉上隔着石棉网加热溶化或（在水浴箱中）隔水溶化。1、矫正PH值：用比色法（单管法、在四孔比色架上进行)矫正时应比实际需要的PH高0.1～0.2注意加碱或加酸时要精确缓慢，每加一滴后要充分混匀，比色不足再加第二滴（有时需控制半滴）4、过滤澄清：可省5、分装：量不宜超过2/3琼脂斜面：试管的，制成斜面长度约试管长度的，趁热将试管斜置，保持试管下端有1cm柱高。平板：9cm平皿倾注培养基13～15ml，倾注平板先轻摇，使培基平铺再静置,待凝固。(倾平板时，让培养基盖过平板底部4/5，此时量即可）斜面、平板都先灭菌后分装、倾注平板、需先冷至500C再倾注、避免过多冷凝水。（斜面可先分装后灭菌、避免污染）6、灭菌：高压蒸气法121.30C,15～30分钟15磅/英寸2、0.103MPa/cm2、1.05Kg/cm2滤过除菌法：用于糖溶液、尿素、血清及其他因加热即破坏的物质。7、检定：无菌检验和质量检查 湘南学院教师备课8、保存；40C冰箱、主要是防止干涸、变质、污染、不宜贮存过久，液体培养基应直立放置，琼脂平板应将底朝上，盖在下（倒置），用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸二、细菌的接种法(操作)人工培养细菌时，需将标本（细菌）接种于培养基再行培养。（一）、接种工具的有关知识接种环：常用于挑标本、菌液、划线接种；接种针：常用于挑菌落、穿刺接种、斜面接种。（二）、接种程序灭菌接种环（针）→俟冷→沾取细菌标本→进行接种（包括启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环（针）灭菌（三）、接种法（依不同用途和不同培养基而定）1、平板划线接种法（1）、曲线划线法（2）、分区划线法接种环与培养基表面呈45度角划线，利用手腕的力量快速在平板上左右来回作密而不重的曲线连续划线，充分利用平板。分区划线时，每画一区要烧灼接种环，后一区的划线与前一区相交数次后，后面的划线不相交。2、斜面划线法（1）纯培养和保存菌种时，可用接种环 湘南学院教师备课也可用接种针。先从斜面底部沿斜面向上划一条直线，再在斜面作“S”划线。（2）、鉴别培养基中用接种针、先穿接种、再在斜面作“S”划线。注意：挑了菌的接种环不要接触试管壁。3、液体培养基接种法此接种法应避免接种环与液体过多的接触，以免形成气溶胶，造成实验室污染。4、半固体培养基接种法（穿刺接种法）不能穿透到底，退出时应按原路线退出。三、培养法1、需氧培养法370C恒温箱倒置培养（平板），试管则竖直在试管架上培养，18～24h后观察。2、厌氧培养法3、二氧化碳培养法四、细菌在培养基中生长现象的观察(示教)接种后细菌经一般培养法(需氧培养法)37℃24h后观察结果。1.在液体培养基中⑴均匀混浊如葡萄球菌;⑵沉淀形成如链球菌;⑶形成菌膜如枯草杆菌。 湘南学院教师备课2.在固体培养基中⑴菌落：不同细菌的菌落其大小、形态、边缘、凹凸、色泽、透明度、溶血等不同。⑵菌苔。3.在半固体培养基中⑴沿穿刺线生长:无动力;⑵向穿刺线周围扩散生长:有动力。注意事项：1.接种时不能划破培养基。2.严格无菌操作。3、分区划线每划完一区需烧灼接种环；液体接种时避免将接种环在液体培养基中搅拌形成气溶胶造成污染。4、接种后及时标上标鉴，标明菌种、时间、姓名。小结：细菌接种在适当的培养基中，经适当的培养基可形成肉眼可见的生长现象，并依不同的生化反应结果进行鉴定。思考题：1.固体、液体、半固体培养基各有何用途？2、简述平板划线接种的目的。参考文献：　　　　　　　　1. 湘南学院教师备课刘晶星主编.医学微生物学与寄生虫学（第三版）.人民卫生出版社，2002，72.倪语星主编，微生物学与微生物学检验实验指导(卫生部规划教材)，人民卫生出版社，2000，2。 湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验四细菌的分布、消毒灭菌【目的要求】1、证实细菌在自然界和人体的分布2、树立无菌观念3、验证高温、紫外线、化学消毒剂对细菌的影响4、熟悉常用的消毒灭菌器【教学重点】细菌在自然界和人体的分布【教学难点】无菌观念的树立授课时数：2学时讲授方法：实验教学法教具：菌种、培养基、棉签、化学消毒剂等 湘南学院教师备课板书设计：实验四细菌的分布、消毒灭菌一、实验目的1、实细菌在自然界和人体的分布2、树立无菌观念3、验证高温、紫外线、化学消毒剂对细菌的影响4、熟悉常用的消毒灭菌器二、实验内容1、空气中细菌的检查（操作）2、咽喉部细菌的检查（操作）3、手指皮肤消毒前后的细菌的检查（操作）4、煮沸消毒试验(示教)5、紫外线杀菌试验（操作）6、药敏试验（操作）7、常用消毒灭菌器的介绍(示教)教学过程：导言：细菌广泛存在于自然界和人体，今天用实验的方法证实细菌在自然界和人体的存在以及外界因素对细菌的影响。实验四细菌的分布、消毒灭菌一、空气中细菌的检查（操作） 湘南学院教师备课沉降法：取普通琼脂，打开皿盖、露于空气中10分钟，盖盖,在皿底注明班组、姓名，倒置于370C温箱培养，24h后观察。结果：计数琼脂平板上的菌落数及形态分析：空气中有细菌的分布二、咽喉部细菌的检查（操作）1、咽拭子法：用无菌棉拭在咽部涂取分泌物，然后将此棉拭涂布于血平板表面，370C24h培养。2、咳碟法：取血平板一个，打开盖，置口腔前10cm处，用力咳嗽3-5次，然后盖盖，370C24h培养。结果：观察菌落数、形态，是否有溶血环。三、手指皮肤消毒前后的细菌检查（操作）取大琼脂平板、分五等份，底部贴标鉴，甲、乙两同学在“消毒前”区用手指涂抹，然后取络合碘消毒此手指，再分别在“消毒后”区涂抹，盖盖，370C24h培养。结果：观察各区菌落数、形态分析：皮肤表面有细菌存在，络合碘可用于皮肤的消毒。(四)煮沸消毒试验(示教)依下表操作：试管号1234接种菌大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌—水浴煮沸5’煮沸—煮沸—24h培养培养培养培养培养 湘南学院教师备课结果澄清混浊菌膜澄清(五)紫外线杀菌试验(操作)原理：(复习提问)方法：1、在平板上涂布接种葡萄球菌，每涂1遍后转60°再涂1遍，共3遍。2、贴放纸片。3、紫外线照射20~30分钟(去盖)。4、去掉纸片，37℃24h培养。结果：原E字纸片覆盖处有菌苔生长。分析：1.紫外线有杀菌作用。2.紫外线穿透力弱。(六)药敏试验(操作)方法：1、接种细菌(涂布接种)。2、贴放药物纸片。3、培养后观察结果，测量抑菌圈直径。(七)常用消毒灭菌器的介绍(示教)1、高压蒸气灭菌器2、干烤箱3、滤菌器小结：细菌分布广泛，应树立严格的无菌观念，在实验操作及临床实践应严格无菌操作。在临床工作中应依不同情况选择适当的消毒灭菌方法。 湘南学院教师备课思考题：1、紫外线的杀菌机理是什么？适用范围是什么？2、了解微生物的分布对护理工作有何指导意义？参考文献：1、倪语星主编．微生物学和微生物学检验指导（第1版，卫生部规划教材）．人民卫生出版社，1999，72、李振林主编，微生物学及检验技术实验指导，广西科技术出版社，1997，5 湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验五病原性球菌【目的要求】1.掌握常见化脓性细菌的形态、染色特点和培养特征。2.熟悉葡萄球菌的色素，金葡菌、甲、乙型溶血性链球菌的溶血现象。3.掌握血浆凝固酶试验、ASO试验的临床意义。【教学重点】血浆凝固酶试验、ASO试验的临床意义。【教学难点】ASO试验胶乳法原理授课时数：3学时讲授方法：讲授法、示教法教具：显微镜、细菌培养物、玻片、接种环等 湘南学院教师备课板书设计：实验五病原性球菌一、实验目的1、掌握常见化脓性细菌的形态、染色特点和培养特征。2、熟悉葡萄球菌的色素，金葡菌、甲、乙型溶血性链球菌的溶血现象。3、掌握血浆凝固酶试验、ASO试验的临床意义。二、实验内容(一)病原性球菌形态的观察(示教)(二)葡萄球菌、链球菌培养物的观察(示教)(三)血浆凝固酶试验(操作)(四)ASO试验(胶乳法)教学过程：实验五病原性球菌一、病原性球菌形态的观察(示教)注意观察其形状、大小、排列及染色性。二、葡萄球菌、链球菌培养物的观察(示教)1、普通琼脂上葡萄球菌可产生三种不同的脂溶性色素，依此分为三类：金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌。2、血液琼脂上金葡菌有宽而透明的溶血环，而白葡菌、表葡菌无溶血环。 湘南学院教师备课3、血液琼脂上，乙链菌落周围有宽而透明的溶血环，甲链周围有窄的草绿色溶血环，丙链周围无溶血环。(三)血浆凝固酶试验----玻片法(操作)1、原理：致病性的葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附着于细菌表面，在玻片上形成凝块。2、方法：在玻片的左右两侧各滴1滴生理盐水，左侧加金葡菌培养物少许，右侧加表皮葡萄球菌培养物少许，磨成细菌悬液，左右两侧各加血浆1滴，混匀，立即观察结果。3、结果：左侧出现凝集块，右侧均匀混浊。4、意义：为鉴定葡萄球菌有无致病性的一个重要指标。(四)ASO试验(胶乳法)1、原理：ASO高滴度的病人血清被适量的溶血素“O”(ASO)中和后，失去了正常水平量的抗体，多余的ASO与SLO胶乳试剂反应，出现清晰均匀的凝集颗粒。2、方法：⑴在反映板三孔上分别滴加稀释血清，阳性和阴性对照血清1滴(50μl)。⑵各孔内滴1滴溶血素“O”溶液，轻摇1分钟混匀。⑶各孔内滴1滴ASO胶乳试剂，轻摇3分钟(室温18~20℃)，观察结果。3、结果：出现清晰凝集者为阳性(ASO≥400IU/ml);不凝集为阴性(ASO≤250IU/ml)。 湘南学院教师备课4、临床意义：ASO阳性可认为患者近期受溶血性链球菌感染过，可辅助诊断风湿热，肾小球肾炎等疾病。注意事项：1、血浆凝固酶试验滴加生理盐水不应过多，以免影响结果观察，观察结果时应在暗视野背景下观察。2、ASO胶乳试剂加入后应在规定时间内观察结果，超过规定时间出现凝集的不列为阳性。待检血浆、SLO、ASO胶乳所加的量应等同。待检血清与SLO须反应2分钟后才能加ASO胶乳。3、血浆凝固酶试验、ASO试验所用过的玻片,应立即投入消毒液缸，防止实验室污染。三、浓汁标本的细菌检验程序(简介)思考题：1、固体、液体、半固体培养基各有何用途？2、ASO试验、血浆凝固酶试验的原理是什么?参考文献：　　　　　　　　1、刘晶星主编.医学微生物学与寄生虫学（第三版）.人民卫生出版社，2002，72、倪语星主编，微生物学与微生物学检验实验指导(卫生部规划教材)，人民卫生出版社，2000，2。 湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验六、肠道杆菌【目的要求】1、了解肠道杆菌形态与常用的生化反应。2、了解粪便中致病性肠道杆菌的分离与鉴定。3、掌握肥达氏反应的原理、临床意义。【教学重点】肥达氏反应的原理、临床意义。【教学难点】粪便中致病性肠道杆菌的分离与鉴定。授课时数：3学时讲授方法：讲授法、示教法 湘南学院教师备课教具：显微镜、细菌培养物、试管等板书设计：实验六肠道杆菌一．实验目的1、了解肠道杆菌形态与常用的生化反应。2、了解粪便中致病性肠道杆菌的分离与鉴定。二．实验内容(一)肠道杆菌形态观察(示教)(二)肠道杆菌培养物与生化反应结果的观察(示教)(三)粪便标本的细菌检验程序(简介)(四)肥达氏反应(示教)教学过程：实验六肠道杆菌一、肠道杆菌形态观察(示教)肠道杆菌为G-短小杆菌、无芽胞，多有鞭毛，从形态上不能鉴定菌种。二、肠道杆菌培养物与生化反应结果的观察(示教)将大肠杆菌、痢疾杆菌、乙型副伤寒杆菌接种到SS琼脂和伊红美蓝琼脂上，培养370C、24h后观察菌落形态。培养基接种菌菌落特征 湘南学院教师备课SS琼脂大肠杆菌中等大小、红色痢疾杆菌中等大小、无色透明乙型副伤寒杆菌中等大小、无色透明伊红美蓝琼脂大肠杆菌中等大小、紫红色痢疾杆菌中等大小、无色透明乙型副伤寒杆菌中等大小、无色透明将大肠杆菌、痢疾杆菌、乙型副伤寒杆菌菌落转种到KIA、MIU上，培养370C、24h后观察生化反应结果。KIAMIU接种菌底层斜面产气H2S动力吲哚尿素酶大肠杆菌黄色黄色+—++—痢疾杆菌黄色红色———+——乙型副伤寒杆菌黑色红+++——三、粪便标本的细菌检验程序(简介)粪便标本→分离致病菌→初步鉴定→最后鉴定方法：⑴取材：根据不同疾病与病程采集不同标本。采取粪便标本应取脓血、粘液便置清洁器内立即送检。若不能及时送检，用甘油缓冲盐水保存。无法获得粪便时，可用无菌棉拭经生理盐水湿润后，插入肛门内4~5cm处轻轻沿肠壁转动一圈后取出，放入含少量甘油缓冲盐水的无菌试管中送检。⑵分离培养：将标本划线接种于S.S琼脂平板上或EMB琼脂平板上。 湘南学院教师备课⑶鉴别培养：从上述平板中挑取无色透明的可疑菌落，接种在半固体双糖铁培养基上进行纯培养及初步鉴定。⑷最后鉴定：根据初步的鉴定，用诊断血清做玻片凝集试验，再选择其它的生化反应(单糖发酵、靛基质试验等)，得出最后结果。四、肥达氏反应1、原理：人感染伤寒杆菌、副伤寒杆菌之后，约经1~2周即可在血清中出现相应的抗体(凝集素)，此种抗体与伤寒、副伤寒杆菌相混合，在适量电解质参与下可出现凝集现象。肥达氏反应是用已知的伤寒杆菌的O抗原、H抗原、甲型、乙型副伤寒杆菌的H抗原与病人血清作定量试管凝集，以测定血清中是否含相应的抗体及抗体的效价，来协助诊断伤寒和副伤寒。2、实验步骤A、稀释待检血清⑴取干燥洁净的小试管28支，以四排七列摆于试管架上并标记序号。⑵以5ml吸管吸取生理盐水3.8ml，放入另一较大的稀释试管内，再以1ml吸管吸取待检血清0.2ml加入生理盐水中混匀，即成1：20的稀释血清。吸取2ml分别加入第一列各管中，每管0.5ml。⑶再向盛有1：20血清的稀释管内加入生理盐水2ml混匀，即稀释成1：40血清，吸取2ml，分别加入第二列各管中，每管0.5ml，如上述继续操作至第六列各管，此时血清之稀释度从第一管到第六管分别为1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640。 湘南学院教师备课⑷向第七管各管中加入生理盐水0.5ml(不加血清)以作对照。B、加诊断菌液⑴按照第一排1-7管加入伤寒杆菌“H”菌液，第二排各管加入伤寒杆菌“O”菌液，第三排各管加入甲型副伤寒杆菌“H”菌液(PA)，第四排加入乙型副伤寒杆菌“H”菌液(PB)，每管均加入菌液0.5ml。这样血清原有稀释度又被稀释了一倍，各排从第1~6管中的血清最终稀释度为1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280。⑵振荡试管架，使其混合均匀，置37℃温箱过夜或8小时，第二天观察结果。⑶结果观察：按试管定量凝集反应结果的观察方法，确定凝集效价。即试管底部见到明显凝集块，上液呈中度混浊的试管为效价管(++)。临床上应以两次标本(病程早期，恢复或中期)的血清效价有无明显上升，作为新近是否感染的指征。单位血清凝集效价“O”应达到1：80以上，“H”应达到1：160以上，PA或PB应达到1：80以上，才具有辅助诊断伤寒、副伤寒的价值。思考题：1、肥达氏反应的原理是什么？　　2、为什么肥达氏反应中O抗原只用一种，而H抗原则用三种？参考文献：1、本教研室编写的医学微生物学实验指导，2000，1。2、 湘南学院教师备课倪语星主编，微生物学与微生物学检验实验指导(卫生部规划教材)，人民卫生出版社，2000，2。课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验七弧菌、厌氧菌及其他细菌【目的要求】掌握弧菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌的形态、染色、培养等生物学特性。【教学重点】水弧菌的动力观察，水弧菌、破伤风杆菌的形态【教学难点】水弧菌的动力观察授课时数：2学时讲授方法：讲授法、演示法 湘南学院教师备课教具：暗视野显微镜、细菌培养物等。板书设计：实验七弧菌、厌氧菌及其他细菌一、实验目的二、实验器材1、细菌：水弧菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌2、培养基：碱性蛋白胨水、庖肉培养基、牛乳培养基、焦性没食子酸培养基3、其它：显微镜、玻片、生理盐水、染液等三、实验内容（一）学习CAI课件（二）厌氧菌培养物的观察（示教）（三）水弧菌动力观察1、压滴法（操作）2、暗视野显微镜法（操作）（四）细菌片的观察（操作）教学过程：导言：霍乱弧菌、水弧菌等具有单鞭毛，能做活泼的穿梭状运动。今天学会用压滴法和暗视野显微镜法观察细菌的动力。实验七弧菌、厌氧菌及其他细菌 湘南学院教师备课一、学习CAI课件二、厌氧菌培养物（示教）1、庖肉培养基中厌氧菌培养物（1）破伤风杆菌在庖肉培养基中生长缓慢。2—7天后培养液变混浊，产酸，肉渣部分消化微变黑，有少量气体，生成的甲基硫醇、H2S等使培养物变臭。（2）产气荚膜杆菌：呈混浊生长，肉渣呈粉红色，不被消化，产气甚多。2、汹涌发酵现象（1）原理：产气荚膜杆菌能迅速分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，并产生大量气体，将凝固的酪蛋白冲散形成分散的海绵状碎块，并将培养基表面的石蜡冲至试管塞处，气势凶猛。（2）方法：用无菌接种环取产气荚膜杆菌庖肉培养物接种于溴甲酚紫牛乳培养基，置350C孵育18～24h，观察结果。3、焦性没食子酸培养法（平板法示教）大培养皿盖加两层纱布（中有脱脂棉），棉上加焦性没食子酸1g，加10%NaOH1ml于棉块上，已接种的血平板盖其上（培养基勿接触棉块），以溶化石蜡封固观察。三、水弧菌动力观察1、压滴法（操作）（1）用接种环取菌液2-3环，置于载玻片中央。 湘南学院教师备课（2）用镊子夹好盖玻片，盖于菌液上，先使盖玻片一边接触菌液，缓缓放下，以不产生气泡为佳。（菌液不能太多或太少）2、暗视野显微镜法（示教）用暗视野显微镜观察水弧菌的动力，可见黑色背景中，发亮的菌体呈穿梭状运动。四、细菌片观察（操作）小结：1、厌氧菌须在厌氧条件下生长，常用的厌氧培养法有庖肉培养基培养法，焦性没食子酸培养法。2、暗视野显微镜法、压滴法、悬滴法可用于观察细菌动力。思考题：1、霍乱弧菌与副溶血性弧菌在耐赶紧性方面各有何特点？2、汹涌发酵现象的原理是什么？有利于哪种菌的鉴定？参考文献：1、倪语星主编.微生物学和微物学检验实验指导（卫生部规划教材）.人民卫生出版社，1999，72、李振林主编.微生物学及检验技术实验指导.广西产学技术出版社，1997，5 湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室授课日期：2007年11月18日第3-4节讲授课题：实验八抗酸染色法【目的要求】1、掌握白喉杆菌、结核杆菌的形态、染色、培养特性2、掌握抗酸染色法的原理、操作、结果【教学重点】抗酸染色法【教学难点】抗酸染色法加温初染的操作授课时数：2学时讲授方法：讲授法、示教法教具：显微镜、细菌培养物、粉笔等 湘南学院教师备课板书设计：实验八抗酸染色法一、实验目的二、实验器材三、实验内容（一）白喉杆菌的形态观察（示教）（二）白喉杆菌、结核杆菌的培养物观察（示教）（三）抗酸染色法（操作）1、原理2、器材3、步骤和方法4、结果（绘图）5、意义6、注意事项教学步骤：导言：白喉杆菌以具有异染颗粒作为其主要的形态特征之一，结核杆菌则在抗酸性、培养性上有其特点。实验八抗酸染色法一、白喉杆菌的形态观察（示教）C+，一端或两端膨大呈棒状。X、L、Y等字母形或栅栏状排列。美兰染色时，着色不均匀，呈节段状着色。 湘南学院教师备课二、白喉杆菌、结核杆菌的培养物观察（示教）1、白喉杆菌：在亚碲酸钾血液琼脂平板上，菌落呈黑色。因白喉杆菌能利用亚碲酸盐，并将其还原为元孝碲，使菌落为黑色。2、结核杆菌：在罗氏培养基上，菌落呈乳白色或米黄色，粗糙颗粒状，表面干燥，常多个菌落聚集在一起形似花菜。（毒力株为R菌落）。三、抗酸染色法（操作）原理：由于分枝杆菌属细菌含有丰富的类脂质，所以不易着色，染色时需延长染色时间，一旦着色后由于脂质中的分枝菌酸具抗酸性,能抵抗盐酸酒精的脱色，胡仍保留初染的红色,其它非抗酸菌含类脂质少,不具抗酸性,易被酒精脱色而被复染成兰色。器材：1、菌液：卡介苗与葡萄球菌的混合菌液2、染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精、碱性美兰3、其它：玻片、试管夹、接种环、酒精灯步骤和方法：1、制片：涂片→干燥→固定2、染色（热染法）：石炭酸复红（加温初染3~5分钟）、冷却水洗，3%盐酸酒精（脱色至无红色染液流下为止）水洗、甩干，碱性美兰（复染1分钟）水洗干燥。冷染法：初染不需加温，只需延长时间至8分钟，其他步骤完全相同。结果：卡介苗染成红色，葡萄球菌染成兰色。意义：用于鉴别结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆菌与非抗酸菌 湘南学院教师备课注意事项：1、加温初染时应掌握好温度，使染液冒蒸气但不沸腾，并及时补充染液以防干涸或玻片炸裂，加染液时可距离火焰远点。2、可适当延长脱色时间，有利于鉴别抗酸菌与非抗酸菌。但一般不超过10分钟。3、冷染时延长时间与室温有一事实上关系，需进一步探讨。小结：1、结核杆菌的染色性、致病性、抵抗力与其菌体成分有关。2、白喉杆菌的异染颗粒有利其形态鉴别。3、抗酸染色法用于鉴别抗酸菌与非法抗酸菌。思考题：1、白喉杆菌的形态染色有哪些特点？2、简述抗酸染色法的原理及意义？3、结核杆菌有哪些培养特性参考文献：1、柴顺根主编：临床微生物学及检验实验指导，吉林科学技术出版社。1995.82、倪语星主编：微生物学和微生物学检验实验指导，人民卫生出版社。1999.7 湘南学院教师备课课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验九螺旋体【目的要求】1、掌握立克次体、放线菌、螺旋体的形态2、熟悉口腔中奋森氏旋体的检查【教学重点】立克次体、放线菌、螺旋体的形态【教学难点】 湘南学院教师备课奋森氏螺旋体的查找授课时数：2学时讲授方法：讲授法教具：显微镜、细菌片、粉笔等板书设计：实验九螺旋体一、实验目的二、实验器材1、细菌片：恙虫病立克次体、放线菌、梅素螺旋体、钩端螺旋体2、革兰氏染液3、其它：玻片、显微镜等三、观察内容1、观察立克次体、梅毒螺旋体、放线菌、钩体的形态2、口腔中奋森氏螺旋体的检查教学过程：实验九螺旋体一、观察立克次体、梅毒螺旋体、放线菌、钩体的形态1、恙虫病立克次体：视野内可见完整或破碎细胞，细胞核呈紫色，细胞浆呈浅红色。要巨噬细胞内有大量紫红色球杆状恙虫病立克次体，成堆密集于核旁。 湘南学院教师备课2、放线菌：由棒状长菌丝呈放射状排列，颗粒核心部位由分枝菌丝交织组成，菌丝未端因包有胶样物质的鞘而呈棒状膨大，折射率强。中心呈G+性，外围呈G—性。3、梅毒螺旋体：镀银染色片，呈棕褐色，小而纤细，菌体直硬，8-14个规则紧密的螺旋，中间略粗，向两端逐渐细，顶端呈尖状。4、钩体：镀银染色片视野呈淡黄褐色，钩体呈棕褐色，删点状连接成S或C形，一端或两端弯曲呈钩状。二、口腔中奋森氏螺旋体的检查（革兰氏染色法）步骤：1、取玻片加NS1小滴于中央，用牙签取牙垢少许与盐水均匀作1涂片。2、干燥后固定。3、按革兰氏染色步骤操作。结果：可见菌体纤细、螺旋浅而不规则，呈淡红色，为G—的奋森氏螺旋体。意义：奋森氏螺旋体常与梭杆菌共生，寄生于正常人口腔齿龈部，当机体抵抗力下降时，两菌协同引起奋森咽峡炎、溃疡性口腔炎等。小结：立克次体为细胞内寄生，常位于核旁，为G—。螺旋体常用镀银染色，为棕褐色，若革兰氏染色，常为G—。思考题：1、奋森氏螺旋体属于哪一个螺旋体属？有何致病作用？2、致病螺旋体中能进行人工培养的是哪一种？常用什么培养基培养？参考文献： 湘南学院教师备课倪语星主编，微生物学和微生物学实验指导（卫生部规划教材），人民卫生出版社，1999，7课程名称：医学微生物学任课老师：授课对象：授课地点：形态学实验室课时量：个学时授课日期：讲授方法：示教法、实验教学法教具：CAI课件、显微镜、玻片、香柏油、去油剂等讲授课题：实验十病毒与真菌【目的要求】1、了解病毒培养方法，熟悉病毒性感染的常用检测方法2、掌握白色念珠菌，新型隐球菌的形态，培养特征3、了解浅部真菌的检查方法【教学重点】白色念珠菌的假菌丝、新型隐球菌的厚荚膜 湘南学院教师备课【教学难点】浅部真菌的菌丝、孢子的观察授课时数：2学时讲授方法：讲授法、示教法教具：显微镜、真菌培养物、染色液、粉笔等板书设计：实验十病毒与真菌一、实验目的二、实验器材三、实验内容（一）学习CAI课件（病毒学实验内容）（二）真菌形态、结构观察（白色念珠菌革兰氏染色）（三）真菌培养物观察（示教）1、大培养（试管法）2、小培养（玻片法）3、厚膜孢子、芽管形成（四）浅部感染真菌的检查（操作）（五）新型隐球菌的墨汁染色（操作）教学过程：实验十真菌 湘南学院教师备课一、真菌形态、结构观察（示教片）1、新型隐球菌：墨汁染色、高倍镜下可见有很厚的荚膜包围在菌体的周围，透明发亮，还可见到菌体发芽，菌体呈球形，大小不等。2、白色念珠菌：乳酸酚棉蓝染色，油镜下可见菌体呈卵圆形，较葡萄球菌大2～5倍。出芽伸长而形成假菌丝。在假菌丝生长点有有芽生孢子。3、大分生孢子：高倍镜下可见，呈纺缍形，具有分隔，每隔为一个细胞。二、真菌培养物观察（示教）1、大培养（试管法）将新型隐球菌、白色念珠菌、絮状表破癣菌接种于沙保弱化培养基（斜面），置370C，卵育3-7天后，观察菌落特征。（1）酵母型菌落：圆形、较大、白色、边缘整齐，表面湿润光滑，如新型隐球菌。（2）类酵母型菌落：与酵母型菌落相似，但菌落底层有假菌丝长入培养基内。如白色念珠菌。（3）丝状菌落：由多数分支的菌丝体组成的疏松菌落。可为棉絮状、绒毛、粉末状，其正面、背面可显示各种不同颜色。如絮状表皮癣菌。三、真菌小培养法（操作）玻片法：在无菌玻片上，用无菌吸管吸取已灭菌并溶化、冷却至500C左右的沙氏培养基铺平成1cm×1cm 湘南学院教师备课左右的琼脂块，待凝固后，用刀片将琼脂块周围稍做修理，用接种针挑取白色珠菌培养的物在琼脂表面划线接种，盖上无菌盖玻片、置湿盒中、放350C恒温箱培养。结果：逐日镜下动态观察生长过程，（次日观察时可见假菌丝和孢子）四、浅部感染真菌的检查（操作）1、制片：用小镊子取标本→置玻片上→滴1～2滴10%KOH→加盖玻片→于火焰上缓慢加热→使组织及角质尽溶解、皮屑周围出现小气泡→冷却、轻压盖玻片，使组织分散、透明。2、镜检：先用低倍镜观察有无真菌菌丝和孢子，再用高倍镜观察菌丝、孢子特征。临床意义：发现真菌菌丝或孢子可初步判断为真菌感染注意事项：1、KOH浓度以10%为佳，角质层增厚则增加浓度。浓度过高易干燥形成结晶。2、要保存标本，可使用等体积的50g/LKOH和250g/L甘油的混合液。3、加热时要防止沸腾，温度过度，也可使KOH形成结晶，影响观察。五、新型隐球菌的墨汁染色（操作）器材：1、菌种：新型隐球菌2、试剂：优质墨汁3、其他：载玻片、盖玻片、镊子、显微镜方法：1、玻片上加2环NS 湘南学院教师备课2、接种环无菌取少许新型隐球菌培养物，磨匀3、加2环优质墨汁、混匀4、盖上盖玻片，避免出现气泡5、镜检结果：背景为黑色、菌体为灰黑色、外有一层无色透亮的荚膜。临床意义：常用于新型隐球菌的检查。注意事项：1、掌握好墨汁浓度，过浓不易观察，过淡荚膜衬托不出。2、掌握好菌液浓度，过浓菌体堆积不易看清结构，过淡寻找费时。3、液体不能过多或过少,过多溢出造成污染,过少易出现气泡小结：1、两种形态2、三种菌落形态3、菌丝、孢子形态有利真菌鉴定思考题：1、真菌小培养有何优点？2、如何进行浅部感染真菌的直接检查？3、新型隐球菌墨汁负染色法应注意哪些操作事项？参考文献：1、倪语星主编，微生物学和微生物学检验实验指导（卫 湘南学院教师备课生部规划教材），人民卫生出版社，1999，72、刘晶星主编.医学微生物学与寄生虫学（第三版）.人民卫生出版社，2002，7