2014-9 神经生物学实验报告-动物脑的立体定位技术.

脑立体定位技术及切片制备一、实验目的通过本实验，了解动物脑立体定位及切片制备，并基本掌握动物脑立体定位技术及切片制作。二、实验设备及要求实验分两部分：Ⅰ大鼠脑立体定位（纹状体）[器材和药品]立体定位仪、10％水合氯醛溶液、1ml注射器、手术刀、粗剪刀、组织剪、止血钳、牙科钻或骨钻、金属定位针、脱脂棉花、3%双氧水（H2O2）、生理盐水、75%酒精，墨水。[实验动物]雄性SD大鼠（200-300g）Ⅱ大鼠脑切片制备[器材和药品]器械：手术刀、组织剪、止血钳、咬骨钳、无齿钳、5ml注射器、6号针头、灌注瓶、恒冷切片机液体：4％多聚甲醛溶液三、实验步骤Ⅰ大鼠脑立体定位（纹状体）1.立体定位仪的一般校验2.动物麻醉：动物称重后，水合氯醛溶液按3.6ml/kg作腹腔注射麻醉。3. 头部固定： （1）插入耳棒：先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样插入固定另一耳棒。检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否对称，轻移耳棒使两侧刻度一致头位完全居中，再次固定耳棒。三个标准检测是否固定成功：鼻对正中，头部不动，提尾不掉。（2）固定上颌：将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部，均不应出现移动。通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上，并使前后囟在同一水平线上。4.开颅：剪去头部的毛，用75%酒精棉球作头部皮肤的消毒，沿矢状缝作切口，剥离筋膜及肌肉，推开骨膜，并用3%双氧水洗净，用干棉球擦拭，暴露骨缝，止血。 5.脑内核团定位:（1）根据脑图谱，确定所要纹状体的立体位置，（纹状体：前囟前1mm,旁开2.5mm,深3.5mm）。（2）用定位针参照中线和前后囟在颅骨上标记进针的部位后，在指定位置钻孔，有突破（落空）感后，停止钻孔。6.定位标记及组织学鉴定：（1）定位标记：根据定位坐标，插入微量注射针，注入染料。（2）组织学鉴定：动物处死后，大鼠用左心室—主动脉插管（右心室开孔，便于灌洗液流出），先后用生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌流固定,取脑作冰冻连续切片，观察确定注射位置是否准确。（第二部分实验详述）Ⅱ大鼠脑切片制备 1.组织固定（灌注固定）（1）减开胸腔，暴露心脏（2）将注射针头插入左心室，减开右心耳（3）放松输液管夹，先用生理盐水冲去血液，直至右心耳流出液体清亮无色（一般原则灌洗量不宜过多，灌洗时间不宜长。大鼠一般100ml）（4）换以固定液继续灌流，先快后慢，固定液的量，大鼠一般为300-500ml左右（5）开颅取脑，固定→切片 2.切片切片刀的安置：刀的刃面与组织切面之间应有一定的角度，称为余隙角a。余隙角一般在2~5°组织冷冻：冷冻适度，过冷可致切片横向断裂、冷冻不足，切片容易厚薄不匀切片：动作连贯 四、实验结果了解了脑立体定位仪及切片制备基础知识，并在团队合作下完成了大鼠脑立体定位（纹状体），以染料定位，以组学鉴定（切片）观察定位结果。本次试验定位空间上深度稍微欠妥，染料着色正常，切片制备正常。五、讨论分析立体定位技术指利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究。为此，掌握这门技术对于日后研究工作有非常大的帮助。本次实验注意点有如下：①大鼠固定：实验开始前，我们一直尝试用耳杆进行固定，但始终不能对齐。最后在老师的指导下，我们使用了耳杆适配器，很轻松的便完成了固定。②游标卡尺在使用时一定注意记录读数，便于后期再次定位。③注射染料时，速度一定要慢，给予组织充分的时间去吸收，不然极易导致染料冒出。④微量注射针刺入大脑时，应注以针尖中后段为准，避免插入深度不足。⑤取大脑时，为了不伤及脑组织，应从脊髓处入手；并在基本暴露大脑后，用钳子一并取出脑组织。⑥切片时，镊子等工具使用完后应放回操作箱中保温；且切片取出后，应迅速将切片放入指定位置，以免融化。此外，本次试验也有一些小的疑惑需要进行讨论：①介于大鼠露骨较脆，可否不进行钻孔直接通过微量注射针打入染料。此法可以避免因移动坐标尺导致的误差，同时也可以保证颅骨处于封闭状态避免染料冒出。②本次实验采用的取大脑方法极易损坏小脑，不利于小脑相关实验的使用。实验者：丁力学号：14211220036日期：2014-9-27 书是我们时代的生命——别林斯基　　　　书籍是巨大的力量——列宁　　　　书是人类进步的阶梯———高尔基　　　　书籍是人类知识的总统——莎士比亚　　　　书籍是人类思想的宝库——乌申斯基　　　　书籍——举世之宝——梭罗　　　　好的书籍是最贵重的珍宝——别林斯基　　　　书是唯一不死的东西——丘特　　　　书籍使人们成为宇宙的主人——巴甫连柯　　　　书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔 　　　　人的影响短暂而微弱，书的影响则广泛而深远——普希金　　　　人离开了书，如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫　　　　书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉——库法耶夫　　　　书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯　　　　书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的，是富有启发性的养料。而阅读，则正是这种养料———雨果