分子生物学综述(1)

糖蛋白抗肿瘤的研究进展　　[摘要]　糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子，是细胞的识别及体内功能多为糖蛋白介导。其独特免疫原性使其在抗肿瘤方面具显著效果。在这近几年来，糖蛋白发展迅速，本文就糖蛋白结构、功能及抗肿瘤方面研究进展进行综述。[关键词]　糖蛋白；生物学功能；抗肿瘤；前言 糖蛋白在生物体内是重要的生物活性物质，其糖链和蛋白相互作用介导细胞的专一性识别，调控各种生命过程如受精、发育、神经系统的维持，在目前炎症及癌细胞异常增殖、自身免疫系统中起重要作用。笔者就其糖蛋白的功能、及抗肿瘤方面国内外研究现状做一综述。1生物学功能1－1　构成α-构型血抗原的基本物质　构成血型的抗原为血型糖蛋白，是一组含大量唾液酸糖链的跨膜蛋白，无论ABO血型系统或MN血型系统都是由血型糖蛋白决定。寡糖链的识别作用决定着细胞的识别、集聚和受体作用。1－2构成细胞表面受体，与细胞识别和黏着有关　一些外源凝集素、毒素以及病原体的受体均是糖蛋白。一些植物凝集素可使血液细胞发生凝集，动物凝集素不仅在体液免疫中起作用，还和肿瘤转移作用有关[1]。不同性别性细胞相互作用成合子或聚集成组织，都以糖和与糖专一结合的蛋白质间的识别和结合为前奏，特别是与糖链的结构与识别功能有关，为医疗上避孕提供了新的可能途径[2]。利用精细胞表面糖蛋白特异结合的特性，将外源基因导入成熟精子，使外源DNA进入卵中受精，可借此产生优良品种[3]。1－3物质运输功能　一些糖蛋白如运血红蛋白、转铁蛋白受体等可与各种特有的物质结合，将其运输。糖蛋白兼有传递信息功能，在糖蛋白激素中，糖链在激素信号传入细胞过程中担负重要作用[4]。1－4其他功能　糖蛋白还和免疫反应及神经传导有关。如一种GlycodelinA糖蛋白在生殖免疫过程中，在母胎抗排斥免疫中发挥重要作用[4]。某些细胞膜的糖蛋白还有酶活性。在以上诸多糖蛋白的生理功能中可以看出，糖链的结构起决定性的作用。2　糖蛋白抗肿瘤的国内外研究现状 从体液及各种生物中分离出的糖蛋白，具有各种抗菌、抗凝血、抗肿瘤等生物活性。糖蛋白类及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应。例如，将乳糖接到门冬酰胺酶上，利用乳糖定向归巢到肝细胞，使门冬酰胺酶进入肝细胞，可治疗肝癌。不同来源的糖链结构有相似之处，说明以体液糖蛋白代替膜上复合糖类或在高等动物以外寻找利用于人体的半抗原糖类作为药物是可能的。人体内存在一些唾液酸含量较高的糖蛋白，如α1酸性糖蛋白(AAG)和Tam-horsefall蛋白，能抑制流感病毒和宿主细胞的黏着。多数糖蛋白糖含量在20%以下，而AAG的糖含量达到40%以上[5]。AAG免疫抑制活性表现在能抑制血小板凝集，也与肿瘤有关。AAG还能与药物结合起到药物传送的作用。研究还发现了几种与肿瘤相关的糖蛋白。利用血清或尿液中糖蛋白糖链的结构异常来诊断恶性肿瘤，如利用凝集素将甲胎蛋白(AFP)分成多种糖链结构不同的异构体，可用于原发性肝癌的诊断[6]；Pg-P是一种跨膜糖蛋白，是介导乳腺癌耐药机制逆转耐药的重要靶点，近年已有不少新的逆转药物被发现并试用于临床[7]；TAG72可作为消化道肿瘤重要的血清指标；黏糖蛋白-2(MUC2)在大肠癌中的阳性率为70%[8]；CA125是胚胎发育期腔上皮表达的一种高分子糖蛋白，可以作为卵巢癌的标记物；前列腺特异性抗原(PSA)是前列腺上皮细胞合成并分泌至精液中的一种相对分子质量为3300~3400、含糖量为7%的前列腺癌相关糖蛋白，作用于消化精囊特异性抗原，使其作为肿瘤标记物的特殊糖蛋白，在肿瘤存在时，可异常增加，对诊断颇为重要[9]；CD44是细胞表面的整合膜糖蛋白，CD44H能使肿瘤形成提早，肿瘤形成率从30%提高到90%，瘤生长速度加快。而CD44E却抑制瘤生长，瘤形成率几乎为零，其表达水平与黑色素迁移率有正向关系[10]。CA242是一种唾液酸化的黏蛋白类的肿瘤相关抗原，在胰腺癌中检出率较高[11]。已经发现恶性肿瘤关糖蛋白种类很多，表明恶性肿瘤组织细胞的生成与糖蛋白的合成、分泌有密切关系。绿十字社和美国田纳西大学将尿激酶分离精制得到一种相对分子质量2~4万的糖蛋白，试验表明其对人正常细胞没有作用，而对乳腺癌、肺癌等的癌细胞增殖有显著的抑制作用[12]。上海海军医药学专业中心近年从海蛤和无齿蚌中提取分离出抗动物移植肿瘤的活性物质，经鉴定组分为糖蛋白，高剂量对小鼠S180抑瘤率达72%以上。Sasaki等对软体动物(Mollusks)海蛤、牡蛎、马贼、海螺、鱿鱼等进行了研究，证明Paolins为具抗菌和抗病毒活性的一种糖蛋白，只需少量或中等活力就可抑制小鼠S180；且还具抗白血病作用。3　结语糖蛋白对人类健康的重要作用越来越受到重视。利用海洋生物的结构多样性及独特的生物活性，国外已有研究报道其显著的抗肿瘤及抗艾滋病活性，寻求生物利用性好的活性糖蛋白大分子，利用现代分析技术研究其结构，从分子水平阐释其对疾病的作用机理。目前利用糖蛋白的靶向性设计抗肿瘤药物，以及应用免疫原性制备多糖结合疫苗，激发免疫系统达到治疗目的，通过生物疗法提高治疗效果，已成为越来越重要的治疗手段。 [参考文献] [1]　韩益飞，徐世青，朱江，等.糖蛋白的结构与功能[J].JBiol，2001，18(2)∶1-3.[2]　王荣海.浅谈糖蛋白[J].生物学通报，1993，28(11)∶12-13.[3]　刘慧慧，李太武，苏秀榕.糖蛋白及其在动物精卵识别中的作用[J].MarSci，2004，28(1)∶67-70.[4]　高丽丽，王长智，朱正美.Glycodelin-A糖蛋白及其在生殖免疫中的作用[J].生命化学，2002，2(4)∶332-334. [5]　王克夷.α-酸性糖蛋白[J].国外医学·分子生物学分册，1991，13(4)∶167-169.[6]　陈国千.糖蛋白糖链结构分析与恶性肿瘤诊断[J].国外医学·临床生物化学与检验学分册，2000，21(4)∶171-173.[7]　李杰.P-糖蛋白介导的乳腺癌耐药及逆转的研究特点[J].上海第二医科大学学报，2004，24(6)∶494-496.[8]　孙思鑫，谢彦博，栾召强，等.黏糖蛋白-2载大肠癌中的表达[J].实用肿瘤学杂志，2004，18(5)∶366-367. [9]　齐为民.肿瘤相关糖蛋白的研究进展[J].国外医学.临床生物化学与检验学分册，1994，15(2)∶56-58.[10]　金顺钱，张伟.042细胞表面糖蛋白CD44研究进展[J].国外医学·免疫学分册，1994，17(2)∶85-90.[11]　李永军，曹青.糖蛋白242、199检测在胰腺癌诊断中的应用[J].上海医学检验杂志，2001，16(6)∶368.[12]　ScottLB.The“Lecithotrophic”seaurchinheliocidariserythrogrammalackstypicalyolkplaletesandyolkglycoproteins[J].DevBiol，1990，138(10)∶188-193.   基因治疗中的非病毒载体研究进展摘要添加、修复或替换基因从而达到直接排除病因是基因治疗的目的，也是用于治疗遗传性和获得性疾病的治疗方法。它包括目的基因、载体和靶细胞三个方面，其中载体在整个传染过程中起着关键的作用。非病毒载体是该研究领域的热点之一，虽然传染效率不如病毒载体，但其无毒、无免疫反应、性质可调且制备方便。本文就其近年来的研究进展作一综述。关键词非病毒载体；裸DNA；脂质体；阳离子多聚物；PEI前言人类基因组草图的绘制完成及深入研究将为基因治疗打下坚实的基础，基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域，基因治疗药物将对医药工业产生深远的影响。目前80%的研究仍采用转染率较高的病毒载体，但病毒载体存在许多不足，主要体现在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小、靶向特异性差、制备较复杂及费用较高等问题[1]，因此，近年来非病毒基因治疗载体倍受关注，也正是当前药剂学研究的前沿课题。为此，本文就其研究进展作一概述。目前常用的非病毒载体包括裸DNA、脂质体载体、阳离子多聚物型载体和PEI等。1 裸DNA将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其它物质的介导，是最简单的非病毒载体系统。电穿孔（electroporation）技术和微粒子轰击法（microparticlebombardment,此法也称作基因枪）的出现，大大提高了裸DNA的转染效率，而且使DNA可直接到达细胞核，避免了各种酶对DNA的降解。目前使用的DNA疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌内注射，可获得有效的抗病毒免疫。裸DNA虽能有效运转并表达目的基因,但缺乏靶向性,并且只能在局部作用,不能转染大量细胞,经常需要进行外科手术以暴露靶器官,使用时局限性较大。[2]2 脂质体或脂质复合物 脂质体一般由阳离子脂质和中性共脂质组成，前者由阳性亲水性首基、交联剂、疏水性部分三个基本结构域组成，为阳性两亲化合物，压缩DNA形成脂质复合体。颗粒大小、zeta电位、DNA/脂质体比、溶液离子强度等均影响脂质复合体的形成、稳定性和转染效率。改进三个基本结构域的设计可提高脂质体的效能：选择可识别DNA的首基，如天然的结构或功能基团、非氨基性阳离子部分；引入可应答各种生物学刺激的易变性交联剂，以诱导DNA定时释放；修饰疏水性部分以获得最佳结构[3]。预先通过鱼精蛋白压缩DNA，再与脂质体络合，可使脂质重排，形成结构致密的脂质体/鱼精蛋白/DNA络合物，颗粒大小较脂质复合体减少3到5倍，基因投递率提高[4]。Junghans等[5]用脂质体鱼精蛋白/DNA络合物投递反义c-myc寡核苷酸，发现寡核苷酸稳定性增加，下调U937细胞系c-myc表达。经聚乙二醇表面修饰可提高络合物转染效率和靶向性。脂质体成分所致的毒性反应限制了其临床应用，应用各种浓度的辅助脂质可优化脂质复合体。另外，Liu等[6]报告于脂质复合体中加入免疫抑制基因可显著减少TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的产生，并且不影响生物学分布。类似刺激应答多聚体，可设计环境敏感型脂质体以加强DNA释放，从而增强目的基因表达[7]。3　阳离子多聚物阳离子多聚物包括合成的或天然的大分子。合成的聚合物有肽，如聚左旋赖基酸、聚左旋鸟氨酸、聚4-羟基-脯氨酸酯聚胺类，如聚乙烯亚胺(PEI)(线状或分支状)、聚丙烯亚胺(PPI)；聚酰胺类，如PAMM树枝石[8]。天然的聚合物包括一些蛋白，如组蛋白和人血清蛋白；多糖类，如壳聚糖等[9]。阳离子多聚物与脂质体相比，由于聚阳离子由特定重复结构组成，可以通过化学修饰提高转染率及靶向性，且有血清敏感性，所以引起很大的关注，是一类很有前景的非病毒载体系统。 4 聚乙烯亚胺（PEI）依乙酰亚胺单元连接方式的不同，多聚乙酰亚胺可为线性或分支状。材料特性(如相对分子质量、分支程度、阳离子电荷密度及缓冲能力)、多聚复合物特性(如DNA含量、颗粒大小及zeta电位)及实验条件(如多聚复合物浓度、转染过程中血清存在与否、孵育时间、转染模型)均可影响分支型多聚乙酰亚胺的效应/细胞毒性比。线性多聚乙酰亚胺似乎优于分支状，因前者可非细胞周期依赖性转运DNA入胞核，明显提高细胞存活率及转染效率[10]，但目前应用分支型转染者居多。多聚乙酰亚胺可有效压缩DNA、保护DNA和破坏内体膜，为转染效率最高的阳离子多聚体之一，但毒性反应限制其在基因治疗中的广泛应用。修饰聚乙二醇化、甲基化、胆固醇化等可避免毒性反应同时保持其高转染效率。结语总之，非病毒载体转导的外源基因不会整合入宿主细胞的染色体中，不会使插入位点附近的基因过度表达或失活，也无插入突变的危险，因此，其安全性可能优于病毒载体。但非病毒载体的研究还不是很成熟,因此还必须深入研究外源基因进入细胞的各种屏障及其细胞和分子机制。可以相信，通过对非病毒基因载体基础和应用的深入研究以及各学科的共同努力下，将会使非病毒基因载体的基因治疗取得最大的疗效，同时最大限度地降低不良反应。参考文献[1]朱玉贤，李毅.现代分子生物学(第二版).高等教育出版社,331[2]朱玉贤，李毅.现代分子生物学(第二版).高等教育出版社,331-332 [3]MartinB，SainlosM，AissaouiA，eta1．Thedesignofcationiclipidsforgenedelivery．CurrPharmDes，2005，l1：375-394．[4]E1-AneedA.Anoverviewofcurrentdelivcrysystemsincancergenetherapy．JControlRelease．2004．94：1-14．[5]JunghfillsM，LoitsehSM，SteinigerSC，eta1．Cationiclipid-protamine-DNA(LPD)complexesfordeliveryofantisensec-mycoligonueleotides．EurJPharmBiophann，2005．60：287-294．[6]LiuF，ShollenbergerLM，HuangL．Nonimmunostimulatorynonviralvectors．FASEBJ．2004．18：1779-1781．[7]ConwellCC，HuangL．Recentgdvoxleesinnon-viralgenedelivery．AdvGenet。2005，53：3-18．[8]NakanishiM，NoguchiA.Confocalandprobemicroscopytostudygenemediatedbycationicliposomeswithacationiccholesterolderivative．AdvancedDrugDelveryReviews，2001，52：197-207．[9]SethuramanVA，NaK，BaeYH．pH-responsivesulfonamide／PEIsystemfortumorspecificgenedelivery：aninvitrostudy．Biomacromolecules，2006，7：64-70．[10]LungwitzU。BreunigM，BlunkT，eta1．Polyethylenimine—basednonviralgenede．1iverysystems．EurJPharmBiopharm，2005．60：247-266．  蛋白质组学研究相关技术进展【摘要】　蛋白质组学是以生物体系整体蛋白质为研究对象的新的研究领域。近年来,蛋白质组学研究取得了令人鼓舞的进展,一些新技术也得到迅猛的发展和改进,如双向凝胶电泳、生物质谱、生物传感芯片质谱、蛋白质芯片和生物信息学等。【关键词】　蛋白质组学;　双向凝胶电泳;　生物质谱;　生物芯片;　生物信息学 2003年4月14日,科学家宣布人类基因组计划已顺利完成,99%的人类遗传密码被破译,人类基因组图谱比预期提前2年绘制完成,并提示与蛋白质合成有关的基因只占基因组的2%。尽管DNA可以提供很多的信息,但蛋白质才是细胞功能的全部体现。因此,研究的重点将转向基因的表达与调控以及表达产物的功能研究。 蛋白质组学的产生和概念蛋白质组指的是全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式,是一种细胞、组织或完整生物体在特定时空上所拥有的全套蛋白质。蛋白质组学不同于传统的单个蛋白质或某一类蛋白质研究,它研究的是体系内全部的蛋白质及其动态变化规律,包括:蛋白质大规模鉴定及翻译后修饰的微特征研究;差异显示蛋白质组学, 即对肿瘤等异常疾病有着广泛应用前景的蛋白质表达水平的比较;应用质谱技术、串联亲和纯化技术和酵母双杂交体系对蛋白质之间相互作用的研究。[1] 蛋白质组学的研究技术蛋白质组学研究主要依赖4大技术:蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、蛋白质相互作用分析及生物信息学(包括构建、分析双向电泳凝胶图谱以及数据库的构建与搜索)。 蛋白质分离技术1.双向凝胶电泳（2-DE）目前惟一可在一块胶上同时分离成千上万个蛋白质组分的方法,尤其是固相pH梯度凝胶电泳的发明和完善,可避免因载体两性电解质引起的重复性差、pH梯度不稳定、出现阴极漂移等缺点,改善双向电泳的稳定性和重复性。2.高效液相色谱技术(HELP):HPLC蛋白质得到高灵敏度的层析分析,它基于样品分子在固定相(即柱填料)和流动相(即淋洗液)之间的特殊相互作用而实现分离。样品无需变性处理,可直接分离;并可实现上样、收集、在线分析的自动化,且无需对分离结果进行染色处理。3.差异凝胶电泳(DIGE):应用两种不同的荧光染料分别标记不同的蛋白质样品后等量混合,2-DE后置于荧光显微镜下观察,如同一斑点可见两种荧光即说明此蛋白质可同时在两种样品中表达;反之,则说明蛋白质只在相应样品中表达。4.毛细管电泳(CE)技术:CE技术是在高电场强度作用下,对毛细管(内径5~10μm)中的待测样品按分子质量、电荷、电泳迁移率等差异进行有效分离,主要包括毛细管区带电泳、毛细管等电聚焦以及筛板-SDS毛细管电泳等技术。CE技术对蛋白质的分离可实现在线自动分析,并可用于分子量范围不适于2-DE的样品,但也存在对复杂样品分离不完全的缺点。[1] 蛋白质鉴定技术1.质谱(massspectrometry,MS)技术:经2-DE分离得到的蛋白质通常数目多、量少;MS以其高通量、高灵敏度,可自动化,与蛋白质组大规模研究相适应以及能提供精确的分子量和结构信息等优点,已基本取代了传统的埃德曼降解法测定N端序列,成为蛋白质鉴定的支撑技术。MS是将样品分子离子化后,根据不同离子间质荷比的差异来分离并确定相对分子质量。2.同位素标记亲和标签法(ICAT):将两种不同样品分别标记轻同位素和重同位素后混合、酶切、亲和层析,再进行在线高效液相色谱-串联质谱分析即可定量检测蛋白质的表达情况,能较准确的鉴定不同状态下细胞或组织中差异表达的蛋白质。 蛋白质相互作用分析:(1)生物传感芯片(biosensorchip)质谱:它是生物分子相互作用分析技术(biomolecularinteractionanaly-sis,BIA)与MALDI-TOF-MS有机结合的产物,核心为一小块由金黄色玻璃底物构成的生物传感芯片。在BIA中,可溶性蛋白质与结合在芯片表面的相应固定生物分子———受体相结合而滞留在芯片上,再与加入的基质结合而与受体分子解离,即可进行MALDI-TOF-MS检测,极大地提高了检测的灵敏度与自动化程度。多用于筛选功能性蛋白质和在蛋白质水平上筛选基因的多态性,有效地将基因与蛋白质结合起来。(2)蛋白质芯片(proteinchip):蛋白质芯片是高通量、微型化且自动化的抗体与蛋白质阵列技术,能够快速、高效、平行、高通量地分析蛋白质组,并能鉴定蛋白质之间或蛋白质与磷脂之间、与药物等小分子之间的相互作用,甚至还能鉴定酶与底物之间的相互作用,是蛋白质组学研究比较有发展潜力的技术之一。根据研究目的不同,探针蛋白可选用具有高度特异性、亲和性和生物活性的蛋白质,如抗原、抗体、受体或酶等。[1] 生物信息学 生物信息学是以生物大分子为研究目标,辅以计算机为工具,运用信息学和数学理论方法来研究生命现象,通过对生物大分子信息的获取、加工、分类、检索、分析与比较,最终获得其生物学意义的一门科学和研究方法。可用于寻找蛋白质家族保守序列,并可对蛋白质高级结构进行预测,是蛋白质组学的重要组成部分。目前,生物信息学在蛋白质组学方面的应用主要有:构建与分析双向凝胶电泳图谱;数据库的建立和搜索;蛋白质结构的预测;各种分析及检索软件的开发与应用。这些都极大地提高了蛋白质组学的研究效率。[2] 展望随着研究技术的日益成熟,蛋白质组学在揭示诸如生长、发育和代谢调控等生命活动规律方面已有所突破,在生命科学领域、疾病基因组研究和新药开发、药物毒理学等方面的研究应用也越来越广泛。相信随着全世界生命科学研究的持续快速发展,蛋白质组学及其研究技术必将成为21世纪的核心学科之一,并将切实而广泛地对人类生活带来巨大影响,为人类进步和发展作出更大的贡献。  参考文献[1]金宏伟,黄回滨,陈振胜.蛋白质组学研究相关技术进展,国外医学(临床生物化学与检验学分册),2005年12期.[2]赵晓瑜,李继刚.实用分子生物学技术,化学工业出版社,2006年