微生物的营养与培养基

微生物的营养与培养基营养物质:能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理活动所需要的物质.（结构物质、能量、代谢调节物质和生理环境等）营养:微生物获得和利用营养物质的生理过程。营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是微生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。第一节　微生物的营养六要素一、微生物的化学组成主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙等占细菌细胞干重的97%微量元素：锌、锰、氯、钼、硒、钴、铜等二、微生物的营养要素营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可以将它们区分成六大类。　六要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水1.碳源(carbonsource)在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质有机碳异氧微生物碳源谱无机碳自养微生物微生物利用的碳源物质主要有糖类、有机酸、醇、脂类、烃、CO2及碳酸盐等。对于为数众多的化能异养微生物来说，碳源是兼有能源功能营养物。目前在微生物工业发酵中所利用的碳源物质主要是单糖、淀粉、麸皮、米糠等。表微生物利用的碳源物质种类碳源物质备注糖葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、半乳糖、乳糖、甘露糖、纤维二糖、纤维素、半纤维素、甲壳素、木质素等单糖优于双糖，己糖优于戊糖，淀粉优于纤维素，纯多糖优于杂多糖。有机酸糖酸、乳酸、柠檬酸、延胡索酸、低级脂肪酸、高级脂肪酸、氨基酸等与糖类比效果较差，有机酸较难进入细胞，进入细胞后会导致pH下降。当环境中缺乏碳源物质时，氨基酸可被微生物作为碳源利用。醇乙醇在低浓度条件下被某些酵母菌和醋酸菌利用。脂脂肪、磷脂主要利用脂肪，在特定条件下将磷脂分解为甘油和脂肪酸而加以利用。烃天然气、石油、石油馏分、石蜡油等利用烃的微生物细胞表面有一种由糖脂组成的特殊吸收系统，可将难溶的烃充分乳化后吸收利用。CO2CO2为自养微生物所利用。碳酸盐NaHCO3、CaCO3、白垩等为自养微生物所利用 其他芳香族化合物、氰化物蛋白质、肋、核酸等利用这些物质的微生物在环境保护方面有重要作用。当环境中缺乏碳源物质时，可被微生物作为碳源而降解利用。1.氮源(nitrogensource)凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。有机氮蛋白质核酸铵盐作为氮源时会导致培养基pH值下降，称为生理酸性盐。而以硝酸盐作为氮源时培养基pH值会升高，称为生理碱性盐。氨基酸尿素氮源谱NH3铵盐无机氮硝酸盐N2按氮源的不同生物可分为：氨基酸自养型生物：能利用尿素、铵盐、硝酸盐甚至氮气的生物氨基酸异养型生物：从外界吸收现成的氨基酸作为氮源的微生物常用的蛋白质类氮源包括蛋白胨、鱼粉、蚕蛹、黄豆饼粉、玉米浆、牛肉浸膏、酵母浸膏等速效性氮源：迟效性氮源：如玉米浆相对于豆饼粉，NH4+相对于NO3-为速效氮源。表微生物利用的氮源物质种类氮源物质备注蛋白质类蛋白质及其不同程度降解产物(胨、肽、氨基酸等)大分子蛋白质难进入细胞，一些真菌和少数细菌能分泌胞外蛋白酶，将大分子蛋白质降解利用，而多数细菌只能利用相对分子质量较小其降解产物氨及铵盐NH3、(NH4)2SO4等容易被微生物吸收利用硝酸盐KNO3等容易被微生物吸收利用分子氮N2固氮微生物可利用，但当环境中有化合态氮源时，固氮微生物就失去固氮能力其他嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物大肠杆菌不能以嘧啶作为唯一氮源，在氮限量的葡萄糖培养基上生长时，可通过诱导作用先合成分解嘧啶的酶，然后再分解并利用嘧啶可不同程度地被微生物作为氮源加以利用2.能源(energysource) 能源：能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能有机物化能异养微生物的能源化学物质能源谱无机物化能自养微生物的能源辐射能光能自养和光能异养微生物的能源单功能营养物、双功能营养物、多功能营养物1.生长因子(growthfactor)生长因子：那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物微生物生长因子需要量（ml-1III型肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）胆碱6ug金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）硫胺素0.5ng白喉棒杆菌（Cornebacteriumdiphtherriae）B-丙氨酸1.5ug破伤风梭状芽孢杆菌（Clostridiumtetani）尿嘧啶0-4ug肠膜状串珠菌（Leuconostocmesenteroides）吡哆醛0.025ug根据生长因子的化学结构和它们在机体中的生理功能的不同，可将生长因子分为维生素(vitamin)、氨基酸与嘌呤与嘧啶三大类。维生素在机体中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢；有些微生物自身缺乏合成某些氨基酸的能力，因此必须在培养基中补充这些氨基酸或含有这些氨基酸的小肽类物质，微生物才能正常生长；嘌呤与嘧啶作为生长因子在微生物机体内的作用主要是作为酶的辅酶或辅基，以及用来合成核苷、核苷酸和核酸。表维生素及其在代谢中的作用化合物代谢中的作用对氨基苯甲酸四氢叶酸的前体，一碳单位转移的辅酶生物素催化羧化反应的酶的辅酶辅酶M甲烷形成中的辅酶叶酸四氢叶酸包括在一碳单位转移辅酶中泛酸辅酶A的前体硫辛酸丙酮酸脱氢酶复合物的辅基尼克酸NAD、NADP的前体，它们是许多脱氢酶的辅酶吡哆素(B6)参与氨基酸和酮酶的转化核黄素(B2)黄素单磷酸(FMN)和FAD的前体，它们是黄素蛋白的辅基钴胺素(B12)辅酶B12包括在重排反应里(为谷氨酸变位酶)硫胺素(B1)硫胺素焦磷酸脱羧酶、转醛醇酶和转酮醇酶的辅基维生素K甲基酮类的前体，起电子载体作用(如延胡索酸还原酶)氧肟酸促进铁的溶解性和向细胞中的转移生长因子自养型微生物； 生长因子异养型微生物；生长因子过量合成型微生物；1.无机盐(inorganicsalt)参与微生物中氨基酸和酶的组成；作用调节微生物的原生质胶体状态，维持细胞的渗透与平衡酶的激活剂。根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P等。通常需要量在10-3--10-4mol/L：微量元素是指那些在微生物生长过程中起重要作用，而机体对这些元素的需要量极其微小的元素，通常需要量在10-6--10-8mol/L：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。2.水（water）生理功能主要有①起到溶剂与运输介质的作用；②参与细胞内一系列化学反应；③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；④热的良好导体；⑤通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构第二节　微生物的营养类型生长所需要的营养物质自养型生物异养型生物生物生长过程中能量的来源光能营养型化能营养型根据碳源、能源及电子供体性质的不同，可将微生物分为： 光能无机自养型(photolithoautotrphy)光能有机异养型(photoorganoheterotrphy)化能无机自养型(chemolithoautotrphy)化能有机自养型(chemoorganoheterotrophy)1．光能无机自养型（光能自养型）能以CO2为主要唯一或主要碳源；进行光合作用获取生长所需要的能量；以无机物如H2、H2S、S等作为供氢体或电子供体，使CO2还原为细胞物质；例如，藻类及蓝细菌等和植物一样，以水为电子供体（供氢体），进行产氧型的光合作用，合成细胞物质。而红硫细菌，以H2S为电子供体，产生细胞物质，并伴随硫元素的产生。光能CO2+2H2S光和色素[CH2O]+2S+H2O2．光能有机异养型（光能异养型）不能以CO2为主要或唯一的碳源；以有机物作为供氢体，利用光能将CO2还原为细胞物质；在生长时大多数需要外源的生长因子；例如，红螺菌属中的一些细菌能利用异丙醇作为供氢体，将CO2还原成细胞物质，同时积累丙酮。H3C光能2CHOH+CO22CH3C0CH3+[CH2O]+H2OH3C光和色素3．化能无机自养型（化能自养型）生长所需要的能量来自无机物氧化过程中放出的化学能；以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源进行生长时，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作为电子供体使CO2还原成细胞物质。化能无机自养型只存在于微生物中，可在完全无机及无光的环境中生长。它们广泛分布于土壤及水环境中,参与地球物质循环；4．化能有机异养型（化能异养型）生长所需要的能量均来自有机物氧化过程中放出的化学能；生长所需要的碳源主要是一些有机化合物，如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等。有机物通常既是碳源也是能源；大多数细菌、真菌、原生动物都是化能有机异养型微生物；所有致病微生物均为化能有机异养型微生物；不同营养类型之间的界限并非绝对异养型微生物并非绝对不能利用CO2；自养型微生物也并非不能利用有机物进行生长；有些微生物在不同生长条件下生长时,其营养类型也会发生改变；例如紫色非硫细菌(purplenonsulphurbacteria)：没有有机物时，同化CO2，为自养型微生物；有机物存在时，利用有机物进行生长，为异养型微生物；光照和厌氧条件下，利用光能生长，为光能营养型微生物；黑暗与好氧条件下，依靠有机物氧化产生的化学能生长，为化能营养型微生物 微生物营养类型的可变性无疑有利于提高其对环境条件变化的适应能力第三节　营养物质进入细胞的方式营养物质能否进入细胞取决于三个方面的因素：①营养物质本身的性质（相对分子量、质量、溶解性、电负性等②微生物所处的环境（温度、pH等）；③微生物细胞的透过屏障（原生质膜、细胞壁、荚膜等）。根据物质运输过程的特点，可将物质的运输方式分为自由扩散（SimpleDiffusion）促进扩散（FacilitatedDiffusion）主动运输（ActiveTransport）基团转移（GroupTranslocation）1．自由扩散原生质膜是一种半透性膜，营养物质通过原生质膜上的小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内进行扩散。特点①物质在扩散过程中没有发生任何反应；②不消耗能量；不能逆浓度运输；③运输速率与膜内外物质的浓度差成正比水是唯一可以通过扩散自由通过原生质膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、一些气体（O2、CO2）及某些氨基酸在一定程度上也可通过自由扩散进出细胞。 2．促进扩散特点：①不消耗能量②参与运输的物质本身的分子结构不发生变化③不能进行逆浓度运输④运输速率与膜内外物质的浓度差成正比⑤需要载体参与通过促进扩散进入细胞的营养物质主要有氨基酸、单糖、维生素及无机盐等。一般微生物通过专一的载体蛋白运输相应的物质，但也有微生物对同一物质的运输由一种以上的载体蛋白来完成。3．主动运输主动运输是广泛存在于微生物中的一种主要的物质运输方式。它的一个重要特点是物质运输过程中需要消耗能量和载体，而且可以进行逆浓度运输。4．基团移位基团移位是另一种类型的主动运输，它与主动运输方式的不同之处在于它有一个复杂的运输系统来完成物质的运输，而物质在运输过程中发生化学变化。基团转位又称为磷酸烯醇式丙酮酸--磷酸糖转移酶运输系统（PTS），PTS通常由五种蛋白质组成，包括酶I、酶II（包括a、b、c三种亚基）和一种低相对分子量的热稳定蛋白质（HPr）。 PEP-P+HPr→HPr-p+丙酮酸P-HPr+糖→糖-P+HPr基团转移主要存在于厌氧型和兼性厌氧型细胞中，主要用于糖的运输，脂肪酸、核苷、碱基等也可以通过这种方式运输。 四种运送营养方式的比较比较项目单纯扩散促进扩散主动运输基团移位特异载体蛋白无有有有运送速度慢快快快溶质运送方向由浓至稀由浓至稀由稀至浓由稀至浓平衡时内外浓度内外相等内外相等内部高内部高运送分子无特异性特异性特异性特异性能量消耗不需要不需要需要需要运送前后溶质分子不变不变不变改变载体饱和效应无有有有与溶质类似物无竞争性有竞争性有竞争性有竞争性运送抑制剂无有有有运送对象举例水、O2糖、SO42-氨基酸、乳糖葡萄糖嘌呤第四节　培养基(medium)培养基是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；常规高压蒸汽灭菌：1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟；即102969.83帕斯卡Pa = N/m20.56kg/cm2,112.6℃15-30分钟一、选用和设计培养基的原则和方法原则：目的明确、营养协调、条件适宜、经济节约1.目的明确根据不同微生物的营养要求配制针对性强的培养基培养化能自养型的氧化硫杆菌的培养基组成为：S10gMgSO4.7H2O0.5g（NH4)2SO40.4gFeSO40.01gH2PO44gCaCl20.25gH2O1000ml培养化能异养的大肠杆菌一种培养基是由下列化学成分组成：葡萄糖5gNH4H2PO41gNaCl5gMgSO4.7H2O0.2gK2HPO41gH2O1000ml常见的培养四大类微生物的培养基细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5gH2O1000ml放线菌（高氏1号）淀粉20gK2HPO40.5gNaCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gKNO31gFeSO40.01gH2O1000ml酵母菌(麦芽汁培养基) 干麦芽粉加四倍水，在50℃--60℃保温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止，调整糖液浓度为10。巴林，煮沸后，沙布过滤，调PH为6.0。霉菌（查氏合成培养基）NaNO33gK2HPO41gKCl0.5gMgSO4.7H2O0.5gFeSO40.01g蔗糖30gH2O1000ml1.营养协调培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用。培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C/N）的影响较大。碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/1时，菌体量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。2.理化条件适宜pH、渗透压和水活度、氧化还原电位a.pH培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。b.渗透压和水活度渗透压（osmoticpressure）是一个用来度量溶液中物质浓度产生的使水分子流动而达到平衡时，溶质产生的机械压力。将溶液和水置于U型管中，在U型管中间安置一个半透膜，以隔开水和溶液，可以见到水通过半透膜往溶液一端跑，假设在溶液端施加压强，而此压强可刚好阻止水的渗透，则称此压强为渗透压不同渗透压会导致微生物脱水和膨胀在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量，一般用在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸汽压力与同样条件下纯水蒸汽压力之比表示，即：αw=Pw/Pow式中Pw代表溶液蒸汽压力,POw代表纯水蒸汽压力。纯水αw为1.00,溶液中溶质越多,αw越小。微生物一般在αw为0.60～0.99的条件下生长,αw过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。微生物不同，其生长的最适αw不同。c.氧化还原电位氧化还原电位又称氧化还原电势（redoxpotential），是度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同 好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜；厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸,+0.1伏以下时进行发酵。4.经济节约以粗代精、以野代家、以废代好、以简代繁、以氮代朊、以纤代糖、以烃代粮、以国代进方法：生态模拟、借鉴文献、精心设计、试验比较二、培养基的类型及应用培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养基分成多种类型。含用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物按成分不同划分天然培养基牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基合成培养基化学成分完全了解的物质配制而成的培养基半合成培养基高氏1号培养基、查氏培养基在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏按物理状态不同划分固体培养基琼脂含量一般为0.2%-0.7%半固体培养基观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定液体培养基不加任何凝固剂脱水培养基大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究 理想的凝固剂应具备以下条件：①不被所培养的微生物分解利用；②在微生物生长的温度范围内保持固体状态;③凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利于微生物的生长；④凝固剂对所培养的微生物无毒害作用；⑤凝固剂在灭菌过程中不会被破坏；⑥透明度好，粘着力强；⑦配制方便且价格低廉。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基基础培养基特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等按用途不同划分加富培养基选择培养基鉴别培养基微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化用于鉴别不同类型微生物的培养基在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长