《微生物培菌工》技能训练指导书

武汉生物工程学院发酵工程教研室《微生物培菌工》技能训练指导书武汉生物工程学院发酵工程教研室编制二○一一年五月25 武汉生物工程学院发酵工程教研室目录一、微生物实验室主要设备与样品采集2（一）实验室主要仪器设备2（二）微生物学检验的样品采集2二、微生物的镜检技术3（一）普通光学显微镜的使用和保养3(二)测微与计数5（三）微生物的镜检技术6三、培养基的制备和消毒灭菌技术7（一）培养基的制备7（二）消毒、灭菌技术9四、微生物的分离纯化与培养技术10（一）无菌操作基本环节10（二）微生物的分离纯化10（三）微生物的接种技术12（四）微生物的培养技术13五、发酵食品微生物学分析技术13（一）发酵食品微生物学分析方法13（二）微生物的鉴定15六、细菌鉴定中的某些特殊生理生化试验16(一)糖类发酵试验16(二)M·R试验（甲基红试验）16(三)V·P试验（乙酰甲基甲醇试验）16(四)硝酸盐还原试验16(五)吲哚试验17(六)H2S产生试验17(七)明胶液化试验17(八)淀粉水解试验17(九)油脂水解试验17(十)石蕊牛乳试验17（十一）柠檬酸盐利用试验18七、细菌学检验20（一）细菌总数的测定方法20（二）大肠菌群的测定21八、真菌学检验23（一）霉菌总数的测定23（二）酵母菌总数的测定23九、菌种保藏24（一）传代保藏24（二）矿物油浸没保藏2425 武汉生物工程学院发酵工程教研室微生物培菌工技能训练指导书一、微生物实验室主要设备与样品采集（一）实验室主要仪器设备1、光学显微镜及镜检仪器：光学显微镜、接目测微尺、接物测微尺、血球计数器、测微网、显微镜灯、日光灯等照明设备。2、消毒、灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅、铝锅、干燥箱、电炉、酒精灯、喷雾器、紫外光灯等。3、微生物培养设备；恒温培养箱、液体培养振荡器、培养皿、三角瓶、试管等。4、微生物分析设备和仪器：无菌室、无菌操作箱、超净工作台、振荡器、混合器、组织捣碎器、高速离心机、天平、接种针、接种环、镊子、剪刀、仪器盘、平皿、吸管、载玻片、盖玻片、广口瓶、试管架、特种蜡笔、记号笔、纱布、铁丝筐等。5、菌种保藏设备：冰箱。6、霉菌毒素一般测试仪器：层析缸、电动吹风机等。7、专项仪器：恒温水浴锅、注射器、涂布棒、放大镜、自动温度计、自动湿度计等。8、采样工具：铲子、匙、采样器、塑料袋等。9、通风设备：通风橱、无菌室通风设备等。（二）微生物学检验的样品采集1、样品采集的目的样品的采集简称采样。采样是从生产和经营的产品中，按照采样规定采集检验样品的过程。通过对检样的微生物学检验，可以准确评价产品状况，并为保证产品质量改进管理提供依据。2、样品采集的要求采集样品的基本要求是：第一，样品必须具有代表性。第二，样品要妥善存放，严防污染。第三，样品必须及时送检和检验。采样前，应事先准备好经过灭菌的容器和采样工具。在无菌条件下，按国家有关样品采集标准均匀而准确地取样，使样品具有正确性和代表性。存放样品，应用灭菌后的纸袋或玻璃器皿为好，通常不宜直接使用塑料袋存放。采集后的样品，必须及时封口，做好记录，贴上标签，每件样品必须标记清楚（如样品名称，采样地点，时间，储藏情况，数量，食用或中毒情况。采集或送检单位及姓名，采样现场的温度、湿度及卫生状况等）。尽量保持样品的原始状态，是保证检验结果准确性的基本条件。微生物学检验还必须具有及时性。样品送到微生物检验室应越快越好，有一般不超过３小时，如果路途遥远，可将样品保持在0―5℃环境中。3、样品采集的方法25 武汉生物工程学院发酵工程教研室(1)采样用具宜选用耐消毒灭菌的材料。使用前，应进行认真清洁干燥和相应的灭菌处理。湿热灭菌121℃至少20分钟，干热灭菌170℃至少1小时。不能用消毒剂消毒，样品中也不得加入防腐剂，以免影响检验结果的准确性。采样时应严格遵守无菌操作。(2)采样方法与步骤在无菌操作条件下，按有关国家规定标准采集样品：样品是固体粉末，应边取边混合；是液体，则通过振荡可混匀；检样是冷冻食品，应保持在冷冻状态（可放在冰内，冰箱的冰盒内或低温冰箱内保存）；非冷冻食品须在0―5℃环境中保存。采样数量按国家有关规定执行。二、微生物的镜检技术（一）普通光学显微镜的使用和保养1、普通光学显微镜的构造和性能光学显微镜主要由光学系统和机械系统两部分组成。光学系统是应用光学原理经过透镜使被检物体的物象放大。机械系统具有支架作用，并有调节装置。(1)光学系统显微镜的光学系统主要有物镜和目镜组成。此外，还有反光镜、聚光镜等。1)物镜物镜是由多组透镜组成，分为干燥系和油浸系两组镜头。干燥系镜头是指镜检时物镜和镜检物之间的介质空气的物镜，通常可分为两种：一是低倍镜，二是高倍镜。油浸系镜头是指镜检时物镜和镜检物之间的介质是折光率玻片和镜头相似的油类（如香柏油），镜头浸入油中而进行调焦镜检的镜头，这样可避免光线通过空气时发生散射现象，从而保证视野亮度，提高镜头分辨率。2)目镜目镜装在镜筒上方，它是由两块透镜组成，它可将物镜所造成的实像进一步放大形成虚像，并映入眼部。目镜不增加分辨率。显微镜的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，但从提高分辨率的实际效果来看，还是选用放大倍数较高的物镜为好。3)聚光镜聚光镜一般由两个或几个透镜组成，它可以使光线从正面和斜面照射到标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，以提高物镜的分辨率。4)反光镜它是普通光学显微镜的取光设备，装置在镜座上。它是个双面镜子，一面是平面镜，另一面是凹面镜，镜体可在弧弓上自由翻转以调整位置，使光线射向聚光镜。5)光源自然光线和灯光均可作为光源，以灯光较好，因为光色和强弱都可以得到控制。(2)机械系统显微镜的机械系统主要由镜座、镜臂、镜筒、调节器、转换器、载物台和标本推动器等部件组成。1)镜座镜座是显微镜的基座，在镜体的底部，用以支持整个镜体。2)镜臂镜臂是显微镜的脊梁，机械装置一般都直接或间接地与其相接，用以支撑与连接镜筒和镜座。25 武汉生物工程学院发酵工程教研室3)镜筒镜筒上端安装目镜，下端连接转换器。4)转换器转换器是由两个金属碟组成，上面一个固定在镜筒上，下面一个可转动，在其上安装物镜，转换器可按需要来转动以更换物镜。5)调节器调节器是升降镜筒或镜台，调节物镜和标本间距离调焦的机件，分为粗调节器和细调节器。6)载物台载物台又称镜台，用于放置镜检物，台上装有标本推动器。7)标本推动器标本推动器又称十字动台，安装在载物台上，标本推动器一方面用来固定标本，另一方面通过旋转推动器上的螺旋，可使标本前后左右移动，便于检查标本的不同部位。2、光学显微镜的使用(1)取镜显微镜是贵重的精密仪器，取镜时一手握镜臂，一手托镜座轻拿轻放，切忌碰撞和猛震，以免光学系统光轴偏斜，影响使用。(2)采光与调焦对光时，要将低倍镜与镜筒成一直线，用左眼看目镜内，同时调节反光镜寻找光源，调节到全视野有均匀的明亮度，照明效果到最佳时为止。可通过开大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜等来调节光线。使用显微镜必须调焦。先粗调至镜检物呈模糊状，在细调至镜检物清晰为止。(3)镜检镜检时，将玻片标本放在载物台上，对准通光孔，并用标本推动器或标本夹将其固定，然后按照先用低倍镜后用高倍镜在油镜的原则，依次观察。1)低倍镜观察任何标本都先经过低倍镜观察。首先移动推动器，使标本处于低倍镜的正下方，旋动粗调节器，物镜降到距标本5mm处，用左眼由目镜向下看，慢慢使镜筒上升，直至发现视野中有被观察的物象后，再使用细调向下或向上移动，直到能清楚地看到标本为止，将要观察的标本目标移至视野中央，以备换高倍镜或油镜镜检。2)高倍镜观察显微镜的成套物镜，一般设计为共焦点，低倍镜对准焦点后，移动转换器，改换高倍镜后基本上也对准焦点，只要稍微转动细调即可。3)油镜观察高倍镜下找到所要观察的目标后，移动转换器，在标本的欲检部位加一滴香柏油，改换成油镜，只要稍微转动细调即可。4)记录使用显微镜时，用左眼观察目标，右眼看记录本，以便边观察边记录。5)收镜与存放镜检结束后，把标本取下，擦净显微镜各部，将镜头转成“八”字行，再将镜筒向下调节以免物镜与聚光镜相碰受损，然后将显微镜放入镜箱内，妥为保存。3、普通光学显微镜的保养(1)显微镜应避免直接在阳光下暴晒。(2)显微镜及镜头严禁随意拆卸。25 武汉生物工程学院发酵工程教研室(3)显微镜应保持干净，尤其是目镜和物镜必须保持高度清洁，如有不洁，机械部分用软布擦净，光学系统用擦镜纸擦拭。(4)油镜使用后，用擦镜纸沾二甲苯擦拭，再用擦镜纸把镜头擦净。(5)微镜调焦时，如为镜筒升降者，只准升，不能降；如为镜台升降者，只准降，不能升。(6)显微镜使用时或装箱存放后，均需注意防潮、防霉、防晒、防震。(二)测微与计数1、测微测微就是测量微生物的大小，其大小用测微尺来测定，测量微生物个体大小是微生物分类鉴定中一项重要工作。测微尺包括两种：接物测微尺和接目测微尺。(1)测微尺的构造1)接目测微尺简称目尺，是一圆形玻片，玻片中央有一刻度尺，使用时装入目镜内的光阑处。2)接物测微尺简称物尺，是放在载物台上的一块玻片。在它的中央有一条长1mm被分成100个小格的等分线，每一小格长0.01mm即10um。(2)测微尺的使用1)目尺显微长度的标定因目尺是安装在目镜中，所测得的物象均已被物镜放大，因此在使用放大倍数不同的物镜时，目尺的显微长度（即目尺每小格代表经过显微放大的实际长度）是不一致的。所以在不同放大倍数的镜头系统下，必须分别用物尺来标定目尺每格的显微长度。目尺显微长度标定的具体方法如下：先将目尺装入目镜内，刻度向下，并将物尺放在载物台上，使刻度朝上。按镜检的方法，在镜下找到物尺的刻度，再转动目镜，使两尺刻度平行，并使两尺第一条刻度线重合，向右寻找第二条相重合的刻度线。记录两个重叠刻度线间目尺和物尺的格数，根据下列公式计算目尺的显微长度。目尺显微长度=（两个重叠刻度线间物尺的格数/两个重叠刻度线间目尺的格数）×10（微米）2)微生物菌体大小测量在目尺的显微长度确定以后，便可取下物尺，放上欲测定其大小的微生物玻片标本，进行测微。首先，在视野中选取一个单独的菌体，以横和纵的方向来测量，视其相当目尺刻度多少格，再乘以目尺显微长度，即可算出菌体的大小。2、微生物的显微计数显微计数是在显微镜下直接计算菌液中微生物数量的方法。显微计数法有三种，即计数器测定法、视野计数法和目镜计数网测定法。这里主要介绍计数器测定法。计数器测定法是利用血球计数板测定单位容积（或重量）内微生物数量的一种方法，适用于细菌、真菌孢子、酵母菌细胞及病原菌的直接显微计数。(1)血球计数板的构造（以25×16规格计数板为例）血球计数板的构造是一块厚的载玻片中央两边各有一个计数室，计数室的长宽各是1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3。0.1mm3的计数室又均分为25个中格，每个中格又分成16个小格，因此有计数室0.1mm3=25中格=400小格。(2)血球计数板的使用与计算25 武汉生物工程学院发酵工程教研室操作时，先将血球计数板、吸管、盖玻片充分洗净，并使其干燥，再用盖玻片盖在计数室上，然后用吸管吸取稀释菌悬液放在盖玻片的边缘上，待菌液自行渗入计数室内，然后在高倍镜下观察计数，计数左上、左下、右上、右下及中央五个中格内细胞数，每个样品重复计数三次，取其平均值。计算公式是：样品菌量（个/ml）=（五个中格内细胞数之和/80）×400×104×稀释倍数（三）微生物的镜检技术1、细菌的镜检细菌镜检的项目为：细菌的形态、大小。革兰氏染色反应，有无芽孢、荚膜、鞭毛及细胞运动情况等。在细菌形态观察中，必须借助于染色的方法，使菌体着色，增加与背景的明暗对比，才能在光学显微镜下较为清楚地观察其个体形态和部分结构。细菌染色法分为：单染色法和复染色法。(1)单染色法单染色法是用一种染料染色，适用于菌体一般形态观察。操作过程如下：涂片→干燥→固定→染色（1～2分钟）→水洗→吸干→晾干→镜检(2)复染色法复染色法是用两种或多种染料进行染色，最常用的是革兰氏染色法。所有细菌经革兰氏染色后可以分为两类：一类是革兰氏阳性菌，呈紫色；一类是革兰氏阴性菌，呈红色。革兰氏染色法的操作过程如下：涂片→干燥→固定→结晶紫初染1分钟→水洗→路氏碘液媒染1分钟→水洗、吸干→95%乙醇脱色→水洗、吸干→番红复染30秒钟→水洗、吸干→晾干→镜检在进行革兰氏染色过程中，以涂片和酒精脱色这两步骤最为关键。2、酵母菌的镜检酵母菌镜检的主要项目有：营养细胞的形状大小和出芽繁殖的特征，有性繁殖和假菌丝的有无等特征。(1)制片方法观察酵母菌的基本形态，可用水浸法制片，于显微镜下观察。方法如下：在洁净的载玻片上加一滴生理盐水，用接种环以无菌操作方法从培养48小时的固体斜面上取少量酵母菌与水混匀至浑浊即可；亦可直接从液体培养基中沾取一环菌液于载玻片上，加盖盖玻片，在显微镜下即能清楚地看到酵母菌的形态及其出芽繁殖的特征。(2)染色方法美蓝染色法：取美蓝染色液滴加在洁净载玻片中央，用接种环取少量酵母菌于美蓝液中，加盖盖玻片镜检，在显微镜下可见到死细胞被染成蓝色，活细胞则无色透明。因为活细胞新陈代谢旺盛，细胞内还原能力强，能将进入细胞的美蓝还原成无色，而死细胞失去代谢活力，被染成蓝色。3、霉菌的镜检25 武汉生物工程学院发酵工程教研室在镜检，首先观察霉菌培养基上的培养性状（菌落形状、大小、颜色、质地等），然后再进行镜检。霉菌镜检项目为：营养体的类型、营养菌丝是否分化、无性繁殖和有性繁殖的类型、形态、颜色、大小及其着生方式。在霉菌形态研究中，主要采用制片镜检和活物镜检两种方法。(1)培养物的直接观察用尖头镊子或接种针挑取有绒毛状的培养物一小块，将其小心地放在洁净的载玻片上，用低倍镜观察，一般可以观察霉菌的菌丝孢子囊或分生孢子头及其着生情况。(2)制片镜检霉菌制片方法是在洁净的载玻片滴加一滴乳酚油，用经过火焰灭菌的镊子挑取培养物上的霉菌（注意从靠近基质处取取）少许，放入乳酚油中，然后轻轻压上盖玻片，即可放在显微镜下观察。(3)霉菌的活物镜检为了研究霉菌的生长情况，活物镜检是将在固体培养基上生长菌落直接用低倍镜镜检。用这种方法观察，能看到菌体实际生长的全貌，可以直接鉴别许多霉菌，还有利一些霉菌生长特征（菌丝分枝、孢子及孢子梗着生状态等）。活物镜检的方法有载玻片培养镜检、平板培养镜检、斜面培养镜检三种。观察活物时，必须要注意以下三点：一是要避免镜头接触霉菌，以防镜头生霉；二是看完后要及时加盖和清理，避免标本污染；三是镜检人员必须加强防护，严防污染环境和影响人体健康。三、培养基的制备和消毒灭菌技术（一）培养基的制备1、制备培养基的准备工作(1)仪器用具的准备烧杯、玻棒、台称、吸管、玻璃漏斗、试管、三角瓶、电炉、高压蒸汽灭菌锅、培养皿、铝锅、恒温箱、干燥箱、无菌室等都是制作培养基不可缺少的仪器用具，事先必须准备齐全。(2)玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洁度，直接影响到实验结果是否准确。因此，要求所用的玻璃器皿必须洗涤后才能使用。洗涤的方法及所用洗涤剂因目的不同而异。一般新玻璃器皿可用2%盐酸浸泡1～2小时，再用水冲洗干净；一般玻璃器皿（如试管、三角瓶、培养皿等）先用毛刷及洗衣粉去污垢、无机盐等物质，然后再用水冲洗干净；少数实验室要求清洁度较高的器皿，可先放在洗液中浸泡数十分钟，在用自来水冲洗，最后用蒸馏水洗2～3次，以水在器壁上均匀分布成一薄层而不出现水珠时，为油垢除尽的标志；玻璃器皿用过之后，在未干之前应立即洗涤；带菌的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌后再洗涤。培养皿经洗刷晾干后，配成套，5～10套为一包，用旧报纸包扎，干热灭菌后备用。2、培养基制备的过程配料→溶解→校正PH值→加琼脂融化→过滤→分装→加棉塞，包扎→灭菌(1)用具的选择25 武汉生物工程学院发酵工程教研室制备培养基首先要选择合适的用具，不能用铜铁器皿，以免铜锈、铁锈混进培养基中。一般可用搪瓷缸或铝锅等。(2)配料溶解容器中先盛所需量的水（按需要可为蒸馏水或自来水），然后按照培养基的配方，准确称取各种原料，依次加入，使之溶解。一些不易称量的成分，如牛肉膏比较粘稠，可先称好一根玻棒和烧杯，再用玻棒取牛肉膏放在烧杯中一起称。有些需要量甚微的药品，可先配成定量比的稀释液，再从中定量取出需要的量。(3)调节pH值除培养基配方为自然pH值，配制时不用调节pH值外，其它皆需按要求调节pH值。调节pH值必须待加入水中的物质全部溶解并冷却至室温时才可进行。调节前先用精密pH试纸测定所配得溶液的pH值，然后根据配方所要求的pH值确定加碱还是加酸来调节pH值。所用酸一般为1mol/LHCl溶液，碱为1mol/LNaOH溶液。调节时要小心，逐滴加碱或酸，且要边加边搅，防止局部过酸或过碱而破坏培养基的营养价值，尽量不要调过头。(4)固体培养基制备如需配成固体培养基，应将适量琼脂投入所配的溶液中，加热使其全部融化。琼脂完全融化后，要加热水补足所蒸发的水分。(5)过滤可用二层纱布中间加脱脂棉趁热过滤，如气温低容易凝固可用保温漏斗。(6)分装趁热用玻璃漏斗或保温漏斗将培养基按需要分装于试管或三角瓶内。管口或瓶口不能粘附培养基，以免引起污染。装入试管的培养基的量一般为试管高度的1/5～1/4，装入三角瓶内的培养基的量一般为瓶容量的1/3。(7)加棉塞，包扎，灭菌为了避免试管和三角瓶中的培养基被污染，又能使培养的微生物获得必要的氧气，因此管口和瓶口要用棉花塞加封。棉花塞的大小要合适，既能塞牢，又能拔出。棉花塞塞好后，外包一层油纸（以防止灭菌时冷凝水湿润棉花塞），用棉绳扎牢，即可进行灭菌。灭菌后，斜面培养基趁热摆成斜面。冷凝后无菌存放，备用。(8)无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，或放入28℃的温室中培养5～7天，以检查灭菌是否彻底。3、常用培养基配方1)牛肉膏蛋白胨培养基(MPA)牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.4～7.6。2)马铃薯葡萄糖培养基(PDA)25 武汉生物工程学院发酵工程教研室马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH4.0～6.0。3)麦芽汁培养基(MDA)麦芽汁(10°Bx)1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g。4)察氏培养基NaNO33g，KCl0.5g，K2HPO41g，FeSO40.01g，MgSO45g，蔗糖30g，蒸馏水1000mL，pH6.7。5)豆芽汁培养基(BSA)黄豆芽100g，蔗糖50g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH4.0～6.0。（二）消毒、灭菌技术1、加热灭菌(1)干热灭菌法1)火焰灭菌法直接利用火焰把微生物灼烧死。此法灭菌可靠，简便迅速，适用于接种环、接种针、玻璃棒、镊子、解剖刀等用具的灭菌。在接种过程中，试管口、三角瓶口也都用火焰作短暂灼烧而达到灭菌的目的。2)干热空气灭菌法在干燥箱内，通过加热使箱内空气温度上升，而达到灭菌的目的。具体操作方法是：首先将包扎好的器皿放入干燥箱内，使其勿与箱壁接触，并保持箱内空气流通；然后接通电源加热，使温度升至160～170℃，恒温维持2～3小时；再切断电源停止加热，当箱内温度降至60℃以下时，方可打开箱门，取出被灭菌的物品。此法只适用于玻璃仪器及金属用具。(2)湿热灭菌法湿热灭菌法是用煮沸或饱和水蒸气等湿热进行灭菌，此法适用于一切含水物品。实验室常用高压蒸汽灭菌法灭菌。高压蒸汽灭菌锅的使用方法：首先，在灭菌锅内加入适量的水，然后把欲灭菌的物品放入，盖上内盖，再对称拧紧外盖上的螺栓；打开锅盖上的放气阀，开始加热；锅内产生蒸汽后，放气阀即有蒸汽排出，约3～5分钟后，待冷湿空气排尽，再关闭放气阀；待压力升到0.1MPa（121℃）时，维持此压20～30分钟；停止加热，自然冷却，待压力降为零后，打开放气阀，排出残留蒸汽；打开锅盖，取出灭菌的物品，无菌放好。2、过滤除菌不适于加热灭菌的物质，可以采用过滤法除菌。过滤除菌就是利用特别的细菌过滤器，以及活性炭、超细纤维等，将液体或空气中的细菌滤掉。一般以细菌过滤器为常用。3、化学药剂消毒与灭菌化学药剂消毒是利用化学药剂来杀死微生物。实验室和生产中常用的消毒剂有：5%苯酚溶液常用于实验室、无菌室和无菌操作箱中的空间消毒；10%的福尔马林溶液常用于容器消毒；70～75%酒精是最常用的消毒剂，可用于一般器皿、器械、皮肤、玻片等表面消毒；0.1%次氯酸钠溶液可用于粮粒表面消毒，5%次氯酸钠溶液可用于霉菌毒素的去毒；3～5%的来苏儿常用于桌面地面及皮肤的消毒。25 武汉生物工程学院发酵工程教研室4、紫外线灭菌法紫外线灭菌法主要应用于无菌室和无菌操作箱的空气灭菌。通常在10～15㎡空间容积内，采用30瓦紫外光灯照射5～15分钟即可。为了加强灭菌效果，在开灯之前，可以在无菌室内喷5%苯酚溶液或2～3%的来苏儿溶液，使空气中微生物随雾滴和尘埃降落，以便有效地杀死微生物。紫外线对人体有伤害，应注意防护。四、微生物的分离纯化与培养技术（一）无菌操作基本环节1、分离、接种前的准备工作(1)应经常用消毒液擦洗无菌室的桌面及墙壁，用乳酸或甲醛熏蒸无菌室。(2)无菌室在使用前，应先打开紫外光灯灭菌30分钟。(3)经常对无菌室作无菌程度检查。(4)进入无菌室前，应先做好个人卫生工作，换工作服、工作鞋，戴口罩。工作服、工作鞋、口罩只准在无菌室内使用，不准穿着到其它地方，并定期洗换和消毒灭菌。(5)接种的试管、三角瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称和日期。移入无菌室内的所有物品，均须在缓冲室内用75%酒精擦拭干净。2、接种时操作要点(1)用75%酒精擦双手(2)操作过程不离开酒精灯火焰。(3)棉塞拿在手上，不要乱放。(4)接种工具使用前需经火焰灼烧灭菌。(5)操作要正确、迅速。(6)接种工具用后需经火焰灼烧灭菌，才能放在桌上。(7)棉塞必须塞得松紧适宜。(8)所有使用的器皿均须严格灭菌。(9)接种用的培养基均需事先作无菌培养试验。（二）微生物的分离纯化常用的微生物分离纯化的方法是稀释分离法和平板划线法。1、稀释分离法稀释分离法主要步骤是：(1)取样方法见一（二）样品采集的内容。(2)制备菌悬液称取一定量样品1～25g（或mL25 武汉生物工程学院发酵工程教研室），在酒精灯火焰旁放入装有9倍或99倍于样品重量（或体积）的无菌水的试管或三角瓶中，经充分振动只能感洗涤或组织捣碎后即制成稀释度为10－1或10－2的菌悬液。(3)稀释按1：10的倍比稀释法把菌悬液依次稀释成10－2、10－3、10－4……菌悬液。注意：以上操作应在无菌条件下进行，每一浓度更换一支灭菌移液管，以减少稀释中的误差。(4)接种事先准备好直径为9～11㎝的灭菌培养皿12只，分成三组。通常在食品细菌分析时，分别选用三个连续稀释度10－3、10－4、10－5，每个稀释度为一组，定为四个培养皿，即四个重复，计数时取四皿平均值，使测定结果更为准确。如如果分离霉菌或酵母菌，一般采用10－2、10－3、10－4三个稀释度。必须说明，各种发酵食品的样品分析，其菌悬液的稀释度，应根据样品的实际情况，灵活选用。稀释度确定后，用灭菌的1ml移液管，依次从低稀释度到高稀释度，分别吸取1ml菌悬液，注入已经编号的相应稀释度的平皿中进行接种。(5)制作平板将已热融并已冷至45～50℃左右的培养基以无菌操作方法倒入上述已接种的培养皿中，每皿15ml左右，立即轻轻地摇动培养皿，使培养基与菌悬液充分混合，然后静置，待培养基凝固后，将培养皿翻转，置于恒温箱中定温培养。(6)培养根据分离微生物类群不同，培养温度、培养时间及分离用培养基均有所不同。如细菌，一般用MPA，于37℃恒温箱中培养1～2天；霉菌用PDA或CA，于28℃培养5～7天；酵母菌用MDA或PDA，于28℃培养2～4天。(7)结果观察通过培养既可见培养皿内长出各种菌落，可分别进行观察。首先从外观上辨认出细菌、酵母菌、霉菌的菌落，选择所需要的稀疏的单个菌落，接至相应的斜面培养基上培养，待斜面上长成成片的菌落后，用无菌操作取出少量菌体（或菌丝体），制片，用显微镜检查是否已得到单一的纯种。如仍有其它菌混杂，就应再经稀释分离或平板划线分离进行纯化，直到获得纯培养。用此法可以及时分离到多种菌种。2、平板划线法这是分离纯化菌种的常用方法。操作过程如下：(1)制作平板将已热融并已冷至50℃左右的培养基以无菌操作方法倒入已灭菌培养皿中，每皿15ml左右，待其凝固稍干燥后可使用。(2)划线分离25 武汉生物工程学院发酵工程教研室以无菌操作方法用接种环沾取少量待分离的混杂菌，左手拿起已制好的培养皿平板（用大拇指和中指夹住皿盖的两边，无名指和小指托住皿底）拇指稍稍用力把皿盖打开一缝隙，右手把已沾上菌的接种环迅速通过缝隙伸入平板划线，然后取出接种环，合上皿盖，平板倒置放入恒温箱中培养。划线时要注意不要把培养基划破。通过平板划线得到单个菌体或孢子，经培养后长出单个分散的菌落。经显微镜检查确定为纯种，即可接入斜面培养基；如不纯，仍用上述方法反复纯化。（三）微生物的接种技术所谓接种就是将纯种微生物在无菌操作条件下，移植到适宜该菌生长繁殖的培养基上的过程。接种是微生物实验中一项最基本的操作，接种的关键是严格的无菌操作，严防杂菌污染，保证菌种的纯度和存活。1、固体斜面接种法固体斜面接种法是把原有菌种接入固体斜面培养基上的方法，接种应在无菌操作条件下进行，接种前需在待接试管上贴标签，注明菌名、接种日期、接入人姓名。标签一般贴在斜面向上的部位。接种方法如下：以左手拿原有菌种试管和待接斜面培养基试管，使斜面朝上便于观看；右手拿接种环在火焰上灭菌；再用右手小手指无名指拔取并夹住试管棉塞（棉塞决不可放在桌上），立即使管口在火焰上灭菌，然后把烧红的接种环伸入原有菌种试管内，凉透，再挑取少许菌体并迅速转移到待接试管中，用划线（酵母和细菌）或点接（霉菌）方法接于斜面上，注意不要把培养基划破，也不要把菌沾在管壁上；接完后，取出接种环，将其在火焰上灼烧灭菌后放在桌上；再把管口火焰灭菌，塞上棉塞并塞紧，放入培养箱中定温定时培养。此过程要求迅速准确完成。2、液体接种法液体接种法是将纯种接入液体培养基中的方法。在测定微生物生理特性及其代谢产物，以及进行扩大培养时，常采用此法进行培养。(1)由固体斜面接入液体培养基中其无菌操作过程与接入固体斜面培养基的步骤基本相同。此时所拿的是装有液体培养基的试管和三角瓶，管口要略向上倾斜，以免培养液流出。在酒精灯火焰旁拔出棉塞后，用接种环战区少许菌种，在液体表面与管壁交界处轻轻摩擦几下即可，然后培养。(2)以菌液接入固体培养基中用液体培养基中培养的菌种进行接种时，其操作过程与固体斜面接种法基本相同。接种的工具可以用接种环，也可用灭菌的吸管或移液管。根据需要也可用固体斜面菌种制成菌悬液，用菌悬液接入液体培养基中。制作菌悬液时，先在固体斜面上加入1至数mL无菌水，然后振摇，把斜面上的菌体或孢子洗下混匀即成菌悬液。3、固体平板接种法固体平板接种法是将菌种接到平板培养基上的方法。此法适于各种菌类的形态学研究和鉴定，便于测定和观察其生长速率、菌落特征和显微镜检查等。(1)点接法25 武汉生物工程学院发酵工程教研室方法是：将接种环在火焰上彻底灭菌，并在培养基上沾一下（一方面可使接种环冷却，另一方面使它湿润，便于粘着孢子和防止孢子散落），然后挑取菌体少许，并以左手稍稍开启皿盖，立即把所挑的菌体（孢子和菌丝）接种在平板上，每皿等距离点植1～3点。接种时，由于接种环的微动，常会散落一些孢子，误种在它所经过的培养基表面。为了防止这种现象，接种时可把培养皿翻转过来用接种环在它的下方接种。(2)菌悬液接种法菌悬液接种法常用于稀释分离和菌落计数。此法是：用无菌吸管吸取1ml菌悬液，滴入已经灭菌的空皿中，再把热融的固体培养基冷至45～50℃（手摸不烫时），倒入盛有菌悬液的培养皿中，使菌悬液与培养基充分混合成平板，进行倒置培养。(3)划线法划线法用于细菌和酵母菌的纯种分离。其方法与“平板划线法”分离纯化微生物的操作相同。注意：接种时必须在无菌条件下操作，操作要迅速、准确，避免污染，做好接种记录。（四）微生物的培养技术微生物的培养方法，按微生物呼吸类型的不同，可分为好氧培养法和厌氧培养法两种。1、好氧培养法(1)固体培养法为了尽量得到充足的氧气，可把好气性微生物培养在固体培养基的表面，如斜面和平板的表面。(2)液体培养法将微生物菌种接种到液体培养基中进行培养。培养的方法又分三种：1)静置培养：接种后培养的液体静止不动。为了通气良好，多采用浅层培养，以增加液体与空气的接触面积，有利于氧气在水中的溶解和扩散。2)振荡培养：接种后利用摇床进行振荡培养，使之通气良好，增加液体培养基中氧的溶解和扩散3)深层培养：是与浅层培养相对而言，它是一种大规模工业生产的液体培养方法。当好氧培养时，必须连续通入经过净化的无菌空气，以确保培养液中有足够的溶解氧。2、厌氧培养法在培养厌氧性微生物时，必须防止氧气侵入培养物，应把培养容器内氧气除去，充以其它气体，如CO2和N2等，以便造成缺（无）氧环境。五、发酵食品微生物学分析技术（一）发酵食品微生物学分析方法1、感官检验感官检验时，主要观察发酵食品表面有无霉斑、霉状物、粒状物、粉状物、毛状物；色泽是否变灰、变黄等色；有无霉味及其它异味；食品内部是否生霉变质，从而确定食品的霉变程度。2、镜检25 武汉生物工程学院发酵工程教研室(1)直接镜检直接对送检样品进行镜检，其方法按照〈微生物的镜检技术〉进行镜检。(2)显微计数用显微计数的方法，可以直接测定受检样品的带菌量。具体操作与计算按〈镜检计数〉中有关方法进行。3、培养检验微生物分析的基本方法是培养检验，又分为种植培养分析法和稀释培养分析法两种。(1)种植培养分析法种植培养分析法简称“种植培养”或点植法，是将食品点植于平板培养基上进行培养的方法，适用于粒状或块状试样的全菌和内部菌分析。在分析前，要选用适宜的培养基，并将其融化倒碟制成平板，然后分别进行食品的全菌或内部菌分离。因而依据检品目的不同又分为直接种植（全菌）与表面消毒种植两种培养方法。如果分析霉菌，融化后培养基降至45～50℃时加入链霉素4000IU/100ml，用来抑制细菌生长。(2)稀释培养分析法稀释培养分析法又称稀释培养。先将试样用无菌水洗涤，或混合，或捣碎，制成定量稀释的菌悬液，再用无菌水逐级稀释，然后定量进行平板培养，可以获得单独生长的菌落，便于菌量计数和菌种鉴定。(3)稀释培养分析法的计数规则1)微生物菌落计数的方法：菌落计数是发酵、食品等菌量分析的主要方法之一。在稀释培养中，平板上生成的菌落数，即代表试样带菌数。因此，每皿倾注1ml菌悬液所生成菌落数（C）除以该稀释菌悬液的稀释度（D），即可求得每g（或每mL）试样的带菌量（即总菌数T）：T=C/D（个/g或mL）2)菌落计数的时限：细菌应在定温培养1～2天内计数；真菌应定温培养5～7天计数。3)菌落计数的数量标准：每个稀释度应有2～4个平板的重复培养，计数时应选用同一稀释度各平板的平均菌落数。按经验值确定，用于计数的稀释度，其平板的平均菌落数，细菌应在30～300之间，真菌应在10～100之间。4)稀释培养的稀释度范围：稀释培养应至少试用三个连续的稀释度，其稀释度范围，一般试样的真菌可用10－1、10－2、10－3，细菌可用10－2、10－3、10－4，根据试样情况，其范围可酌情扩大或变更。5)稀释度的选定原则：选用一个平均菌落数在数量标准之内的稀释度；两平均菌落数在数量标准之内的稀释度，两者的比值小于2倍，则取平均值；大于2倍，则用值小者；若三个中平均菌落数在数量标准之内的稀释度，应选用两个低数值的平均值；试用稀释度的平均菌落数均小于或大于数量标准时，应重新试用更高或更低的稀释度进行菌落计数，或采用均小于数量标准的最小值，或采用均大于数量标准的最大值。6)菌落计数的数据处理：菌落计数通常采用二位有效数字报告，后续数字均可四舍五入。25 武汉生物工程学院发酵工程教研室7)菌落计数的菌量报告：内容包括，试样例次、稀释度、选定稀释度、菌量。（二）微生物的鉴定鉴定工作是根据菌类的形态观察和生理实验进行的。霉菌侧重于形态，细菌着重于生理。1、鉴定项目(1)霉菌鉴定的主要项目霉菌鉴定的根据，主要是形态特征、培养性状。作培养性状鉴定时，要选用适宜的培养基进行培养观察。如：曲霉和青霉应采用察氏培养基；根霉毛霉镰刀菌等应采用马铃薯葡萄糖培养基；如需特殊培养时，可采用特定的培养基。霉菌鉴定的主要项目如下：1)培养性状：霉菌在适宜的培养基上菌落的大小、形态及构造；菌落的表面特征和边缘特征；菌落的生长速度；菌落表面及培养基的颜色等。2)形态特征：营养体类型（菌丝有无隔膜、菌丝体形成的各种组织体）、颜色（黄、褐、灰、绿、紫、白等）、分化（菌丝有无形成假根或足细胞）；无性和有性繁殖体的种类、大小、构造、表面特征（光滑或粗糙）、着生状态（单生、链生或集生）。(2)细菌鉴定的主要项目细菌的形体小、结构简单，形态特征一般差异较小，因此细菌鉴定主要以生理特征为依据。如营养源的利用情况、代谢产物的类型等是鉴定细菌的主要依据。细菌鉴定的主要项目如下：1)糖类发酵作用：测定细菌对于糖类的发酵能力，主要是观察有无有机酸及气体的产生。一般用作定性实验。2)淀粉水解试验：主要检验细菌对淀粉的水解能力。3)明胶水解试验：了解细菌对明胶有无液化能力溶胶性，如果明胶迅速溶解，则表示其分解能力强。不同细菌的溶胶能力不同。4)蛋白质分解试验：测定细菌对蛋白质的氨化能力。如蛋白质被细菌分解则可产生氨和硫化氢等。5)对牛乳的作用：检查细菌能否凝固牛乳产酸和产碱情况，以及能否胨化酪蛋白，前者为酸凝固，后者为酪酶凝固。6)色素：检查色素形成与否。7)环境条件：温度、水分、氧气等影响细菌发育习性。2、鉴定的步骤微生物的鉴定虽有一定的步骤，但不是一个固定的程序。通常可按以下步骤进行。(1)纯化菌种纯化菌种是用分离培养和纯种移植法，在相应的培养基上培养出单纯菌株。(2)培养性状的观察按照微生物性状的鉴定项目进行观察和记录。(3)形态特征的显微镜检查25 武汉生物工程学院发酵工程教研室根据各类微生物形态特征常用的鉴定项目进行观察和记录。如霉菌通常采用制片观察或活物观察。(4)生理特征鉴定对细菌（或酵母菌）进行有关生理生化试验，根据试验结果，确定其生理特征以便进行鉴定。(5)查对资料根据观察、镜检和试验结果，查阅有关菌类的文献资料和种属特征的检索逐项查对。凡是特征与资料表述相同者，即可鉴定某一菌株的属、群或种的名称。六、细菌鉴定中的某些特殊生理生化试验(一)糖类发酵试验细菌发酵葡萄糖、乳糖醇、糖苷等后，能产生各种有机酸（乙酸、丙酸、乳酸等）及各种气体如H2、CO2等，当然不同种细菌所产生的有机酸与气体类型是不一样的。酸的产生可用指示剂来指示。在配制糖发酵培养基时，预先加入了溴甲酚紫（pH6.8以上时呈紫色，pH5.2以下时呈黄色）。当细菌发酵糖而产生酸时，会使培养液由原来的紫色变为黄色。气体的产生可用糖发酵管中倒立的杜汉氏小管充满气体而加以证明。凡产酸、产气用“○”表示，只产酸不产气用“＋”表示，不产气用“—”表示。(二)M·R试验（甲基红试验）某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示，有效pH范围为4.2～6.3，细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的橘黄色变为红色，此为M·R正反应，用“＋”表示。(三)V·P试验（乙酰甲基甲醇试验）某些细菌在糖代谢的过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧后，生成活性乙醛，后者再同丙酮酸或乙醛化合产生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物，此即为V·P正反应，用“＋”表示。当在试管中加入α－萘酚时，可以促进反应的出现。加入40%氢氧化钾和等量5%α－萘酚试剂12～20滴，振荡，37℃保温20～30分钟。(四)硝酸盐还原试验某些细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，氨和氮等。如果细菌能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，当培养基中加入亚硝酸试剂时，则溶液呈现粉红色或红色。此时即为硝酸盐还原试验阳性反应，为正反应，用“＋”表示。阴性反应的原因有两种可能：1)细菌不能还原硝酸盐，则培养后的培养液中仍有硝酸盐存在。25 武汉生物工程学院发酵工程教研室2)亚硝酸盐继续分解生产氨和氮，则培养液中不应该有硝酸盐存在。以上两种情况究竟属于哪一种，可用锌粉加以证明，如有硝酸盐存在，当向溶液加入锌粉后（锌是还原剂，将5价N变为3价N即把硝酸盐还原为亚硝酸盐）再加亚硝酸试剂，如溶液呈红色，说明硝酸盐未被利用，为负反应；相反地，硝酸盐不存在，则不呈红色，说明硝酸盐已被还原，为正反应。(五)吲哚试验某些细菌能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，此为红色物质。即为正反应，用“＋”表示。结果观察：在培养液中加入乙醚约1ml左右（使呈明显的乙醚层）充分振荡使吲哚溶于乙醚中，静止片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时沿管壁慢慢加入吲哚试剂约10滴，如吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色（加入试剂后不可摇动，否则被混合，红色不明显）。(六)H2S产生试验某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如甲硫氨酸及胱氨酸）生成H2S，如在配培养基时，预先加入柠檬酸铁氨，则二者化合产生黑褐色的硫化铁沉淀，即为正反应，用“＋”表示。(七)明胶液化试验某些细菌分泌蛋白酶（胞外酶），能分解明胶（动物蛋白）产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则培养后的培养基可由原来的固体形状变为液化形状，即为正反应，用“＋”表示。(八)淀粉水解试验某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），它能使淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不变蓝色，如果在菌体周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，即为正反应，用“＋”表示。透明圈的大小说明水解淀粉能力的大小。(九)油脂水解试验某些细菌可以产生脂肪酶（胞外酶），它能分解培养基中的脂肪成为甘油及脂肪酸，这是促使含油多的食物变坏的原因之一。油脂被分解的检验可通过在配制油脂培养基时，预先加入中性红指示剂（在中性时呈黄色，而在酸性时呈红色），当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则培养基中出现红色斑点，即为正反应，用“＋”表示。(十)石蕊牛乳试验牛乳中通常含有蔗糖，乳糖，蛋白质（酪素）等成分，细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及对酪蛋白的分解利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂（在中性时呈淡紫色，在酸性时呈红色，在碱性时呈蓝色）。细菌对牛乳的利用分为三种情况：(1)酸凝固作用25 武汉生物工程学院发酵工程教研室细菌发酵乳糖后产生许多酸，使石蕊牛乳变红，同时当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称“酸凝固”（牛乳凝固，红色）(2)凝乳酶凝固作用某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固作用在中性环境中发生，通常这类细菌还具有水解蛋白的能力，产生一些碱性物质，使石蕊变蓝（牛乳被凝固，紫或蓝色）(3)胨化作用酪蛋白被水解，使牛乳变的清亮透明，胨化作用可以在酸性或碱性条件下进行，有时石蕊色素被还原脱色（蛋白酶越多，胨化现象越显著，这是过去选择蛋白酶菌方法之一），有时呈红色或蓝色（牛乳变清，红色或蓝色或无色）。（十一）柠檬酸盐利用试验细菌生长繁殖时，须从生活环境中取得氮及碳元素作为营养。在此培养基中仅有无机盐及唯一的有机盐即柠檬酸盐作为营养，氮源可由磷酸铵提供，而碳源只能来源于柠檬酸钠，如果细菌不能分解柠檬酸盐，就不能得到碳素营养，因此就不能在这种培养基上生长。大肠杆菌，痢疾杆菌等都不能分解柠檬酸盐，因此，在这种培养基上不能生长。但产气杆菌能利用，故可生长，细菌在分解柠檬酸盐及磷酸铵后能产生碱性化合物，以致培养基由绿色变成深蓝色，溴百里酚蓝的指示范围：pH6.0～7.6由绿变蓝。★实验培养基配制法：(1)葡萄糖发酵培养基蛋白胨10g，葡萄糖（乳糖）10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.4，1.6％溴甲酚紫水溶液2ml。配制时，按比例称取蛋白胨、NaCl、糖，加到蒸馏水中，加热溶解，调pH值到7.4～7.6，加入溴甲酚紫溶液（1.6％水溶液）至呈紫色为止。分装试管，试管内倒置一杜氏小管，然后塞上棉塞，115℃30分钟灭菌。(2)M·R与V·P试管培养基蛋白胨5g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾5g，蒸馏水1000mL，pH自然，115℃20分钟灭菌。按需要量，称取药品，分装试管，灭菌。(3)淀粉培养基蛋白胨5g，NaCl5g，牛肉膏3g，可溶性淀粉2g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.2。配制时，先用少量蒸馏水把淀粉调成糊状，加入到液化好的培养基中，按比例加入琼脂并加热融化，分装三角瓶，121℃30分钟灭菌。(4)油脂培养基蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，油或花生油10g，中性红（1.6%水溶液）约1mL，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃30分钟灭菌。配制时注意事项：1)不能使用变质的油。2)油和琼脂及水先加热。3)调好PH之后，再加中性红，使培养基稍呈红色为止。4)分装培养基，需要不断的搅拌，使油脂均匀分布于培养基中。(5)明胶培养基25 武汉生物工程学院发酵工程教研室牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，明胶150g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，115℃15分钟灭菌。(6)硝酸盐还原培养基蛋白胨10g，NaNO35g，蒸馏水1000mL，pH7.6，121℃30分钟灭菌。(7)产生硫化氢试验的培养基蛋白胨20g，NaCl5g，柠檬酸铁铵0.5g，硫代硫酸钠0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.2，121℃30分钟灭菌。(8)吲哚试验培养基蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g蒸馏水，1000mL，pH7.2，121℃30分钟灭菌。(9)石蕊牛乳培养基脱脂牛乳100ml（脱脂奶粉10g加10倍水稍加热一次，冷却，去上层油脂），pH7.0，用2.5％石蕊水溶液将牛奶调至淡紫色偏蓝为止（呈紫丁香色）［用不掺水的新鲜牛奶反复加热（三次）去掉脂肪，每次加热20～30分钟，冷却去奶油，在最后一次冷却后，用吸管把底层牛奶吸出，弃上层奶冲］。115℃30分钟灭菌。(10)柠檬酸盐培养基柠檬酸钠2.28g，NaCl5g，硫酸镁1g，磷酸氢二钾1g，磷酸铵或磷酸氢二铵1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8，溴百里酚蓝1％的酒精溶液8mL。注：调pH之后再加入指示剂，121℃20分钟灭菌。★★指示剂的配制：1)1.6％溴甲酚紫溶液溴甲酚紫1.6g蒸馏水100mL2)M·R试剂（甲基红试剂）甲基红0.2g乙醇（95％）300ml蒸馏水200mL变色范围pH4.4～6.03)V·P试剂1)5％的α-萘酚酒精溶液（此溶液易氧化，随配随用）2)40％KOH4)亚硝酸试剂A液：对氨基苯磺酸0.8g5mol/L醋酸100mL(1份冰醋酸加2.5份水)配制时可略加热溶解。B液：α-萘胺0.5g5N醋酸100mL不能加热溶解。把溶液A、B等体积混合，但此溶液不能较长时间保持。5)吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛2g乙醇（95％）190mL浓盐酸40mL25 武汉生物工程学院发酵工程教研室七、细菌学检验（一）细菌总数的测定方法细菌总数系指1g或1mL或每平方厘米面积检样上，经过处理，在一定条件下进行细菌培养后，所得到的细菌总数。1、检验程序细菌总数测定检验程序检样↓制备稀释菌悬液（10－2、10－3、10－4……）↓稀释菌悬液的平皿滴加（选用三个连续稀释度）↓培养基的平皿倾注↓定温、定时培养36±1℃，24±2或48±2小时↓菌落计数↓报告2、操作步骤（1）稀释菌悬液的制备以无菌操作，将检样25（或20）g或mL，加入含有225（或180）mL无菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振荡，或全部放入均质器（组织捣碎器）内，以8,000～10,000转/分，经1分钟，制成10－1稀释菌悬液。用1mL无菌吸管吸取10－1稀释液1mL，注入装有9mL无菌生理盐水或其他稀释液的试管中内，振荡试管混合均匀，即成10－2的稀释液，再依次稀释成10－3、10－4……的菌悬液，每稀释一次换取一支无菌吸管。（2）菌悬液的平皿滴加根据食品卫生标准要求或标本污染的情况，通常选用3个连续的稀释度，并分别以无菌吸管，吸取不同稀释度的菌悬液，滴加于无菌的平皿内，每个稀释度应滴四个平皿。（3）培养基的平皿倾注将融化并冷至45～50℃的营养琼脂培养基（可于50℃水浴保温）10～15mL25 武汉生物工程学院发酵工程教研室，注入已滴加菌悬液的平皿中，并立即转动平皿，使其均匀混合。同时应作空白对照，以便检查无菌操作效果。（4）定温培养待琼脂培养基凝固后，翻转平皿，倒置于36±1℃恒温培养箱内，培养24±2小时（肉、水产、乳和蛋品为48±2小时）后，进行检查与菌落计数，并求出每个稀释度的平皿平均菌落数。3、计数方法与报告按照五中方法进行。（二）大肠菌群的测定大肠菌群系指一群在32～37℃24小时内，能发酵乳糖产酸、产气，好氧和兼性好氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要存在于温血动物的肠道和粪便中，排出后可以污染水质和食品。有人研究，成人粪便中的大肠菌群含量，每g约有108～109个，若水中发现有大肠菌群，也可证实已被粪便污染，就有可能有肠道致病菌的存在。实践证明，在食品、水体中大肠菌群检出率的高低，即表明了粪便污染的程度，也反应了对人体健康危害性的大小。所以，对食品和水进行大肠菌群检验，具有广泛的卫生学意义。大肠菌群的检测方法：1、检验程序2、操作步骤(1)检样稀释以无菌操作将检样25(或20)mL(g)放于含有225(或180)mL无菌水三角瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）经充分振摇，即成10－1的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8,000～10,000转/分的速度处理1分钟，做成10－1的均匀稀释液。用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇试管混合均匀，做成10－2稀释液。另取1mL无菌吸管，按上项操作依次作10倍递减稀释液，每递减一次，换取一支无菌吸管。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个连续稀释度，每个稀释度接种3管。(2)乳糖发酵试验将待检样接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，在1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管。置于36±1℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气，则按下列程序进行。(3)分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。(4)证实试验25 武汉生物工程学院发酵工程教研室在上述平板挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于36±1℃温箱内，培养24±2小时，观察产气情况，凡乳糖管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。3、报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查最可能数（又叫最近似数，简写MPN）检索表。报告每100mL（g）大肠菌群的最可能数（MPN）。大肠菌群检验程序样品稀释乳糖胆盐发酵管36±1℃，24±2小时产气不产气大肠菌群阴性伊红美兰琼脂平板36±1℃，18～24小时革兰氏染色阴性无芽孢杆菌报告大肠菌群阴性大肠菌群阳性大肠菌群阴性革兰氏染色乳糖发酵管36±1℃，24±2小时革兰氏染色阳性产气不产气4、大肠菌群检测中有关培养基的制备(1)乳糖胆盐发酵管成分：蛋白胨20g，猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g，乳糖10g，蒸馏水1000mL，25 武汉生物工程学院发酵工程教研室0.04％溴甲酚紫水溶液25mL，pH7.5，115℃，15分钟灭菌。（双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍）(2)乳糖发酵管成分：蛋白胨20g，乳糖10g，0.04％溴甲酚紫水溶液25mL，蒸馏水1000mL，pH7.4，115℃，15分钟灭菌。(3)伊红美兰琼脂（EMB）成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2％伊红Y溶液20mL，0.65％美兰溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.1，115℃，15分钟灭菌。八、真菌学检验（一）霉菌总数的测定霉菌总数测定方法：1、稀释分析和菌落计数法按照五中方法进行。2、霉菌直接镜检计数法按照二（二）中方法进行。3、有关培养基的制备按照三中方法进行。（二）酵母菌总数的测定酵母菌总数测定方法：1、稀释分析和菌落计数法按照五中方法进行。2、酵母菌直接镜检计数法按照二（二）中方法进行。3、有关培养基的制备按照三中方法进行。九、菌种保藏（一）传代保藏25 武汉生物工程学院发酵工程教研室将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的温度下生长和保存的传代保藏方法，可用于实验室中若干菌种的保藏。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变。因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持低水平。斜面培养物应在密闭容器中5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。此方法一般不宜用于工业生产菌种的长期保藏。（二）矿物油浸没保藏将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，从方法简便有效。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌的保藏更为有效。浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1～2小时的矿物油，矿物油的用量以高于培养物1㎝为宜。方法如下：1、将培养好的保藏斜面直接加入无菌液体石蜡至超出斜面顶端1㎝左右，加盖试管塑料帽。2、将加液体石蜡的试管置于20℃或室温竖直放置保藏，严防液体石蜡冻结。农用微生物菌剂生产技术规程NY/T883—200425 武汉生物工程学院发酵工程教研室25