分子生物学检验技术课程教学大纲

《分子生物学检验技术》课程教学大纲课程编号：课程名称：分子生物学检验技术英文名称：analysistechniqueofmolecularbiology课程类型：专业课必修考查总学时：36学分：2.0理论课学时：30实验课学时：6适用对象：医学检验专业本科学生一、课程性质与地位分子生物学是医学领域发展最快的学科之一，日新月异的技术使它逐渐成为医学发展的重要支柱。随着本世纪初人类基因组计划的完成，医学发展进入了一个全新的时代。疾病基因的不断发现和克隆，使人们对疾病的认识也不断深入，而这些重大的医学进步离不开技术上的更新和发展，生物芯片技术、基因测序技术、毛细管电泳技术等，每一次技术的进步都为分子生物学的发展提供了有力的保障。分子生物学技术是一门重要的基础和应用课程，教学方式目前主要以理论课程为主，分基础理论和基础技术两个部分，重点讲述分子生物学检验技术的基础理论和基础知识，并引入近年发展的新理论、新技术，使学生了解和学习最新进展和相关内容。同时分子生物学技术最主要的作用是作为研究医学的一种媒介和工具，具有很强的实践性，其基本知识和理论来源于科学实验，因此现针对本科学生开展了分子生物学实验课程，实验教学是强化理论课的重要方式，是培养医学生实验科学概念和实验技能的重要途径，通过综合性的实验可以强化学生对理论的深入理解和实际运用，可以更全面直观的分析理论知识。更重要的是，实验教学是培养学生综合分析和解决问题的能力以及科学创新能力的重要方式。二、教学环节及教学方法和手段本课程是在学生系统学习了前期课程的基础上由检验教研室负责开设的，与本课程相关的基础课程有生物化学和生化技术等。本课程分为理论课程和实验课程两部分。理论课主要包括基础理论和基本技术，基础理论主要讲授基因和基因组、原核生物和真核生物基因组、人类基因组计划、蛋白质组学、肿瘤分子生物学等；基本技术包括了核酸提取、DNA重组技术、核酸分子杂交、聚合酶链反应、DNA芯片等。实验操作可以使学生将晦涩的理论知识更加融会贯通，因此针对本科学生选择性开设了实验课程——真核细胞DNA分离提取及酶切电泳实验，本实验是分子生物学技术的一个重要的基本技术， 在分子生物学研究中，获得相当纯度和完整性的基因组DNA，是在基因组DNA水平上进行研究和分析的基本前提，基因组DNA样品质量的好坏将直接关系到后续实验的成败。基因组DNA通常用于构建基因组文库、Southern杂交、多态性分析以及用PCR方法扩增克隆目的基因组片断等方面的研究，是其它许多分子生物学实验的基础。实验中要求学生按照相应的理论知识独立完成DNA分离提取与纯化的各种技术和操作。通过实验教学，一方面使学生巩固所学理论，另一方面培养学生实践操作技能和方法，同时也训练了学生运用综合技能的能力。三、教学内容及要求第一章绪论【了解】分子生物学检验技术在实验诊断中的应用。第二章原核生物基因组和病毒基因组第一节原核生物基因组【掌握】基因的分子生物学定义，原核生物基因组特征，操纵子的结构。第二节质粒【掌握】质粒的定义和用途。【熟悉】质粒的一般性质。第三节病毒基因组【掌握】病毒基因组的特点。【了解】HBV和HIV等病毒的结构特点。第四节朊病毒【自学】本节内容思考题：1、名词解释：基因、质粒、操纵子2、问答题：简述原核细胞基因组特点。第三章真核生物基因组第一节真核生物基因组特点【掌握】真核生物基因组的特点，单拷贝序列、中度重复序列和高度重复序列的概念。第二节基因组结构与疾病。【熟悉】染色质的结构和主要成分、核小体是染色质的基本结构单位。【了解】染色体形态、功能研究中所用术语与新技术简介。第三节人类基因组与人类基因组计划 【自学】本节内容思考题：1、名词解释：单顺反子、外显子、内含子、单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列2、问答题：真核生物基因组的特点。第四章癌基因和抑癌基因第一节癌基因【掌握】癌基因的概念，原癌基因激活的机制。【熟悉】sis家族、src家族、myc和myb家族、P53、RB家族及其表达产物。第二节抑癌基因【掌握】抑癌基因的概念，抑癌基因失活的机制。【熟悉】抑癌基因的检测。【了解】肿瘤发生的步骤。第三节原癌基因和抑癌基因的检测及评价【熟悉】原癌基因和抑癌基因的检测。思考题：1、名词解释：癌基因、抑癌基因2、问答题：原癌基因的激活的机制。第五章蛋白质组和蛋白质组学第一节蛋白质组学研究特点【掌握】蛋白质组概念。【了解】蛋白质组学研究特点。第二节蛋白质组的研究范畴【掌握】二维电泳。【熟悉】蛋白质组的研究范畴，研究蛋白质组的基本方法（如酵母双杂交、凝胶滞后电泳等）。第三节蛋白质数据库及其应用。【了解】蛋白质的数据库。第四节蛋白质组研究在医学中的应用【了解】蛋白质的医学应用。 思考题：一、名词解释：蛋白质组、凝胶滞后实验二、问答题：1、蛋白质和核酸相互作用的研究方法有哪些？2、二维电泳的基本原理是什么？第六章核酸的分离和纯化第一节核酸分离与纯化的设计与原则【掌握】核酸的浓度和纯度鉴定。第二节基因组DNA的分离与纯化【掌握】基因组DNA的分离方法和原理。第三节质粒DNA的提取与纯化【掌握】质粒DNA分离方法和原理。第四节RNA的分离与纯化【熟悉】RNA抽提，mRNA的分离和纯化。思考题：1、酚-氯仿法抽提基因组DNA的原理。2、质粒制备的主要方法是什么？并阐明其基本原理。3、如何鉴定核酸的浓度和纯度。第七章DNA重组技术第一节工具酶【掌握】基因重组的主要工具酶和它们的作用。第二节DNA重组载体【掌握】DNA重组的主要载体和它们各自的优点。第三节DNA重组与鉴定【熟悉】克隆和DNA重组的概念，基因重组的基本步骤，载体的概念及特征，载体的筛选标志和筛选方法，转化、转染、转导的概念、感受态菌的概念。【了解】基因重组的发展历史，重组DNA技术意义。第四节外源基因的蛋白表达【掌握】启动子、增强子、终止子、p因子的概念和作用;融合蛋白的概念以及表达融合蛋白的优点，真核细胞表达元件，哺乳动物基因转移的遗传选择性标记。 【了解】原核和真核生物表达的区别;表达产物的分离与纯化。第五节DNA序列测定【了解】双脱氧末端终止法测序的原理。思考题：一、名词解释：非融合型表达蛋白、融合表达蛋白、包涵体载体、基因克隆、转化、转染、转导、感受态二、问答题：1、基因重组中主要的工具酶有哪些？它们的基本作用是什么？2、什么是限制性内切酶？有几种限制性内切酶？基因工程中常使用的是哪一种？为什么？3、真核表达体系和原核表达体系的主要区别。第八章聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用第一节聚合酶链式反应【掌握】PCR反应的概念和原理，PCR反应体系的组成成分。第二节以PCR为基础的相关技术【掌握】逆转录PCR原理和方法。第三节PCR产物的检测【掌握】限制性片段长度多态性，单链构象多态性。第四节PCR技术在分子诊断中的应用【了解】PCR技术在临床医学中的应用。思考题：一、名词解释：PCR、RT-PCR二、问答题：1、PCR的基本原理是什么？PCR反应体系中基本的反应成分有哪些？2、PCR产物的检测方法有哪些？第九章核酸分子杂交技术与应用【掌握】杂交的基本原理，融解温度，分子杂交的分类和应用，Southern印迹杂交的基本过程。【熟悉】分子杂交过程，影响探针杂交的因素，探针标记的方法，杂交信号检测的方法。思考题： 1、名词解释：分子杂交、探针、原位杂交、融解温度、Southern杂交2、问答题：分子杂交的探针的种类和特点。第十章蛋白质分析技术【自学】本章内容第十一章生物芯片技术与应用【了解】生物芯片技术的应用。思考题：1、名词解释：生物芯片2、问答题：简述生物芯片的医学应用价值第十二章细胞凋亡和检测技术【掌握】细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的基本概念及其与医学研究、医学检验的关系。思考题：一、名词解释：细胞周期、细胞周期控制点、细胞凋亡、细胞坏死二、问答题：1.细胞坏死和凋亡的区别是什么?2.如何检测细胞凋亡的情况。四、实验【实验名称】真核细胞DNA的分离提取及酶切电泳【实验目的】1、以人外周血为原料，进行基因组DNA的提取，从而掌握真核细胞DNA的原理、原则、提取方法，进而掌握外源基因的基本制备方法。2、明确提取中各试剂的作用及各环节的注意事项。3、掌握琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和技术。【实验原理】真核细胞DNA分子是以核蛋白形式存在于细胞核中，制备DNA既要将其与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA的完整性，因此，从全血中制备基因组DNA时，首先用去污剂TritonX-100直接破裂红细胞和白细胞膜，使之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白细胞核；用SDS破坏核膜；用EDTA抑制Dnase的活性；用酚/氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去DNA溶液残存的蛋白质；最后用无水乙醇沉淀，即可获得基因组DNA。【实验材料】 1、器材：恒温水浴箱，台式冷冻高速离心机，紫外分光光度计，电泳仪，电泳槽，离心管，1.5mlEppendorf管，剪刀，牙签，宽口移液管(5ml、10ml)，移液器，吸头，锥形瓶，简易凝胶紫外观察仪或凝胶成像系统等。2、试剂：磷酸盐缓冲液(PBS)、 DNA提取缓冲液、苯酚、TE缓冲液(pH8.0)、5×TBE电泳缓冲液、蛋白酶K(20mg／m1)，溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)溶液，氯仿，异戊醇，琼脂糖，95％乙醇，75％乙醇，lkb梯度DNA分子量参照物，加样缓冲液等。【实验学时】6学时【实验要求】掌握操作步骤【实验操作】1、取0.3ml抗凝血，加入1.5mlEppendorf管中，加入1ml的细胞裂解缓冲液，充分混匀使其溶血，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。2、加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出，晾干，用200ulTE重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）3、加等量的酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，12000rpm离心，5min。4、取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000rpm离心，5min。5、取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min,12000rpm离心,10min。6、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。7、用1ml70%乙醇洗涤沉淀物1次，12000rpm离心，5min。8、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。9、加200ulTE重新溶解沉淀物。10、1%琼脂糖凝胶电泳检测。【思考题】如何检测DNA浓度及完整性？ 五、各教学环节学时及进度分配表课程内容理论课时实验课时小计（一）绪论、原核生物基因组与病毒基因组2（二）真核生物基因组4（三）癌基因与抑癌基因2（四）蛋白质组与蛋白质组学2（五）核酸的分离与纯化4（六）DNA重组技术6（七）聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用4（八）核酸分子杂交技术与应用2（九）生物芯片技术与应用2（十）细胞凋亡和检测技术2总计30636六、考核方式本课程为必修考查课，考核采用形成性考试加终结性考试相结合的方式。考核要求主要是教学大纲要求的基本知识和基本理论，适当考核学生分析问题和解决问题的能力，简要考核学生对前沿知识的了解程度。考核方式：理论课出勤和课堂表现、实验课考核、课程结业理论考试（闭卷）。课程结业理论考试（闭卷）题型及所占分值：选择题1分×40（其中A型题30分，B型题5分X型题5分）；概念题2分×5；填空题1分×10；简答题5分×5；病例分析7.5分×2题。成绩构成：平时成绩（出勤和课堂表现占5%、实验课成绩占20%）占25%；课程结业理论考试成绩（闭卷）占75%。七、推荐教材和教学参考书书目参考教材：《分子生物学检验技术》第1版，主编：傅桂莲人民卫生出版社，2003年出版主要参考书：《分子生物学检验技术习题集》主编：樊绮诗、吕建新人民卫生出版社，2007年出版