第10章 临床微生物检测仪器教学指导

第十章临床微生物检测仪器首页基本要求重点难点讲授学时内容提要1．基本要求1.1了解(1)微生物自动化检测系统的常见故障及维护(2)微生物自动化检测系统的进展1.2熟悉(1)微生物自动化检测鉴定系统的分类(2)自动血培养系统的工作原理(3)自动血培养系统的性能特点(4)微生物自动鉴定及药敏分析系统的性能特点(5)常见的自动微生物鉴定和药敏试验分析系统1.3掌握(1)第三代血培养系统的检测原理及分类(2)BacT/Alert系统的检测原理(3)Bactec9000系列的检测原理(4)自动血培养系统的基本结构与功能(5)微生物自动鉴定系统的工作原理(6)微生物自动药敏分析系统的工作原理(7)微生物自动鉴定及药敏分析系统基本结构与功能2．重点难点2.1重点(1)自动血培养系统的基本结构与功能(2)微生物自动鉴定及药敏分析系统基本结构与功能2.2难点(1)第三代血培养系统的检测原理及分类(2)微生物自动鉴定系统的工作原理8 (3)微生物自动药敏分析系统的工作原理3．讲授学时建议6学时~8学时4．内容提要4.1自动血培养系统4.1.1自动血培养系统的工作原理自动血培养系统主要由培养系统和检测系统组成。培养系统包括培养基、恒温装置和震荡培养装置。具有培养基营养丰富，检测灵敏度高，检出的时间短，检出病原菌的种类多，抗干扰能力强、污染明显减少等特点。检测系统由计算机控制，对血培养实施连续、无损伤瓶外监测。其工作原理主要是通过自动监测培养基（液）中的混浊度、pH值、代谢终产物CO2的浓度、荧光标记底物或代谢产物等的变化，定性地检测微生物的存在。根据检测原理的不同分三类（1）以检测培养基导电性和电压为基础的血培养系统血培养基中因含有不同电解质而具有一定导电性。微生物在生长代谢的过程中可产生质子、电子和各种带电荷的原子团（例如在液体培养基内CO2转变成CO3－），通过电极检测培养基的导电性或电压可判断有无微生物生长。（2）应用测压原理的血培养系统许多细菌生长过程中，常伴有吸收或产生气体现象，如很多需氧菌在胰酶消化大豆肉汤中生长时，由于消耗培养瓶中的氧气，故首先表现为吸收气体。而厌氧菌生长时最初均无吸收气体现象，仅表现为产生气体（主要为CO2），因此可利用培养瓶内压力的改变检测微生物的生长情况。（3）采用光电原理监测的血培养系统是目前国内外应用最广泛的自动血培养系统。其工作原理是微生物在代谢过程中必然会产生终代谢产物CO2，引起培养基pH值及氧化还原电位改变。利用光电比色检测血培养瓶中某些代谢产物量的改变，可判断有无微生物生长。根据检测手段的不同，这类自动血培养系统又可分成四类:①BioArgos系统该系统利用红外分光计检测CO2产生；②BacT/Alert系统该系统工作原理见图10-1；8 ③Bactec9000系列该系统工作原理见图10-2；④Vital系统该系统采用同源荧光技术来监测微生物的生长。图10-1BacT/Alert系统检测原理示意图图10-2BACTEC系统检测原理示意图4.1.2自动血培养系统的基本结构与功能（1）BacT/Alert自动血培养系统①培养瓶为一次性无菌培养瓶，瓶内为负压，便于标本采集时依靠负压作用将血液直接引人培养瓶。每个培养瓶底部都包含一个检测CO2的传感器，通过检测CO2变化作为微生物生长状况的指示器。BacT/Alert自动血培养系统配有专用的需氧培养瓶、厌氧培养瓶、小儿培养瓶和分枝杆菌培养瓶；②培养仪设有恒温装置、振荡培养装置及监测装置。组成主要包括：主电源开关；显示屏（显示培养瓶和系统信息，包括一个触摸屏便于操作者输入选择和数据）；条形码阅读器（用于装入或卸去培养瓶时扫描条形码确认培养瓶）；键盘（提供另一种输入方式，作为触摸屏或条形码阅读器输入失败时使用）；压缩驱动器（允许将系统资料制成压缩资料磁盘；内部温度监测器：监测培养仪内部温度，预设温度为35℃～37℃）；孵育箱（每个孵育箱由标有A、B、C和D的抽屉组成,每个抽屉拥有3个架子，可容纳60个培养瓶）；瓶位（装载并监测BacT/Alert培养瓶）；指示灯（主灯：灯亮时指示培养仪与微机不交流信息，它只在有限的功能方式中运转；抽屉黄色指示灯：抽屉打开时灯亮，关上抽屉指示灯灭，若抽屉打开时间过长或出现错误状况黄色指示灯将会闪烁；抽屉绿色指示灯：当选择了与抽屉或单元有关的操作，绿色指示灯亮，若抽屉打开时间过长，绿色指示灯亮和黄色指示灯一起闪烁；单元指示灯：位于每个瓶位的旁边，灯亮时指示培养瓶应放在哪里或从哪里卸出，同时也指示阴、阳性结果）。仪器还有各种接口，如数据柜接口、微机接口、打印机接口、调制解调器接口、LIS（实验室信息系统）接口等。8 ③数据管理系统系统配置的微机提供必需的数据管理功能。主要由主机、监视器、键盘、条形码阅读器及打印机等组成，是BacT/Alert自动血培养系统不可分割的一部分。主要功能是收集并分析来自BacT/Alert血培养仪的数据，并将患者和培养瓶的资料存入数据库。（2）BACTEC9000系列自动血培养系统根据可检测标本数量的不同分为9050、9120和9240三种型号，分别可检测50、120和240个标本。①培养瓶BACTEC9000系统提供多种专用封闭式培养瓶。②培养仪每种仪器的结构基本相同，主要由转动体、键盘、条形码阅读器、液晶显示屏、计算机及外部接口等组成。转动体：可同时装载并监测50～240个BACTEC9000血培养瓶。转动体以20°的角度固定，通过转动达到振荡培养的目的。键盘和显示屏：通过显示图标表明系统状态及各种功能的意义，操作者可根据显示屏上的图标进行功能键操作，如载入或卸出培养瓶、调节系统参数等。条形码阅读器：通过扫描条形码来确认培养瓶的信息，区分标本。计算机：贮存并运行各种系统软件。指示灯：培养箱上备有四个监测器指示灯，同时监测箱内的温度、培养瓶的阴阳性、仪器性能和报警系统。外部接口：通过接口可与远距离报警装置、打印机及LIS系统等相联。③数据管理系统获取、整理、处理及分析来自BACTEC9000系列培养仪的数据信息，以及将患者相关信息和培养瓶资料存入数据库，并进行管理。4.1.3自动血培养系统的性能特点(1)培养基营养丰富(2)以连续、恒温、振荡方式培养(3)培养瓶多采用不易碎材料制成(4)采用封闭式非侵入性的瓶外监测方式(5)自动连续监测(6)阳性结果报告及时，并经打印显示或报警提示(7)培养瓶多采用双条形码技术(8)培养瓶可在随时放入培养系统并进行追踪检测(9)数据处理功能较强(10)设有内部质控系统(11)用途广泛4.1.4自动血培养系统常见故障及维护(1)温度异常（过高或过低）8 (2)瓶孔被污染(3)数据管理系统与培养仪失去信息联系或不工作(4)仪器对测试中的培养瓶出现异常反应4.1.5血培养系统的进展从二十世纪七十年代至今，血培养技术的发展经历了观察指标从肉眼到放射性标记、再到非放射性标记，操作从手工到半自动、再到自动，结果判断从终点到连续判读、能记录细菌生长曲线、一旦出现阳性结果可随时报告几个阶段。已有三代血培养系统问世及使用，且性能不断地得以改进和完善。随着生命科学和数码信息技术的飞速发展，还可能研制出更符合临床要求的血培养系统：检出的范围更广，阳性率更高；灵敏度更高，污染率、假阳性率和假阴性率应降至最低；自动化和计算机的智能化程度更强；体积更小，仅需极微量的血液样品即可检出所有的微生物；检验周期更短，工作效率更高；成本更低，结果报告更快；使血培养检查更容易被患者接受。4.2微生物自动鉴定及药敏分析系统4.2.1微生物自动鉴定及药敏分析系统工作原理(1)鉴定原理采用微生物数码鉴定原理。数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。(2)抗菌药物敏感性试验的检测原理自动化抗菌药物敏感性试验使用药敏测试板（卡）进行测试，其实质是微型化的肉汤稀释试验。将抗菌药物微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，仪器每隔一定时间自动测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。得出待检菌在各药物浓度的生长斜率，经回归分析得到最低抑菌浓度MIC值，并根据CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，临床与实验室标准委员会。以前称NCCLS(美国国家临床实验室标准化委员会))标准得到相应敏感度：敏感“S”、中度敏感“MS”和耐药“R”。4.2.2微生物自动鉴定及药敏分析系统基本结构与功能(1)测试卡（板）各种微生物自动鉴定及药敏分析系统均配有测试卡或测试板。测试卡（板）是系统的工作基础，各种不同的测试卡（板）具有不同的功能。各测试卡（板）上都附有条形码，上机前经条形码扫描器扫描后可被系统识别，以防标本混淆。(2)菌液接种器8 绝大多数自动微生物鉴定及药敏分析系统都配有自动接种器，大致可分为真空接种器和活塞接种器，以真空接种器较为常用。仪器一般都配有标准麦氏浓度比浊仪，操作时只需稀释好的菌液放入比浊仪中确定浓度即可。(3)培养和监测系统测试卡（板）接种菌液后即可放入孵箱/读数器中进行培养和监测。一般在测试卡（板）放入孵箱后，监测系统要对测试板进行一次初次扫描，并将各孔的检测数据自动储存起来作为以后读板结果的对照。有些通过比色法测定的测试板经适当的孵育后，某些测试孔需添加试剂，此时系统会自动添加，并延长孵育的时间。监测系统每隔一定时间对每孔的透光度或荧光物质的变化进行检测。快速荧光测定系统可直接对荧光测试板各孔中产生的荧光进行测定，并将荧光信号转换成电信号，数据管理系统将这些电信号转换成数码，与原已储存的对照值相比较，推断出菌种的类型及药敏结果。常规测试板则直接检测电信号，从干涉滤光片过滤的光通过光导纤维导入测试板上的各个测试孔，光感受二极管测定通过每个测试孔的光量，产生相应的电信号，从而推断出菌种的类型及药敏结果。(4)数据管理系统数据管理系统就象整个系统的神经中枢，始终保持与孵箱/读数器、打印机的联络，控制孵箱温度，自动定时读数，负责数据的转换及分析处理。当反应完成时，计算机自动打印报告，并可进行菌种发生率、菌种分离率、抗菌药物耐药率等流行病学统计。有些仪器还配有专家系统，可根据药敏试验的结果提示有何种耐药机制的存在，对药敏试验的结果进行“解释性”判读。4.2.3微生物自动鉴定及药敏分析系统的性能(1)自动化程度较高，可自动加样、联机孵育、定时扫描、读数、分析、打印报告等。(2)功能范围大，包括需氧菌、厌氧菌、真菌鉴定及细菌药物敏感试验、最低抑菌浓度（MIC）测定。(3)检测速度快，快速荧光测试板的鉴定时间一般为2～4小时，绝大多数细菌的鉴定可在4～6小时内得出结果，常规测试板的鉴定时间一般为18小时左右。(4)系统具有较大的细菌资料库，鉴定细菌种类可达100～700余种不等，可进行数十甚至100多种不同抗菌药物的敏感性测试。(5)使用一次性测试卡或测试板，可避免由于洗刷不洁而造成人为误差。(6)数据处理软件功能强大，可根据用户需要，自动对完成的鉴定样本及药敏试验作出统计和组成多种统计学报告。(7)软件和测试卡（板）大多可不断升级更新，检测功能和数据统计功能不断增强。(8)设有内部质控系统，保证仪器的正常运转。4.2.4微生物自动鉴定及药敏分析系统的维护(1)严格按手册规定进行开、关机及各种操作，防止因程序错误造成设备损伤和信息丢失。(2)定期清洁比浊仪、真空接种器、封口器、读数器及各种传感器，避免由于灰尘而影响判断的正确性。(3)定期用标准比浊管对比浊仪进行校正，用ATCC标准菌株测试各种试卡，并作好质控记录。8 (4)建立仪器使用以及故障和维修记录，详细记录每次使用情况和故障的时间、内容、性质、原因和解决办法。(5)定期由工程师作全面保养，并排除故障隐患。4.2.5临床常见的自动微生物鉴定和药敏试验分析系统(1)VITEK 系统由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成。鉴定原理是根据不同微生物的理化性质不同，采用光电比色法，测定微生物分解底物导致pH值改变而产生的不同颜色，来判断反应的结果。在每张卡上有30项生化反应。由计算机控制的读数器，每隔1h对各反应孔底物进行光扫描，并读数一次，动态观察反应变化。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。系统最后一次读数后，将所得的生物数码与菌种数据库标准菌的生物模型相比较，得到相似系统鉴定值，并自动打印出实验报告。 该系统有根据细菌耐药规律而设定的专家系统，可帮助校正和修改结果。对于专家系统提示的不可能的或极少见的耐药表型应予以充分重视，需采用确认试验重新鉴定。如对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，对泰能耐药的肠杆菌，对青霉素耐药的β溶血性链球菌等。(2) MicroScan Walk/Away系统MicroScan Walk/Away系统由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时采用敏感度极高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶。鉴定板有普通板和快速板两种，普通板获得结果需要16～18h，快速板测定只需2～3.5h。系统采用8进制计算法分别将28个生化反应转换成8位生物数码。该系统有8种鉴定反应板，可鉴定包括革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90％菌株可在5.5h内获得对17～33种抗菌药物的MIC值。(3)PHOENIX 系统PHOENIX系统是新一代全自动快速细菌鉴定/药敏分析系统。仪器由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成，鉴定试验采用荧光增强技术与传统酶、底物生化呈色反应相结合的原理。药敏试验采用传统比浊法和呈色（Chromogenic ）反应双重标准进行药敏试验结果判断。 (4)SENSITITRE　ARIS系统该系统由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。在测定板底物中加入酶基质，使其与细菌产生的酶结合成荧光物质。不同的细菌作用于不同的底物，激发出不同强度的荧光，即可鉴定不同的细菌。药敏试验采用微量肉汤稀释2-8点，在每一反应孔内参入荧光底物，若细菌生长，表面特异酶系统水解荧光底物，激发荧光，反之则无荧光。以最低药物浓度仍无荧光产生的浓度为最低抑菌浓度(MIC)。(5)Biolog微生物鉴定系统其原理是利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。4.2.6微生物自动鉴定及药敏分析系统的进展8 微生物鉴定和药敏分析系统的发展顺应了临床的新需要。从早期的半自动检测仪到目前的全自动快速检测仪，可鉴定的微生物种类范围不断扩大，鉴定速度越来越快，自动化程度也越来越高，且促进实验室内和实验室间的标准化。特别是近来推出的一些新型检测仪中，加入了专家系统，即把临床微生物和抗菌药物耐药性方面卓有成效的一流专家的经验，编成一条条规则的软件，对细菌的药敏结果进行自动监测。未来理想的微生物鉴定和药敏分析系统应检测速度更快；检测的准确率和分辨率更高；自动化和电脑的智能化程度更强；可鉴定细菌种类及药敏试验种类更多；检测成本更低。8