生物化学实验指导

生物化学实验指导实验一生化实验基本操作一.玻璃仪器的洗涤在生化实验中，玻璃仪器洁净与否，是获得准确结果的重要环节。洁净的玻璃仪器内壁应十分明亮光洁，无水珠附着在玻壁上。㈠常用的洗涤方法：1.一般仪器，如烧杯、试管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗涤剂仔细刷洗。然后用自来水反复冲洗，最后用少量蒸馏水冲洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干备用。2.容量分析仪器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后应及时用自来水多次冲洗，细心检查洁净程度，根据挂不挂水珠采取不同处理方法。（1）如不挂水珠，用蒸馏水冲洗、干燥，方法同上；（2）如挂水珠，则应沥干后用重铬酸钾洗液浸泡4~6小时，然后按上法顺序操作，即先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，最后干燥。3.粘附有血浆的刻度吸量管等，有三种洗涤方法：（1）先用45%尿素溶液浸泡，使血浆蛋白溶解，然后用自来水冲洗；（2）也可用1%氨水浸泡，使血浆溶解，然后再依次用1%稀盐酸溶液、自来水冲洗；（3）以上二法如达不到清洁要求，可浸泡于重铬酸钾洗液4~6小时，再用大量自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2~3次。4.新购置的玻璃仪器，应先置于1~2%稀盐酸溶液中浸泡2~6小时，除去附着的游离碱，再用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗2~3次。5.凡用过的玻璃仪器，均应立即洗涤，久置干涸后洗涤十分困难。如不能及时洗涤，先用流水初步冲洗后浸泡在清水中，待后按常规处理。㈡使用重铬酸钾洗液（以下简称洗液）时应注意以下几点：1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前应尽量沥干。否则会因洗液被稀释而降低洗液的氧化力。2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等离子可与洗液发生化学反应，生成不溶性化合物沉积在容器壁上。因此，凡接触过上述离子的容器，应先除去上述离子（可用稀硝酸或5~10%EDTA钠清除）。3.油类、有机溶剂等有机化合物可使洗液还原失效。因此，容器壁上附有大量油类、有机物时，应先除去。4.洗液的酸性和氧化性很强，使用时应格外注意，千万不要滴落在皮肤或衣物上，以免灼伤或烧坏。5.洗液颜色由深棕色变为绿色时，说明洗液已经失效，应停止使用，更换新液。因重铬酸变成硫酸铬后不再具有氧化性。127 注：重铬酸钾洗液的配制取重铬酸钾20g溶于20ml蒸馏水中，加热至沸。冷却后再将200ml浓硫酸慢慢加入，边加边搅拌。注意：此时可产生高热。为防止容器破裂，应选用耐酸搪瓷缸或耐高温的玻璃器皿，切忌用量筒及试剂瓶等配制。为防止洗液吸收空气中的水分而被稀释变质，洗液应贮存于带盖的容器中。当清洁效力降低时，再加入少量重铬酸钾及浓硫酸就可继续使用。二.吸量管的使用吸量管和定量吸(移)液器(微量加样器)均为用来转移一定体积溶液的量器。㈠吸量管：生化实验中常用的有三种，最常用的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：⑴刻度吸量管的种类：　　　①按容量规格来分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等数种。其精密度按不同的容积可达移取量的0.1~1%。通常将管身标明的总容量分刻为100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其余类推。　②按“零”点位置来分，有“O”点在吸量管上端的（即读数从上而下逐渐增大），也有“O”点在吸量管下端的（读数从下而上逐渐增大)。两种标示方法，在使用时各有方便之处。　　③按刻度方法来分，刻度吸量管也有两种，一种是刻度刻到尖端的，将液体放出时，应吹出残留在吸量管尖端的少量液体(我实验室的刻度吸量管全部是这一种)，另一种是刻度不刻到尖端的。⑵刻度吸量管的正确使用方法：用右手拇指和中指夹住管身，将吸量管的尖端伸入试液深处，左手持洗耳球把试液吸入管内至高过刻度以上时，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制试液的泄放。吸液后应尽量使吸量管保持垂直，使右眼与刻度等高，稍微轻抬食指或轻轻转动吸量管，使试液面缓慢降落，至管内试液弯月面的最低点与吸量管的刻度线相齐为止。然后将吸量管插到需加试剂的容器中，让尖端与容器内壁靠紧，松开食指让液体流出。液体流完后再等15秒钟，捻动一下吸量管后移去（如需吹的吸量管，则吹出尖端的液体后再捻转一下吸量管移去）。⑶使用刻度吸量管的注意事项：　　①选择适当规格的吸量管：吸量管的最大容积应等于或略大于所需容积（ml数）。　　②仔细看清吸量管的刻度情况：刻度是否包括吸量管尖端的液体？读数方向是从上而下，还是从下而上？③拿吸量管时，刻度一定要面向自己，以便读数。④127 吸取试剂时应注意三点：一是先吹去吸量管内可能存在的残留液体，二是将吸量管插入试剂液面深部(以免吸液过程中因液面降低而吸入空气产生气泡或管内试剂进入洗耳球)，三是使用洗耳球(不可直接用口吸)。　　⑤按吸量管上口时应该用食指，不能用拇指。　　⑥吸取粘滞性大的液体(如血液、血浆、血清等)时，除选用合适的吸管(奥氏管)外，应注意拭净管尖附着的液体，尽量减慢放液速度(用食指压力控制)，待液体流尽后吹出管尖残留的最后一滴液体。　　⑦使用的吸量管应干净、干燥无水。如急用而又有水时，可用少量欲取试剂冲洗3次，以免试剂被稀释。2.移液吸量管：也有两种，常见的一种是吸量管的上端只有一个刻度，另一种是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狭窄处也有一刻度线。无论哪一种，在使用时将量取的液体放出后，只需将吸量管的尖端触及受器壁约半分钟即可，不得吹出尖端的液体。3.奥氏吸量管：准确度最高，使用时必需吹出留在尖端的液体。㈡定量吸(移)液器(微量加样器)：定量吸液器是吸量管的革新产品。由塑料制成。目前，因产地厂家不同其质量、价格差异十分悬殊。1.定量吸液器的优点：使用方便，取、加样迅速，计量准确，不易破损，能吸取多种样品（只换吸嘴即可）。2.定量吸液器的类型：有两种类型。⑴固定式：只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。其规格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。　　⑵可调式：在一定容量范围内可根据需要进行调节取加样量。例如规格为50～200μl的可调式定量吸液器，可以在50到200μl的范围内根据需要调节成设计容许的各种取加样容量（60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等）。一般来讲，固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。3.定量吸液器的使用方法：⑴选择适当的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。⑵持法：右手四指（除大拇指外）并拢握住吸液器外壳（使外壳突起部分搭在食指近端），大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。⑶取样(吸液)：用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。⑷127 排液：将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟（粘性较高的溶液停留时间应适当延长）。然后再把按钮按到第二停止点上，让吸嘴沿管壁向上滑动。当吸嘴尖与容器壁或溶液离开时，方可释放按钮，使其恢复到初始位置。⑸吸液器用后应及时取下吸嘴。将吸嘴用自来水冲洗后浸入盛水的容器内（以防干涸），待实验结束后集中仔细清洗。三.溶液的混匀㈠混匀的目的：⒈使反应体系内的各种物质分子很好地互相接触，充分进行反应；⒉使欲稀释的溶液成为浓度均一的溶液。㈡混匀的方法通常有以下几种：⒈使盛器作离心运动。⒉左手持试管上端，用右手指轻击试管下半部，使管内溶液作旋转运动。⒊利用旋涡混合（振荡）器混匀。⒋不得已时可用干燥清洁的玻璃棒搅匀。㈢混匀的注意事项：⒈防止盛器内的液体溅出或被污染。⒉严禁用手指堵塞管口或瓶口震荡混匀。四.离心机的使用离心法是分离沉淀的一种方法。它是利用离心机转动产生的离心力，使比重较大的物质沉积在管底，以达到与液体分离的目的。因液体在沉淀的上部，故称清亮的液体部分为上清液。电动离心机的使用方法：1.将欲离心的液体，置于离心管或小试管内。并检查离心管或小试管的大小是否与离心机的套管相匹配。2.取出离心机的全部套管，并检查套管底部是否铺有软垫，有无玻璃碎片或漏孔（有玻璃碎片必须取出，漏孔应该用蜡封住）。检查合格后，将盛有离心液的两个试管分别放入套管中，然后连套管一起分置于粗天平的两侧，通过往离心管与套管之间滴加水来调节两边的重量使之达到平衡。3.将已平衡的两只装有离心管的套管，分别放入离心机相互对应的两插孔内。盖上离心机盖。打开电源开关。逐档扭动旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所需数值。达到离心所需时间后，将转速旋钮逐步回零，关闭电源，让离心机自然停止转动后（不可人为制动），取出离心管。127 附：无蛋白质血滤液的制备一.实验目的通过无蛋白质血滤液的制备，练习玻璃仪器的洗涤、吸量管的使用、溶液的混匀及离心机的使用等基本操作。二.实验原理在生化分析中有时为了避免蛋白质的干扰，常用沉淀蛋白质的试剂除去血液中的蛋白质。这种在血液中加了沉淀剂，经离心或过滤得到的上清液或滤液，称为无蛋白质血滤液。常用的蛋白质沉淀剂有：钨酸、钨酸钠与硫酸、三氯醋酸或氢氧化锌等。三.实验方法和步骤1.每人取4支试管和2支离心管，仔细洗涤干净（洗净的标准是什么？）。然后，将其中的1支离心管和1支试管，用气流烘干器烘干，其余的试管和离心管倒置在试管架上。2.在1支干燥的离心管中，加入蒸馏水1.4ml及全血0.2ml，充分混匀使之全部溶血。再加入10%钨酸钠0.2ml，混匀，2/3mol/L硫酸0.2ml，充分混匀后应无鲜红的血块留在管底。（注意：为使血液中的蛋白质全部沉淀，加试剂的顺序切勿颠倒。）3.混匀后，放置10分钟左右，使蛋白质充分沉淀，此时血液的鲜红色变成褐红色。然后离心5分钟（转速：2000转/分）。4.取出离心管，将上清液（即血滤液）转移到另一干燥试管内。转移的方法可采用直接倾倒上清液，或用滴管将上清液吸出。最好能一次吸净，否则上清液易混浊。血滤液若有混浊必须重新离心、转移。注：试剂的配制（1）10%钨酸钠（2）2/3mol/L硫酸：95.6%浓硫酸（比重1.84）37ml加入963ml蒸馏水中，混匀。（3）蒸馏水127 实验二缓冲溶液一.实验目的掌握配制缓冲溶液的原理和方法，加深对缓冲溶液性质的认识。二.实验原理由弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸组成的，具有一定的pH值，不因稀释或加入少量强酸或强碱而使其pH值有明显改变的溶液称为缓冲溶液。缓冲溶液的pH值的计算公式为：pH=pKa+lg[B-]/[HB](1)由于：[B-]=CB－VB－/V[HB]=CHBVHB/V(V为缓冲溶液的总体积，VB－和VHB分别为共轭碱和弱酸的体积，CB－和CHB分别为混合前的共轭碱和弱酸的摩尔浓度）。代入(1)式，得：pH=pKa+lg(CB－VB－/CHBVHB）(2)当CB－=CHB时，则得：pH=pKa+lg(VB－/VHB）(3)利用(2)或(3)式，可配制具有一定pH值的缓冲溶液，也可计算出一定浓度和体积的弱酸及其共轭碱溶液配制的缓冲溶液的pH值。由(1)式可知：缓冲溶液的pH值取决于[B－]/[HB]的比值（缓冲比）。因此，稀释缓冲溶液时几乎不影响缓冲溶液的pH值。由于缓冲溶液中有抗酸成分和抗碱成分，故加入少量强酸或强碱，其pH值几乎不变。但所有缓冲溶液的缓冲能力都有一定限度，即各具有一定的缓冲容量。如果加入的强酸或强碱超过了缓冲容量，则可引起溶液pH值的急剧改变，失去缓冲作用。三.实验方法和步骤㈠缓冲溶液的配制：取洁净的大试管3支，编号，放在试管架上，然后用10ml刻度吸量管按下表中所示的数量(单位：ml），吸取1/15mol·L-1Na2HPO4及1/15mol·L-1KH2PO4加入试管中。试管号试剂（ml）1231/15mol·L-1Na2HPO49.56.21.21/15mol·L-1KH2PO40.53.88.8PH（计算结果）计算所配制缓冲溶液的pH值，记入报告中。同时用洁净的玻璃棒蘸取上面配制好的三种缓冲溶液，与精密pH试纸接触，显示颜色与标准色列比较，粗测三种缓冲溶液的pH值。粗测结果是否与计算结果相符？如果不符，应分析原因。㈡127 缓冲溶液的稀释：按下表所列顺序作以下实验。比较第3、4管的颜色是否与第2管相同？将观察结果记入报告，并解释出现该现象的原因。试管号试剂1234自制2号缓冲溶液(ml)421蒸馏水(ml)423混合指示剂(滴)1111溶液显示的颜色（记录）㈢缓冲溶液的抗酸、抗碱作用：按下表所列顺序作以下实验。比较加入酸碱后1和2管、3和4管、5和6管、7和8管溶液颜色的是否相同，将观察结果记入报告，并解释出现该现象的原因。试管号试剂12345678蒸馏水(ml)22自制1号缓冲溶液(ml)22自制3号缓冲溶液(ml)220.1mol·L-1NaCI(ml)22混合指示剂(滴)111111110.01mol·L-1HCI(滴)11110.01mol·L-1NaOH(滴)1111溶液显示的颜色（记录）注：试剂的配制⑴1/15mol·L-1Na2HPO4：取11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1000ml蒸馏水中，混匀。⑵1/15mol·L-1KH2PO4加：取9.078gKH2PO4溶于1000ml蒸馏水中，混匀。⑶精密pH试纸⑷蒸馏水⑸0.01mol·L-1HCI：取8.2ml浓盐酸（浓度：37.2%，比重：1.19）溶于900ml蒸馏水中，再加蒸馏水至10000ml，混匀。⑹0.1mol·L-1NaOH：将4.000gNaOH溶于少量蒸馏水中，再加蒸馏水至10000ml，混匀。　⑺混合指示剂：500ml乙醇中溶解：0.4g溴百里酚蓝，0.5g127 百里酚蓝，0.3g甲基黄，0.1g酚酞，0.2g甲基红。⑻混合指示剂的变色范围：pH246810颜色红橙黄绿蓝实验三功能基实验一.实验目的1掌握醇、酚、醛、酮和尿素的化学性质及鉴别法。1.掌握滴管的使用和加热的方法等基本操作技术。二.实验原理1醇一元醇是中性化合物。在强氧化剂重铬酸钾的作用下，伯醇可被氧化生成醛或在高温下进一步氧化生成羧酸。仲醇可被氧化生成酮。醇与羧酸生成羧酸酯，乙酸与异戊醇起酯化反应生成乙酸异戊酯。具有两个相邻羟基的多元醇与新配制的氢氧化铜反应，使氢氧化铜沉淀消失形成深蓝色的溶液。用此反应可鉴别含有两个相邻羟基的多元醇。2酚酚羟基上的氢原子能部分电离，故酚具有弱酸性，能溶于NaOH溶液中，生成酚盐。酚类或含有酚羟基的化合物，能与三氯化铁发生各种特有的颜色反应，产生颜色的原因主要是生成复杂的配合物，但具有烯醇结构的化合物也有这个反应。3醛和酮醛和酮都具有羰基，因此它们具有许多相似的化学性质。例如：醛和酮都能与2,4-二硝基苯肼反应，析出2,4-二硝基苯腙黄色结晶（通常，用2,4-二硝基苯肼试剂来检识具有羰基结构的化合物，称为羰基试剂）。又因为在醛和酮的分子中，羰基所连接的基团不同，其化学性质又有差异。醛的羰基上连有一个氢原子，化学性质比较活泼，易被弱氧化剂氧化，能与多伦（Tollen）试剂发生银镜反应，能与斐林（Fehling）试剂反应生成砖红色Cu2O沉淀，还能与品红亚硫酸试剂发生颜色反应。酮则不能发生这些反应。因此，常用多伦和斐林试剂区别醛和酮。具有：CH3-CO-R(H)结构的醛、酮或CH3-CHOH-R(H)127 结构的醇都能发生在碱性溶液中与碘作用生成碘仿的反应。碘仿为黄色固体，有特臭，易识别，此反应称为碘仿反应。丙酮在碱性溶液中能与亚硝酰铁氰化钠作用显红色，此反应用作检验丙酮的存在。4尿素将尿素加热至熔点以上，则两分子尿素脱去一分子氨而生成缩二脲（双缩脲），缩二脲分子中含有两个肽键。凡化合物分子中含有两个或两个以上肽键时，在碱性溶液中均可和铜盐生成紫红色的配合物，这种显色反应称为缩二脲反应。三.实验方法和步骤㈠基本操作1滴管的使用：需要少量液体试剂时，可用橡皮头滴管从滴瓶中吸取。方法是先取出滴管轻捏橡皮头，排去滴管内空气，然后插入试剂中，放松手指，液体即能吸入管中，取出（注意：滴管应保持直立勿倒转，以免液体流入橡皮头内），移入容器，勿使滴管口触及器壁，以免弄脏管口，而把杂质带回试剂瓶中以致弄坏全部试剂。轻捏橡皮头使液体滴入容器，大约20滴相当于1ml。2加热：化学反应速度与反应时的温度有密切关系，在室温时有的反应很慢，升高温度可加速反应的进行。所以，加温是一项常用的基本操作技术。加热方法如下：⑴试管加热时，一般用试管夹夹住试管上部，先使管内液体普遍受热，，然后在底部加热，并不断上下移动和振荡。一定要使溶液受热均匀，否则会突然溅出。加热时管口不要朝着自己或别人。⑵烧瓶或烧杯加热时，须放在石棉网上，否则会因受热不匀而裂损。附有铁环和铁夹的铁架，是常用来固定各种容器的器具。⑶瓷制器皿可以用灯火直接加热。溶液的蒸发浓缩及焙干一般用蒸发皿。无论那种器皿，在加热前都要把外面的水擦干。强热后的器皿不可与冷的铁器或桌面接触，应把它放在石棉网上。⑷有机化学反应速度较慢，需长时间加热，而且许多是易燃的有机溶剂（如：乙醚、乙醇等），因此严禁用明火直接加热。应选用间接加热（水浴加热、油浴加热）的方法。①水浴加热：适于加热到100℃以下的反应。目前，一般是将容器浸入事先调好温度的电子控温水浴锅中保温。也可将盛水的较大容器（如：大烧杯等）加热到要求温度，再把欲加温的试管浸入热水中。②油浴（或石蜡浴）加温：适于加热到100～250℃的反应。㈡实验方法1醇的氧化：取3支小试管，编号，各加入0.5%重铬酸钾溶液2滴和3mol·Lˉ1H2SO41127 滴，然后分别加入10滴95%乙醇、异丙醇和叔丁醇，将各试管摇匀，3分钟后观察有何现象。2醇的酯化反应：在1支干燥的大试管内加入2ml醋酸、2ml异戊醇及0.5ml浓硫酸，然后将试管用试管夹夹好后放在水浴中加热10分钟。加热完毕，将试管内的反应生成物倒入盛有冷水的另1支大试管中，观察有无分层现象，能否闻到愉快的香味？3醇与氢氧化铜的反应：于一试管中加入2%CuSO4溶液6滴，再滴入5%NaOH溶液8滴，使Cu(OH)2完全沉淀下来，将悬浊液的一半倒入另一试管，两试管在振摇下分别加入2滴甘油和乙醇，观察结果，并加以比较。4酚的酸性：在1支小试管中加入绿豆大小的一块固体苯酚，再加1ml蒸馏水充分振荡，得一乳浊液，然后滴入5%NaOH溶液至苯酚完全溶解。再此溶液中再加入3mol·Lˉ1H2SO4溶液呈现酸性，观察有何变化。5酚与三氯化铁作用：取试管4支，分别加入2%苯酚溶液、0.2%邻苯二酚溶液、1%间苯二酚溶液、1，2，3-苯三酚溶液各5滴，每支试管各加入1%FeCI3溶液1滴，摇匀。记下各管中所产生的颜色。6醛、酮与2,4-二硝基苯肼的反应：取2支试管，各加入1ml2,4-二硝基苯肼溶液，然后分别加入3～4滴乙醛与丙酮，用力振荡。如无沉淀生成，可静置5～10分钟，观察有无沉淀生成。必要时用玻璃棒摩擦管壁，以促使晶体析出。7醛、酮与品红亚硫酸试剂的反应：取试管2支，各滴入10滴品红亚硫酸试剂，在第一管加入2～3滴乙醛，第二管加入2～3滴丙酮，观察两管有何现象发生。8丙酮的检识（亚硝酰铁氰化钠Na2[Fe(CN)5NO]试验）：取1支试管，加入1滴5%的丙酮水溶液，然后加入5%亚硝酰铁氰化钠和10%NaOH溶液各2滴，观察呈现何种颜色？9尿素的特殊反应—缩二脲反应⑴缩二脲的制取：取1支干燥试管放置0.1g尿素（绿豆大小），小心加热至熔化，有氨的气味放出（闻其气味），继续将试管加热时，试管内的物质逐渐凝固，即成为缩二脲。放冷留作下面实验用。⑵缩二脲反应：在上述试管中，加入3ml热水和5%NaOH溶液10滴，尽量使固体溶解，然后试管加入3滴2%CuSO4溶液，振荡，观察试管有何颜色变化。注：试剂的配制（1）浓硫酸、醋酸、95%乙醇、异丙醇、叔丁醇、甘油、苯酚、乙醛、丙酮、尿素。（2）3mol·Lˉ1H2SO4（3）0.5%重铬酸钾溶液（4）5%NaOH溶液（5）2%苯酚溶液（6）2%邻苯二酚溶液（7）1%间-苯二酚溶液127 （8）2%邻苯二酚溶液（9）2%1,2,3-苯三酚溶液（10）1%FeCI3溶液（11）5%丙酮水溶液（12）5%亚硝酰铁氰化钠溶液(13)2%CuSO4溶液(14)2,4-二硝基苯肼试剂：将2g2,4-二硝基苯肼溶于15ml浓硫酸中，加入150ml95%乙醇，以蒸馏水稀释至500ml，搅拌使其混合均匀，必要时过滤供用。（15）品红亚硫酸试剂：将0.2g品红盐酸盐研细，溶于含2ml浓盐酸的200ml蒸馏水中，再加入2g亚硫酸氢钠，搅拌后静置，直至红色腿去。如溶液最后仍呈黄色，则加入0.5g活性炭，搅拌后过滤，把试剂保存在严密的棕色试剂瓶中。实验四糖的性质实验一.实验目的加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化学性质的关系。二.实验原理糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。单糖及分子中含有半缩醛（酮）羟基的二糖都具有还原性，能将班氏试剂还原成砖红色的Cu2O沉淀。蔗糖等不含有半缩醛（酮）羟基的糖则无还原性。但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无还原性。但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与班氏试剂发生反应。淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检验淀粉或碘。糖在浓酸存在下，可与酚类化合物产生颜色反应。糖在浓硫酸的作用下与α-萘酚反应显紫色，常用于糖类化合物的检出。己酮糖与间-苯二酚-盐酸试剂反应很快出现鲜红色，而己醛糖显色缓慢，两分钟后可出现微弱的红色，因此常用于区别酮糖（果糖）和醛糖（葡萄糖）。三.实验方法和步骤㈠糖的还原性：取5支大试管，编号后各加入1ml127 班氏试剂，再分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液各10滴。振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热3～5分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。㈡蔗糖的水解：取2支大试管，各加入2%蔗糖溶液1ml，然后于一支试管中加入3mol·Lˉ1H2SO42滴，将此支试管置于沸水浴中加热5～10分钟，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止。将两支试管各加入班氏试剂1ml，再在沸水浴中加热3～5分钟，观察并比较两管的结果。㈢淀粉与碘的作用：取1支大试管加10滴2%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，观察呈现的颜色。然后将此试管放入沸水浴中加热5～10分钟，观察有何现象。取出试管，放置冷却，又有何变化，为什么？㈣淀粉的水解：取1支大试管，加2%淀粉溶液2ml,再加入浓盐酸3滴，在沸水浴中加热10～15分钟，加热时每隔1～2分钟取出1滴反应液，置于白瓷滴板上，加1滴碘液，注意观察其颜色的变化过程，直到无蓝色出现为止。取出试管，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止，加入班氏试剂5～10滴，然后在沸水浴中加热3～5分钟，观察结果。㈤糖的颜色反应⒈α-萘酚反应：取4支小试管，分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液1ml，然后各加入新配制的α-萘酚试剂2滴，混合均匀后，将试管倾斜沿管壁徐徐注入浓硫酸各1ml,切勿摇动。然后竖起试管，静置10分钟，观察两液界面之间出现紫色环。如无紫色环生成，可在水浴中温热后再进行观察。⒉间-苯二酚反应：取4支大试管，分别加入间-苯二酚-盐酸试剂1ml，然后在三支试管中各加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖溶液5滴，第4支试管留作对照。将4支试管摇匀后，同时放入水浴中加热2分钟，观察各管出现颜色的顺序。注：试剂的配制（1）班氏试剂的配制：称取柠檬酸钠20g，无水碳酸钠11.5g，溶于100ml热水中，在不断搅拌下把含2g硫酸铜晶体的20ml水溶液慢慢加入。溶液应澄清，否则需过滤。（2）2%葡萄糖（3）2%果糖（4）2%麦芽糖（5）2%蔗糖（所用蔗糖必须纯净）（6）2%淀粉溶液：将2g可溶性淀粉用10ml蒸馏水调成糊状，加入90ml沸水中煮沸后冷却。（7）3mol·Lˉ1H2SO4溶液（8）10%Na2CO3溶液（9）0.1%碘液：在1g碘和5g127 碘化钾中，加入尽可能少的蒸馏水使其溶解，然后用蒸馏水稀释为1000ml。（10）浓盐酸（11）α-萘酚试剂的配制：将10gα-萘酚溶于95%乙醇中，再用同样的乙醇稀释至100ml，贮于棕色瓶中，一般用前才配制。（12）浓硫酸（13）间-苯二酚-盐酸试剂的配制：将0.05g间-苯二酚溶于50ml浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100ml。实验五蛋白质的性质实验一.实验目的加深对蛋白质呈色反应、沉淀反应及等电点的认识。二.实验原理蛋白质分子中的氨基酸是以肽键连接的，因此蛋白质具有缩二脲反应。由于蛋白质分子中含有自由氨基，可与茚三酮试剂作用生成紫蓝色化合物，此反应称茚三酮反应。以上呈色反应可用于检验蛋白质。在蛋白质溶液中加入中性盐[(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl等]时，蛋白质即沉淀析出，这种过程称为盐析作用或盐析。盐析作用包括两种过程：（1）大量电解质破坏了蛋白质的水化层而出现沉淀；（2）电解质中和了蛋白质分子所带的电荷而沉淀。中性盐能否沉淀各种蛋白质常决定于中性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH、以及蛋白质胶体颗粒的大小。颗粒大的比颗粒小的容易析出，如球蛋白多在半饱和(NH4)2SO4溶液中析出，而清蛋白则常在饱和(NH4)2SO4溶液中析出。极性较大的有机溶剂（如：甲醇、乙醇、丙酮等）由于对水的亲和力较大，可破坏蛋白质的水化层使其沉淀；当溶液的pH值大于蛋白质的等电点时，蛋白质带有较多的负电荷，可与重金属离子结合生成不溶性的蛋白盐沉淀；在溶液的pH值小于蛋白质的等电点时，蛋白质带有较多的正电荷，可与酸（如：苦味酸、钨酸、三氯醋酸、磺基水杨酸、偏磷酸等）根离子结合生成不溶性蛋白盐沉淀。当蛋白质解离成两性离子（其分子净电荷为零）时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。酪蛋白溶液在等电点时很不稳定，可以发生沉淀。所以，可以根据相对浊度来测定酪蛋白的等电点的近似值。三.实验方法和步骤127 ㈠茚三酮反应取小试管1支，加10%鸡蛋白溶液4滴，蒸馏水10滴和0.2%茚三酮乙醇液6滴，混匀，在沸水浴中加热5～10分钟，待冷却后观察溶液的颜色变化。㈡沉淀反应⒈盐析：取10%鸡蛋白溶液4ml于小试管中，再加入4ml饱和(NH4)2SO4溶液，混匀，静置20分钟后，则球蛋白全部析出。离心（2000转/分钟）5分钟，取上清液1ml加固体(NH4)2SO4约0.5g使之饱和，边加边振摇至溶液出现浑浊，再向浑浊液（应不含硫酸铵结晶颗粒）加1.5～2.0ml蒸馏水，观察结果。⒉重金属盐沉淀蛋白质：取试管1支，加入10%鸡蛋白溶液1ml，及0.5%NaOH溶液1滴混匀，再加入0.5%硫酸锌溶液6滴，观察结果。⒊三氯乙酸沉淀蛋白质：取试管1支，加入10%鸡蛋白溶液1ml，然后再加入10%三氯乙酸溶液3～5滴，观察沉淀的生成。㈢蛋白质等电点的测定：⒈取5个大试管，编号，按下表准确加入试剂，混匀。试管号试剂(ml)12345蒸馏水8.48.78.08.27.40.01mol/L醋酸0.6————0.1mol/L醋酸—0.31.0——1.0mol/L醋酸———0.81.60.5%酪蛋白醋酸钠溶液（加入方法见后）1.01.01.01.01.0溶液pH值5.95.34.74.03.5浊度比较⒉各试管加入酪蛋白醋酸钠溶液时，应随加随摇（切勿在各管加完后才摇），观察各管浊度。静置10～30分钟后，比较各管浊度，用（＋）多少表示其浑浊程度。沉淀最多而上清液最透明的试管的pH值，即为酪蛋白的等电点。为什么？注：试剂的配制（1）蒸馏水(2)10%鸡蛋白溶液(v/v)(3)0.2%茚三酮乙醇液(4)固体(NH4)2SO4127 (5)饱和(NH4)2SO4溶液：称取377g硫酸铵溶于20℃500ml的蒸馏水中。硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶。(6)0.5%NaOH溶液(7)0.5%硫酸锌溶液(8)10%三氯乙酸溶液(9)0.01mol/L醋酸(10)0.1mol/L醋酸(11)1.0mol/L醋酸(12)0.5%酪蛋白醋酸钠溶液：称取纯酪蛋白0.25g，置于50ml容量瓶内，准确地加蒸馏水20ml及1mol/LNaOH5ml，摇匀，使酪蛋白溶解，然后准确地加1mol/L醋酸液5ml，最后用蒸馏水稀释至刻度。实验六蛋白质含量的测定（凯氏定氮法）一.实验目的掌握凯氏定氮法的原理、操作过程及计算方法，了解其实用意义。二.实验原理凯（Kyeldahl）氏定氮法是蛋白质含量测定的常用方法，它利用一般蛋白质含氮量较恒定，平均占16％左右，并且在一般生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生物组织中的含氮量可以计算出蛋白质的含量。凯氏定氮法的定氮原理是将生物样品放在凯氏烧瓶中与硫酸共热进行消化，并加入硫酸钾以升高沸点，以硫酸铜作催化剂。样品中的C、H等元素全部氧化为CO2及水汽挥发掉，有机氮转变为氨并与硫酸结合生成硫酸銨，然后以标准硫酸銨溶液为对照，用茚三酮法测定其含氮量，最后计算出蛋白质的含量。以甘氨酸为例，化学反应过程如下：CH2NH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH3↑NH3+H2SO4(NH4)2SO4三.实验方法及步骤（一）蛋白质样品液的制备：取3个干净的凯氏烧瓶，标号为：“样品A”（用于测定样品的总氮量N1）；“样品B”127 （用于测定样品的的非蛋白氮N2）和“样品C”（作为空白对照）。“样品A”为在0.2ml血清中加入0.8ml蒸馏水；“样品B”为用0.2ml血清制备的血滤液，其方法是：在一个干净的离心管中加入0.3ml血清和0.7ml蒸馏水，摇匀，再加入5％三氯醋酸0.5ml，摇匀，静置10分钟后离心（3000转/分，5分钟）取上清液1m供测定用。“样品C”为1ml蒸馏水。（二）蛋白质样品液的消化：在盛有样品的三个凯氏烧瓶里各加入固体硫酸钾与硫酸铜（3∶1）0.3g，浓硫酸5ml，玻璃珠二只，混匀。将凯氏烧瓶固定在铁架上置电炉或酒精灯加热（火力不可太旺）。消化架应放在通风橱中或用酸雾收集器收集酸雾。开始有水汽发出，后来冒出浓白烟（SO2）时，调节热源使SO2不致溢出过多。溶液逐渐变成棕色直至黑色，继续加热至瓶中消化液变成澄清的蓝绿色时，消化即完成。待冷却至接近室温时，小心沿管壁加水约10ml稀释消化液，将其倾入25ml容量瓶中，以少量蒸馏水冲洗消化瓶数次，全部倾入容量瓶内，然后用蒸馏水稀释至刻度，反复颠倒混匀。（三）三酮反应：取干净大试管4只，按下表操作：管号1234消化液（ml，下同）C0.5A0.5B0.5(NH4)2SO4标准液0.3PH5.5醋酸盐缓冲液1.51.71.51.5茚三酮试剂2222混匀，在沸水浴加热30分钟，冷却后，各管加入50％乙醇6ml，选用570nm的单色光，用“1号管”调零，测定2～4号管的吸光度，并记录在本表下一行。吸光度（A）四.计算（一）样品含氮量的计算：N1(mg/ml样品)＝（A3号管/A2号管）×0.3×(1/0.2)×(0.5/25)N2(mg/ml样品)＝（A4号管/A2号管）×0.3×(1/0.2)×(0.5/25)（二）样品蛋白质含量的计算：蛋白质含量（g/dl）＝(N1－N2)×6.25×100/1000注：1.主要仪器：分光光度计、100ml凯氏烧瓶、25ml容量瓶、玻璃珠（3mm）、电炉等。2.试剂的配制127 ⑴硫酸钾与硫酸铜混合物（K2SO4∶CuSO4·5H2O＝3∶1）研细混匀。⑵浓硫酸⑶50％乙醇⑷醋酸盐缓冲液（pH5.5）：4mol/L醋酸钠溶液与4mol/L醋酸溶液按443∶57.5（V∶V）的比例混合。⑸茚三酮试剂：将2g茚三酮溶解于50ml乙二醇甲醚、25ml醋酸盐缓冲液（pH5.5）及25ml蒸馏水，再加0.08g的SnCl2·2H2O（检查pH必须达到5.5）。⑹硫酸銨标准液（1mg氮/ml）：取适量硫酸銨（AR）置于110℃烘箱内半小时，使其干燥，继置干燥器内冷却。准确称取此干燥的硫酸銨0.4716g，溶于少量蒸馏水中，将溶液全部转移入100ml容量瓶内，加浓硫酸1滴，并用蒸馏水稀释至刻度。实验七氨基酸的纸层析一.实验目的学习层析技术的原理，掌握纸层析的具体操作。二.实验原理层析法又称色谱法（Chromatography），色层法或层离法，是近代生物化学实验中广泛应用的一种分离分析技术。层析法是利用混合物（样品）中各组分的理化性质（如溶解度、吸附力、分子的形状、大小、极性、分子所带电荷的性质和数量以及分子表面的特殊基团等）不同，而使各组分借以分离的分析方法。例如一个混合样品含有A（红色）、B（黄色）两个性质相似的组分及其它杂质，用一般的分离方法不能将其分离，因此无法测定A与B的含量。如果将此混合样品加至一个填充了Al2O3吸附剂的玻璃柱中，然后不断地从柱顶加入适当的溶剂，经过一定时间后，发现A在柱的下端，B在柱的中段，其它杂质留在柱的上端，达到了分离的目的，这种分离方法即称为层析法。其中Al2O3吸附剂称为固定相，溶剂称为流动相，填充了固定相的玻璃柱称为层析柱。层析法的分离原理是流动相在柱中往下流动时，已被吸附在柱顶端Al2O3上的A与B部分解吸溶于流动相中，随着流动相向下移动，当遇到新的吸附颗粒时，已解吸的溶质又有部分被重新吸附在Al2O3127 表面上。就这样，随着流动相的不断加入，在层析柱中不断发生着吸附、解吸、再吸附、再解吸。由于A和B在流动相中的溶解度不同，假若A在流动相中的溶解度略大于B，那么A在柱中的往下的移动速度就略大于B。经过多次反复，微小的差异逐渐变大，一定时间后A和B便在柱上形成两条区带，不溶于流动相的其它组分则仍留在柱子的上端。如果不断地加入流动相，就可以将分离后的组分从柱上先后洗脱下来，依次流出柱外。溶质可以进入固定相又可以进入流动相，这个过程称为分配过程，分配过程进行的程度可以用分配系数（K）表示。K=Cs/Cm（K是广义的分配系数，Cs是溶质在固定相中的浓度，Cm是溶质在流动相中的浓度）。因此，层析过程可以说是物质在两相间进行分配的过程。由于不同物质的分配系数不同，它们在层析柱中往下移动的速度也就不同，从而达到分离的目的。层析法由三种分类方法：1.根据两相所处的状态分类层析法中总是要有两相，流动相可以是液体也可以是气体。根据流动相所处的状态来分：流动相是液体的称液相层析法（LC），流动相是气体的称气相层析法（GC）。固定相可以是固体也可以是液体，但后者（液体）必须附载在某个固体物质（称为载体或担体）上。因此，根据固定相所处的状态不同，在液相层析法中又可分为液固层析法（LSC）和液液层析法（LLC）；在气相层析法中又可分为气固层析法（GSC）和气液层析法（GLC）。2.根据层析的原理分类可分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。⑴吸附层析法：固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。⑵分配层析法：固定相是液体，利用各组分在两相中的分配系数的差别而分离。⑶离子交换层析法：固定相是离子交换剂，利用各组分对离子交换剂亲和力的不同而进行分离的方法。⑷凝胶层析法：固定相是一种多孔性凝胶，利用各组分的分子大小不同，在通过凝胶时受阻滞的程度不同而得到分离。凝胶层析法也称分子筛层析法，凝胶起到分子筛的作用，或对分子大小不同的组分起过滤作用，故凝胶层析又可称为凝胶过滤。⑸亲和层析法：主要是利用各种待分离组分生物学性质不同的一种层析方法，固定相只对一种待分离组分具有亲和力（高度专一性），借以和没有亲和力的其它组分分离。3.根据操作形式不同分类可分为：柱层析法、纸层析法、薄层层析法和薄膜层析法。⑴127 柱层析法：是将固定相装在柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。⑵纸层析法：是用滤纸作为液体的载体，点样后用流动相（又称展开剂）展开，使组分达到分离。⑶薄层层析法：是将适当粒度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使组分达到分离。⑷薄膜层析法：是将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析的方法进行物质的分离。纸层析从层析原理来讲属于分配层析，它是以纸作固定相的载体，纸纤维上的羟基具有亲水性，因此滤纸吸附的水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展开，样品中的各种溶质（如氨基酸）即在两相中溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，因此不同的溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf＝原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离只要条件（如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。层析后，各种溶质在滤纸上的位置可用适当的化学或物理方法处理而使其显示出来。对于氨基酸常用茚三酮使之显色。三.实验方法及步骤1.向层析缸中装入展开剂，其深度约为1.5cm。2.用竹镊子取宽8cm，长18cm滤纸一条（手指不可接触纸面），在滤纸条一端2cm处用铅笔划一水平线（原线），在此线上均匀地标出7个小点间距1cm，并编号（1～7）。3.用毛细滴管在各点上依次点上缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸、样品1和样品2。点样直径以3mm为宜。4.待干燥后（可用电吹风吹干）可重复点样一、二次，再干燥。然后用线将滤纸悬挂在上述准备好的层析缸内，使划线的一端向下并浸入展开剂约1cm深，注意必须使点样点在液面（展开剂）以上，然后把盖盖紧。5.约40分钟，当溶剂上升到10～15cm高时，取出滤纸，并用铅笔标出溶剂前沿，把滤纸置于表面皿上再放入105℃的烘箱中干燥约15分钟。6.用喷雾器在滤纸上喷上茚三酮试剂，再置干燥箱中5分钟烘干（或用吹风机吹干）。这时，在滤纸的不同位置便有紫红色的斑点出现，用铅笔标出斑点的中心，用刻度尺量出各斑点所走的距离和溶剂所走的距离。四.计算127 计算出缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸的Rf值，并分析样品1和样品2中各含有哪些氨基酸。注：1.主要仪器：层析缸、烘箱、电吹风、喷雾器、表面皿、毛细滴管、竹镊子、刻度尺、铅笔、新华1号滤纸、针线等。2.试剂的配制：⑴0.1％缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸溶液：分别称取上述5种氨基酸各0.1g，分别溶于20ml蒸馏水中，测其pH值并用5％KOH或HCl调至中性，然后用pH7.40.01mol/L磷酸缓冲液稀释至100ml。Na2HPO4·2H2O分子相对质量＝178.05；0.01mol/L溶液为1.78g/LNa2HPO4·12H2O分子相对质量＝358.22；0.01mol/L溶液为3.58g/LNaH2PO4·H2O分子相对质量＝138.01；0.01mol/L溶液为1.38g/LNaH2PO4·2H2O分子相对质量＝156.03；0.01mol/L溶液为1.56g/LPH7.4时Na2HPO4溶液与NaH2PO4溶液的体积比为81∶19⑵样品1：用等量的组氨酸、谷氨酸、亮氨酸溶液混合。⑶样品2：用等量的缬氨酸、甘氨酸溶液混合。⑷展开剂：有两种方案，选一种。方案1正丁醇∶甲酸∶水15∶3∶2或30∶3∶2（V∶V）方案2饱和水的酚取50g重蒸馏酚（隔水加热熔化，量取50ml）与25ml水，在分液漏斗中充分混匀，于暗处放置过夜（7～10小时），分成两层，收集下层清液放入棕色瓶中保存。注意：在重蒸馏和移取酚时，务必防止溅在皮肤上，若溅在皮肤上，立即用70%酒精擦洗，以免腐蚀皮肤。⑸显色剂：0.1～0.25％茚三酮丙酮（或乙醇）溶液。实验八凝胶层析法分离血红蛋白与糜蛋白酶一.实验目的学习凝胶层析的原理，掌握凝胶层析的具体操作。二.实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是根据样品中各组分的分子相对质量不同，将样品通过凝胶柱来达到分离的目的。127 凝胶颗粒是多孔性的网状结构，其特点是化学性质稳定，不带电荷，与其他物质的吸附力很弱，制成的颗粒机械性能好，不易破碎变形，使液体在层析柱中具有较好的流速。用凝胶颗粒装柱后，当混合蛋白质溶液通过凝胶柱时，分子直径小于凝胶孔隙的可以进入胶粒内部，分子直径大于孔隙的不能进入。因此，小分子蛋白质在前进路上通过胶粒时遭受的阻力大，所以流速慢。与此相反，大分子蛋白质不会进入胶粒内部，可以比较顺利地通过胶粒间的空隙而流出，所以阻力小，流速快。由于流速不同，就可以把分子大小不同的蛋白质分开，因此将凝胶称为“分子筛”。用于凝胶过滤的凝胶，有交联葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel）、琼脂糖（Sepharose）等。各种凝胶都是三度空间的网状高分子聚合物，具有一定的孔径和交联度。根据被分离物质的分子大小、形状可选用不同类型的凝胶。交联度愈小，则孔径（网眼）愈大，能进入凝胶的分子就愈大。根据交联度的高低，各种凝胶可分为不同的型号，见下表：凝胶的交联度和被分离物质的分子相对质量表商品名型号分离蛋白质相对分子质量范围交联葡聚糖凝胶（Sephadex）G-10～700G-16～1500G-251000～5000G-501500～30000G-753000～70000商品名型号分离蛋白质相对分子质量范围聚丙烯酰（Bio-Gel）P-2200～1800P-4800～4000P-61000～6000P-101500～20000P-302500～40000凝胶的交联度和被分离物质的分子相对质量表商品名型号分离蛋白质相对分子质量范围琼脂糖（Sepharose）G-1004000～150000G-1505000～400000G-2005000～8000006B4×1064B104～2×107127 2B104～4×107P-603000～60000P-1005000～100000P-15015000～150000P-20030000～200000P-30060000～400000本实验用的SephadexG-50为层析床，将血红蛋白（分子相对质量64500左右）与糜蛋白酶（分子相对质量13500左右）从混合液中分开。为了便于观察，特将糜蛋白酶用二硝基氟苯（FDNB）染成黄色，血红蛋白本身是有色物质，不需着色即可观察。一.实验方法及步骤1.凝胶的准备：称取SephadexG-502～4g置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，在沸水浴中煮沸1小时使其膨胀（如在室温下处理需浸泡3小时），取出，待冷至室温时再装柱。2.装柱：取直径为0.8～1.5cm，长度为15～20cm的层析柱一支，在柱底部填少许玻璃棉或海绵圆垫，自顶部缓缓加入稀薄的SephadexG-50悬液，开始下沉时关闭出口，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，仍继续加入上述悬液，凝胶即逐层上升，加至距柱顶3cm左右即可。操作过程中，应防止气泡与分层现象的发生。如表层凝胶凹陷不平时，可用细玻璃棒轻轻搅动表面层，让凝胶自然沉降，使表层平整。3.样品制备：将血红蛋白溶液0.3ml与DNP-糜蛋白酶0.5ml混匀作为样品。4.加样与洗脱：加样时先将出口打开，使层析床面的蒸馏水流出，待液面几乎平齐凝胶表层时，关闭出口（不可使凝胶表层干掉）。用滴管将样品（约0.8cm）缓缓沿层析柱内壁小心加于床表面（注意尽量不使床面扰动），然后打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出。用上法再加1～1.5ml蒸馏水于床表面，使样品全部进入床内（蒸馏水不可过量，以免样品稀释太大），当少量蒸馏水将要流干时，反复加入多量蒸馏水进行洗脱，直到两条色带分开为止。注：1.主要仪器层析柱（0.8～1.5cm×20cm）、铁架台、水浴锅、天平、玻璃棉（或海绵圆垫）2.试剂的配制⑴交联葡聚糖凝胶（Sephadex）G50⑵血红蛋白溶液127 取抗凝血液5ml，离心（2000转/分，5分钟）除去血浆，血细胞用0.9％NaCl溶液洗涤3次，每次用5ml，并将血细胞搅起，离心后尽量倒去上清液。加蒸馏水5ml，混匀，放冰箱过夜使其充分溶血，再离心（3000转/分）10分钟，使细胞膜残骸沉淀，取上清液放冰箱备用。⑶DNP-糜蛋白酶取糜蛋白酶200mg溶于10％NaHCO310ml中，另取2,4-二硝基苯（简称FDNB）0.5mg溶于微热的95％乙醇10ml中，充分溶解后，立即倾入上述蛋白质溶液。然后，将此液置于沸水浴中，煮沸5分钟。冷后加两倍量的乙醇，使黄色DNP-糜蛋白酶沉淀，离心5分钟，弃去上清液。用95％乙醇洗沉淀2次，所得沉淀用5mi蒸馏水溶解。⑷蒸馏水实验九血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳一.实验目的学习电泳技术的原理和醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。二.实验原理带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。各种蛋白质都有它特有的等电点，血清中的各种蛋白质亦不例外。某种蛋白质在其等电点时，它呈中性状态，该分子既不带正电荷，也不带负电荷，它在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。但是在PH比其等电点较高的缓冲液中时，例如:在PH8.6的缓冲液中，由于血清中一些蛋白质的等电点均低于PH7.0，它们都游离成负离子。在电场中，均会向阳极移动，等电点离PH8.6愈远者，移动速度越快。各种血清蛋白质因等电点不同，其电离程度或带电数量也就不同，所以，在电场中泳动速度就有差异。蛋白质分子量小而带电多者，移动速度较快;分子量大而带电少者，移动较慢。如此，则血清中所含的各种蛋白质在电场中按其移动快慢可分为清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白等五条区带。在电泳过程中，带电颗粒的移动速度除与带电数量和分子量有关外，还受电场强度、溶液的离子强度、介质的粘度等因素影响。醋酸纤维（二乙酸纤维素）薄膜具有均一的泡膜状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用，应用范围广和快速简便等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。三.实验方法及步骤127 1.点样：取醋酸纤维薄膜一条（2.5×8cm），在薄膜的无光泽面距一端1.5cm处，预先用铅笔划一条线作为点样线，然后光泽面向下放入缓冲液中浸泡10分钟，待薄膜完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的缓冲溶液，用点样器的边缘沾上血清后，在点样线上迅速地压一下，使血清通过点样器印吸在薄膜上，点样力求均匀。待血清渗入薄膜后，以无光泽面向下，加血清的一端朝向电泳槽的阴极，两端紧贴在滤纸（四层）桥上，加盖，平衡2～3分钟，然后通电。2.通电：电压120伏，通电45分钟。3.染色：通电完毕，关闭电源将薄膜取出，直接浸于丽春红-S5分钟。4.漂洗：将染色后的薄膜取出，依次在第一、第二、第三漂洗液中漂洗，最后用蒸馏水漂洗一遍，使背景完全无色。5.脱色：将漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，剪下各蛋白区带及一小段未着色的空白区作为空白管，分别置于各试管中，向各管中加0.4NNaOH4ml，反复振摇使色泽充分浸出。6.测定光密度：选用波长为520nm的单色光，以空白管调零，测定各管光密度。四.计算血清蛋白正常值:名称清蛋白α1-球蛋白α2-球蛋白β-球蛋白γ-球蛋白正常值（%）57～722～54～96.5～1212～20注：试剂的配制（1）巴比妥缓冲液（PH=8.6，离子强度0.075）：取巴比妥钠15.458克，巴比妥2.768克溶于少量蒸馏水，稀释至1000毫升。（2）丽春红-S：取丽春红-S0.9克，三氯醋酸13.4克，磺柳酸13.4克，蒸馏水加至1000毫升。（3）漂洗液：取乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，蒸馏水50毫升混匀。（4）0.4N氢氧化钠：取氢氧化钠16.0克，蒸馏水加至1000毫升。127 实验十肝组织核酸的分离与鉴定一.实验目的验证核酸的分子组成，掌握核酸部分组分的鉴定方法。二.实验原理组织细胞中的核酸（RNA和DNA）大部分以核蛋白的形式存在，遇酸（三氯醋酸）后核酸和蛋白质均被沉淀下来，弃去上清液。沉淀中的核酸又可溶于热的10％NaCl(生成核酸钠)，而蛋白质不溶，再弃去沉淀，在上清液中加入乙醇使核酸钠以沉淀形式析出。RNA与DNA均可被硫酸水解成：磷酸、有机碱（嘌呤碱和嘧啶碱）及戊糖（核糖或脱氧核糖），这三类化合物可用下述方法鉴定。磷酸与钼酸銨作用生成磷钼酸，后者在氨萘酚磺酸作用下生成蓝色的钼蓝。嘌呤碱与硝酸银产生灰褐色的嘌呤银化合物。核糖经浓硫酸脱水生成糠醛，后者再与地衣酚（3,5-二羟基甲苯）缩合成绿色化合物。脱氧核糖经浓硫酸脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它与二苯胺作用生成蓝色化合物。一.实验方法及步骤1.制备肝匀浆：将1只小白鼠用拉断颈椎的方法处死，剖腹取出全部肝组织，用清水洗净血污，并用滤纸吸干，然后用剪刀剪碎，加0.9％NaCl溶液2ml于研钵中制成匀浆。2.提取核酸：将全部匀浆置于小试管中，加入2％三氯醋酸2ml，用玻棒搅匀，静置3分钟。然后离心（3000r/min）3分钟，弃上清液，于沉淀中加入10％NaCl溶液2ml，充分混匀，置沸水浴中加热8分钟，用玻棒边加热边搅拌（防止玻管底破裂），使之充分生成核酸钠。取出放冷，离心（3000r/min）3分钟。将上清液倒入另一试管内，逐滴加入95％冷乙醇2ml，边加边搅拌，待析出白色沉淀。静置5分钟后，再离心（3000r/min）5分钟，倾去上清液，留沉淀备用。3.水解核酸：在上述沉淀（核酸钠）中加入5％H2SO44ml，用玻璃棒搅匀，在沸水中加热10分钟，即得核酸水解液。4.核酸组分的鉴定：取大试管8支，编号，依次加入下列各试剂：127 管号试剂（滴）12345678核酸水解液20104205%H2SO42010420浓氨水10105%AgNO31010钼酸銨试剂55氨[基]萘酚磺酸20203,5-二羟基甲苯66二苯胺3030摇匀后除3、4两管需放置3分钟后再置于沸水浴加热3分钟外，其它6管直接置于沸水浴5分钟。比较1管与2管、3管与4管、5管与6管、7管与8管颜色的差异，并予以解释。颜色（记录）注：1.单号管为测定管，双号管为对照管2.试剂的配制⑴2％三氯醋酸溶液⑵0.9％NaCl溶液⑶10％NaCl溶液⑷95％乙醇⑸5%H2SO4⑹5%AgNO3⑺钼酸銨试剂：在20ml蒸馏水中溶解2.5g钼酸銨，加5mol/LH2SO430ml，用蒸馏水稀释至100ml。此试剂可在冰箱中保存30天。⑻氨[基]萘酚磺酸：取15％NaSO3溶液195ml（必须透明），加入0.5g纯化的氨[基]萘酚磺酸（纯白色）及20％NaSO3溶液5ml。并在热水浴中搅拌使固体溶解（如不能全部溶解，再加20％NaSO3溶液数滴，但加入量不得超过1ml），置冷处可保存2～3周，如颜色变黄时，要重新配制。氨[基]萘酚磺酸（1,2,4-Aminonaphthal-Sulfonicacid）的纯化方法：在100ml热水（90℃）中溶解15gNaHSO4及1gNa2SO4127 ，加1.5g商品氨[基]萘酚磺酸（暗红色），搅拌使其大部分溶解（仅少量杂质不溶解），趁热过滤，再迅速使滤液冷却。加1ml浓盐酸（12mol/L）有白色氨[基]萘酚磺酸沉淀析出，过滤并用水洗涤固体数次，再用乙醇洗涤，直至纯白色为止，最后用乙醚洗涤，并将固体放置在暗处，使乙醚挥发，将此提纯的氨[基]萘酚磺酸置棕色瓶中保存。⑼二苯胺试剂：取纯化后的二苯胺1g溶于100ml冰醋酸（AR）中，加入2.75ml浓硫酸，混匀。此试剂见光变绿色，应装入棕色瓶置冰箱备用。此试剂须用前临时配制。二苯胺的提纯方法：在70％乙醇中重结晶两次。⑽3,5-二羟甲苯试剂：取比重1.19HCl100ml加入FeCl3·6H2O100mg及纯化后的二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中备用。此试剂亦须用前临时配制。3,5-二羟甲苯的提纯方法：将市售品溶于煮沸的苯中，加少量活性炭脱色，过滤，再加少量己烷重结晶。实验十一核酸的定量分析一.实验目的掌握核酸的简单定量原理及技术。二.实验原理核酸的定量一般是通过测定磷酸（平均含磷量为8.73％）或戊糖来推算出核酸的含量，本实验采用测戊糖方法。组织匀浆先用酸处理将组织中的高分子物质如核酸及蛋白质等沉淀下来，再用热的有机溶剂除去脂类化合物。此时核酸及蛋白质均留在沉淀中，在弱酸性环境中加热则核酸即与蛋白质分开，因核酸溶解而蛋白质仍为沉淀。核糖核酸和脱氧核糖核酸在强酸环境中加热即可水解产生核糖和脱氧核糖，然后分别用3,5-二羟基甲苯法、二苯胺处理法，通过与标准液比色计算出RNA和DNA的含量。三.实验方法及步骤1.取新鲜动物肝组织0.8g，用剪刀剪碎，放乳缽或匀浆器中，并加15％三氯醋酸2ml，研磨成乳糜状后移入一刻度离心管，再用15％三氯醋酸1ml洗乳缽或匀浆器，重复两次，先后三次洗涤液尽可能全部倒入上述离心管（洗涤后的乳缽或匀浆器应无残渣残留），然后离心（3000r/min）3分钟。2.将离心管中的上清液倾弃后，加95％乙醇3～4ml洗涤沉淀，离心，弃去上清液，再加入5ml醇醚混合液（醇∶醚＝3∶1）。127 3.将沉淀与醇醚液混匀后，把离心管置于事先准备好的热水浴中（注意：操作过程应无明火，以免发生事故），待醇醚混合液沸腾3分钟后，取出离心管，冷却，离心，弃去上清液。4.向离心管中加入5％三氯醋酸7ml，用玻璃棒搅动起沉淀，在90℃水浴锅中加热15分钟，取出冷却后再加5％三氯醋酸至10ml刻度处。然后混匀，离心，将上清液（即测定RNA、DNA的样品液）转移至一支干燥的试管中备用。5.RNA定量⑴取干净大试管3支，标号，依次加入下表各种试剂。管号试剂（ml）空白管标准管测定管样品液0.1蒸馏水2.01.9RNA标准液40μg/ml2.03,5-二羟甲苯试剂4.04.04.0⑵各管混匀后，至沸水浴中加热25分钟，冷却后选用670nm的单色光，以空白管调零，测定其它两管的光密度（D）。⑶计算：RNA含量（μg/100mg）＝（Dc测定管/D标准管）×80×（10/0.1）×（0.1/0.8）6.DNA的定量：⑴取干净大试管3支，标号，依次加入下表各种试剂。管号试剂（ml）空白管标准管测定管样品液0.1蒸馏水2.01.9DNA标准液400μg/ml2.0二苯胺试剂4.04.04.0⑵各管混匀后，至沸水浴中加热15分钟，冷却后选用595nm的单色光，以空白管调零，测定其它两管的光密度（D）。⑶计算：RNA含量（μg/100mg）＝（Dc测定管/D标准管）×800×（10/1）×（0.1/0.8）127 注：试剂的配制⑴新鲜鼠肝⑵15％三氯醋酸溶液⑶5％三氯醋酸溶液⑷95％乙醇⑸醇醚混合液：95％乙醇∶乙醚＝3∶1（V∶V）⑹3,5-二羟甲苯试剂：（甲）6％3,5-二羟甲苯无水乙醇溶液。（乙）取FeCl3·6H2O100mg溶于6ml蒸馏水中，再加浓HCl100ml。临用当天取3.5ml（甲）溶液和100ml（乙）溶液混匀。⑺二苯胺试剂：取纯化后的二苯胺1g溶于100ml冰醋酸（AR）中，加入2.75ml浓硫酸，混匀，装入棕色瓶置冰箱备用。⑻标准RNA溶液：称取RNA40mg，加数滴0.1mol/LNaHO使其溶解后，加蒸馏水至100ml，用前稀释10倍即为40μg/mlRNA标准溶液。⑼标准DNA溶液：称取DNA40mg，加数滴0.1mol/LNaHO使其溶解后，加蒸馏水至100ml，即为400μg/mlDNA标准溶液。(市售商品RNA、DNA不纯，配标准液前应用定磷法标定)实验十二温度、pH等对酶促反应速度的影响一.实验目的了解温度、pH、激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。二.实验原理温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下降。人体内大多数酶的最适温度在37℃左右。PH值影响酶促反应速度，是由于酶本身是蛋白质。PH127 不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH值为6.8。凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激动剂。例如Cl-是唾液淀粉酶的激动剂。凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。三.实验方法及步骤制备稀唾液：用清水漱口，含蒸馏水少许行咀嚼动作以刺激唾液分泌。在小漏斗中垫入一块薄薄的脱脂棉，直接将唾液吐入漏斗过滤（应收集混合唾液，以免个别人唾液淀粉酶活性过高或过低，影响实验进行）。取过滤的唾液2ml加蒸馏水18ml混匀备用。（一）温度对酶促反应速度的影响1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.2％淀粉溶液555PH6.8缓冲液1110.3％NaCl溶液1112.混匀后，将1号、2号、3号试管分别置于沸水浴、温水浴（37～40℃）和冰水浴中5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向各试管中加入稀唾液1ml混匀，15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色变化并予以分析。（二）pH对酶促反应速度的影响1.取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）12340.2％淀粉液5555PH4.92缓冲液2PH6.81缓冲液22PH8.67缓冲液20.3％NaCl溶液11112.混匀后，将各管置于温水浴（37～40℃127 ）中保温5分钟，此间振荡之，使温度达到平衡。然后向1、2、3号试管中加入稀唾液1ml，4号试管中加入蒸馏水1ml（作为对照），混匀，立即放回温水浴，继续保温15分钟后取出，并向各试管加碘液1滴，观察颜色并解释结果。（三）激动剂和抑制剂对酶促反应速度的影响1.取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。试管号试剂（ml）1230.2％淀粉液333PH6.81缓冲液111蒸馏水10.3％NaCl溶液10.5％CuSO4溶液1稀唾液1112.混匀后，将各管置于温水浴（37～40℃）中保温15分钟后，取出。冷却后分别加碘液1滴，观察颜色变化并解释结果。注：试剂的配制⑴0.2％淀粉液⑵0.3％NaCl溶液⑶不同pH值缓冲溶液的配制:①1/15mol/LKH2PO4液：称取纯KH2PO49.078g加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。②1/15mol/LNa2HPO4液：称取Na2HPO4·2H2O11.815g，加蒸馏水溶解并稀释成1000ml。上述两液下列比例混合均匀，即可得到不同pH值的缓冲溶液。pH4.926.818.671/15mol/LKH2PO49.95.00.11/15mol/LNa2HPO40.15.00.9⑷0.5％CuSO4溶液⑸蒸馏水实验十三碱性砱酸酶Km数值的测定一.实验目的通过碱性磷酸酶掌握一般酶Km值的测定原理和方法。二.实验原理127 当温度、pH、酶浓度等条件恒定时，酶促反应初速度与底物浓度的关系可用米－曼（Miechaelis-Menten）氏方程式表示，km值是反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度，但由于用v与[S]作图法求Km不方便，所以常用由米－曼氏方程式推导出的林－贝（Lineweaver-Burk）氏方程式，即1/V与1/[S]的直线关系作图，求出Km值。本实验以碱性磷酸酶为例，学习一般的Km测定方法。碱性磷酸酶是一组酶，能水解多种磷酸脂，如磷酸苯二钠、3-磷酸甘油等，其最适pH为10左右。本实验以磷酸苯二钠作为底物，反应式为：C6H5O-PO3Na2+H2OC6H5OH+Na2HPO4反应产生的酚使酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原生成钼蓝及钨蓝，测其吸光度值。以吸光度代表反应速度，用吸光度的倒数与底物浓度的倒数按林-贝氏作图法，在横轴上的截距求Km值。三.实验方法及步骤1.取大试管6支，按下表进行操作。试管号试剂（ml）1234561mol/L磷酸苯二钠00.10.150.20.40.6蒸馏水1.00.90.850.80.60.41mol/L乙醇胺缓冲液0.50.50.50.50.50.5充分混匀，置37℃水浴预热10分钟碱性磷酸酶（37℃预温）*0.50.50.50.50.50.5加酶后立即混匀，置37℃水浴准确保温15分钟酚试剂0.50.50.50.50.50.57.5％Na2CO34.04.04.04.04.04.0充分混匀，置37℃水浴保温20分钟取出，离心（4000转/分）10分钟。取上清液，选用650nm的单色光，用1号管调零，测定其它5管的吸光度A.2.以底物浓度[S]为横轴，各管吸光度值A（代表反应速度V）为纵轴作图，观察曲线形状。并以底物浓度[S]的倒数（1/[S]）为横坐标，吸光度A的倒数（1/A）为纵坐标作图，求出碱性磷酸酶的Km值。注：试剂的配制⑴127 1mol/L磷酸苯二钠：称取127mg磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解并稀释至500ml，加2ml氯仿防腐，置棕色瓶中放冰箱保存，可用一周。⑵1mol/L乙醇胺缓冲液（pH10.1）：称取乙醇胺（NH2CH2CH2OH）61.1g加蒸馏水800ml，0.3ml/L氯化镁1.0ml，5％吐温8020ml，混匀后用浓盐酸校正pH至10.1±0.05,再加水至1000ml。⑶碱性磷酸酶(0.1mg/ml)：取纯化碱性磷酸酶试剂10mg，加pH10乙醇胺缓冲液至100ml。⑷酚试剂：于1500ml圆底烧瓶内加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、蒸馏水700ml、85％磷酸50ml及浓盐酸100ml。装接冷凝器于瓶上，慢慢加热回流10小时。再加Li2SO4·2H2O150g及蒸馏水50ml，必要时过滤。如显绿色，可加溴水数滴使其氧化呈淡黄色。然后煮沸除去过剩的溴，待冷却后稀释至1000ml，此为贮存液，贮于棕色瓶中，使用时加等量蒸馏水稀释之。⑸7.5％Na2CO3：称取无水碳酸钠75g加蒸馏水溶解并稀释至1000ml。⑹蒸馏水实验十四丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制一.实验目的通过实验进一步加深对竞争性抑制作用的理解。二.实验原理琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。在无氧条件下，从琥珀酸脱下的氢可由甲烯蓝（蓝色）接受，甲烯蓝被还原成甲烯白。因此，可从加入的甲烯蓝的褪色情况来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的影响。三.实验方法及步骤1.组织提取液（琥珀酸脱氢酶）的制备：取新鲜肝或肌肉组织5g，剪成小块，放入烧杯内用冰冷的蒸馏水冲洗3次（洗去一些可溶性物质和其它受氢体，以减少对本实验的干扰），再用冷的1/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液清洗1次，倾去所洗的液体。将组织碎块置于研钵加细砂研成匀浆，然后加1/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液15ml,混匀，用双层纱布过滤，滤液即为组织提取液。2.取干净试管6支，标号后按下表操作：试管号试剂（滴）123456组织提取液30303030300.2mol/L琥珀酸101010100.02mol/L琥珀酸1010127 0.2mol/L丙二酸10100.02mol/L丙二酸1010蒸馏水10400.02％甲烯蓝444444记录颜色变化3.将上述各管摇匀，在液面上滴加液体石蜡15滴以隔绝空气，然后用橡皮筋捆起置于37℃水浴中保温10分钟，观察各管甲烯蓝褪色情况，比较哪一管快（记录所需时间）而且比较彻底，并予以解释。注：试剂的配制⑴0.2mol/L琥珀酸⑵0.02mol/L琥珀酸⑶0.2mol/L丙二酸⑷0.02mol/L丙二酸以上四种溶液均先用5mol/LNaOH调节至pH7，再用0.01mol/LNaOH调节至pH7.4。⑸1/15mol/LpH7.4磷酸缓冲液：量取1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO4溶液19.2ml混合即成。⑹0.02％甲烯蓝。⑺液体石蜡。实验十五胡萝卜素的柱层析分离法一.实验目的了解吸附层析的原理，并学会利用此法将胡萝卜素分离的技术。二.实验原理本实验采用柱上吸附层析法从植物中分离胡萝卜素等成分。当某混合物流经吸附柱时，各组分被吸附剂吸附而阻留。由于它们分子结构的差异，被吸附的牢固程度便不相同，此时再用一种溶剂流经吸附柱，则发生与吸附相反的过程，即解吸附。而解吸附程度因吸附有差异而也有所不同，解吸附的溶剂为洗脱剂，此过程称为洗脱。被洗脱的成分随溶剂下流立即又碰上新的吸附剂而被吸附，在整个洗脱过程中发生千千万万次吸附与解吸附。由于混合物中各组分被吸附牢固程度不同，经过洗脱便可将各组分分开。127 吸附剂可用一种，如氧化铝，亦可使用多种，如在同一柱中上层为蔗糖，中间为碳酸钙，底层为氧化铝。洗脱剂同样有采用单一的或混合的，如苯、石油醚与乙醚混合物等。吸附剂及洗脱剂的选择是根据所要分离的组分而定。绿色植物中含有多种色素，如叶绿素a、b、脱镁叶绿素、胡萝卜素等，当用氧化铝作吸附剂及用苯或石油醚作洗脱剂时，胡萝卜素被吸附的能力最小，因此可与其它成分分离。胡萝卜素α、β和γ三种可在层析过程中被分开。三.实验方法及步骤1.制备提取液：取干红辣椒皮2g，剪碎后放入研钵中，加95％乙醇5ml，研磨至深红色，再加石油醚10ml，研磨3～5分钟，用纱布过滤，将滤液置于50ml分液漏斗中，用20ml蒸馏水洗涤数次，以除去滤液中的乙醇，直至水层透明为止，然后将红色石油醚倒入干燥试管中，加少量无水硫酸钠除去水分，用软木塞塞紧以免石油醚挥发。2.制备层析柱：取1×16cm玻璃层析管，在其底部放置少量棉花并压紧，然后用吸管装入石油醚－氧化铝悬液，待氧化铝均匀沉积于管内，并使其达10cm高度，于其上铺一张小滤纸，将层析管垂直夹在铁架上备用。3.层析：当层析柱上端石油醚尚未完全浸入氧化铝时，即用细吸管吸取石油醚提取液1ml，沿管壁加入层析柱上端，待提取液全部进入层析柱时，立即加入含1％丙酮的石油醚冲洗，使吸附在柱上端的的物质逐渐展开成为数条颜色不同的色带。仔细观察色带的位置、宽度及颜色深浅。跑在最前面的是α胡萝卜素，β胡萝卜素紧紧相随，但有时α与β分离不太明显，用试管收集该色带层的石油醚（橙黄色）。随后的色带分别是番茄素、叶黄素、叶绿素。4.鉴定：将盛有橙黄色石油醚的试管置于80℃的水浴中蒸干，滴入三氯化锑氯仿溶液数滴，如可见蓝色反应，即可鉴定此色带层为胡萝卜素。注：试剂的配制⑴95%乙醇⑵石油醚⑶1％丙酮石油醚液（加丙酮可增强洗脱效果，但含量不宜过高，否则洗脱过快色带分离不清）。⑷Al2O3固体（用前需作350～400℃高温处理，以除去水分，提高吸附力）。⑸无水硫酸钠⑹干红辣椒⑺SbCl3氯仿试剂：用少量精馏氯仿洗三氯化锑至不呈乳白色时，在硫酸干燥器中干燥之，再用无水硫酸钠干燥的精馏氯仿制成饱和溶液，密闭保存，严防吸潮。127 实验十六比色分析法及7220型分光光度计的原理和使用比色分析法是生物化学实验中最常用的一种定量分析法。它是利用有色物质溶液的浓度、液层厚度与颜色的深浅三者之间的一定关系完成的定量分析。通常将被测物质通过适当的生色反应定量地转变成有色溶液，被测物质称为测定液。另将一已知量的同种纯物质按同样方法转变成有色溶液，称为标准液。将此二溶液以分光光度计（或比色计）进行比较，即可求得测定液中该物质的含量。一.原理比色分析法及其计算公式均根据Lambert定律和Beer定律。㈠.朗伯（Lambert）定律:一束单色光在通过一有色溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱;若溶液的浓度不变，液层厚度愈大，则光线强度减弱也愈显著。若：I0=光线通过溶液前的强度(入射光强度)I=光线通过溶液后的强度(透过光强度)T=液层的厚度则：K1为常数，随溶液的性质与光的波长而改变。㈡.比耳（Beer）定律:如果液层的厚度不变（即t固定），则溶液的浓度愈大，通过光强度的减弱也愈显著，其关系也可表示如下:（式中C表示溶液浓度）K2亦为常数，与溶液的性质和光的波长有关。Beer定律与Lambert定律不同，并非适用一切溶液，因为有些溶液在浓度改变时，溶质的解离、聚合等程度也会随之改变，而改变液层的厚度是不会影响到溶液本身的性质的。因此，Beer定律只适用于一定浓度的稀溶液。㈢.朗伯─比耳定律:将朗伯和比耳定律合并即得:通常把这个关系式称为朗伯─比耳定律。透过光强度与入射光强度之比（即）称为“透光率”或“透射比”（简称为T127 ）。透光率的负对数（即）称为光密度（简写为D）或“吸光度”（简称为A）。K为常数，称为消光系数。因此朗伯─比耳定律又可写为:。在比色分析法中所用的单色光，实际上是包含一定波长范围的光。单色光愈不纯，其光密度与浓度关系便愈趋向偏离朗伯—比耳定律。为此，分光光度计不用滤色片，而用棱镜分光。在比色分析中，通常在测定未知浓度（C1）样品的同时，同一已知浓度（C2）的标准物作比较，然后分别测出两者的光密度（D1和D2），从朗伯─比耳定律可知:因为测定成分相同，处理也一样，故K值相同，加之比色时用同样的比色杯，所以，测定液与标准液光密度的比值也就等于其浓度的比值。即:或写做如再乘以测定时样品的稀释倍数，即为通常比色法通用计算公式，但此通用计算公式只是在空白管的光密度为"0"的条件下才适用。㈣.标准曲线实际工作中为了简便起见，常常不是每测一个待测样品都做一个标准管，而是事先测定一系列不同浓度标准管的光密度，然后以光密度对标准浓度作图，得一标准曲线，以后在相同的条件下测得待测物质的光密度，便可从标准曲线上查到相应的浓度数值。二.分光光度计的构造无论哪一类分光光度计都配有下列组成部分：光源、单色光器、比色皿、检测器系统以及各部分电源，其组成顺序如下:㈠.光源:127 可见光的连续光谱可由一般的白炽灯泡发出，要求光源发光强度高，光亮均匀、稳定、寿命长。几乎所有可见光分光光度计均采用稳压调控的钨灯。7220型分光光度计的光源是一个寿命较长的溴钨灯。㈡.单色光器：是将混合光分散成单色光的装置。常见的单色光器有采用滤光片的，也有采用棱镜或衍射光栅的，后两者效果较好。它们能在较宽范围内分离出相对纯波长的光线。7220型分光光度计采用的是光栅分光。㈢.比色皿（又称比色杯、吸收杯、样品杯）：比色皿是用于盛装溶液的容器，用无色玻璃制造。它按光经长度区分有0.5cm、1cm、2cm、3cm四种规格。由于比色皿是仪器的主要元件，各皿之间透光能力应该一致，所以在使用时要特别爱护，切不可损坏光面。透光面不能用手摸，若有溶液溢出皿外，只能用滤纸轻轻吸干，再用擦镜纸轻擦。每次用过后须用分析样品的溶剂冲净，切不可用毛刷刷洗。比色皿的定位装置共分四个位置，它的每个位置都可以使相应的比色皿处于光路上。㈣.检测器：分光光度计的检测器包括两部分，即光电元件和读数系统。光电元件可以是硒光电池，也可以是光电管或光电倍增管，其作用是将通过比色皿的光线能量转变成电能。读数系统可以是微电流计，也可以是数字显示。7220型分光光度计采用光电管作为受光器，将光信号转为电信号，经前置放大器放大，信号进入A/D转换器。A/D转换器将模拟信号转换成数字信号送往单片机进行数据处理。操作者将自己要做的事通过键盘输入到单片机中，单片机将各种处理结果通过显示窗口或打印机告诉操作者。三.7220型分光光度计㈠.仪器外观及各部分名称及功能：　　　　　　（正视图）　　　　　　　　　　（背视图）127 1.样品室门2.显示窗3.波长显示窗4.波长调节旋钮5.仪器电源开关6.仪器操作键盘7.样品池拉手8.打印机输出接口9.电源插座7220型分光光度计示意图⒈样品室门：打开门（向后推，即可打开样品室门）可放置样品。⒉显示窗：显示测量数值。在不同的功能方式下，可分别显示透光率、光密度及浓度值和错误显示。⒊波长显示窗：显示当前波长值。⒋波长调节旋钮：用于调节选择适宜的单色光波长，通过波长显示窗观察。⒌仪器电源开关。⒍仪器操作键盘：实现仪器测量及功能转换（后面专题介绍）。⒎样品池拉手：前后拉动可改变四个样品池的位置。⒏打印机输出接口。⒐电源插座。1.工作方式选择键2.调100选择键3.调零选择键4.选标样点5.置数加6.置数减7.确认8.打印仪器操作键盘正面图本仪器操作键盘有八个操作键，七个工作方式指示灯（a,b,c,d与操作键1有关，e,f,g与操作键4有关）。当用户每选用一种工作方式时，该指示灯亮，当进行测量时，每按一次操作键，其对应指示灯点亮一次，点亮时间与按键时间长短一致。八个操作键的功能如下：1.工作方式选择键：可选择四种工作方式，分别是透光率（T%）、光密度（D）、浓度（C）和建曲线。127 2.100％TABS0（调100选择键）：按此键后仪器内单片机对当前样品采样，调整电气系统放大量，并使显示器显示为T=100.0或D=0.000。按下此键后，仪器所有键被封锁，当调整T=100％结束后，显示T=100.0或D=0.000后键释放，此键只在透光率及光密度档起作用。3.0％T（调零选择键）：调零选择键调整仪器零点，显示器显示0.0。(注意:应在全挡光的情况下，调零。此键只在透光率档起作用。)4.选标样点5.置数加6.置数减7.确认8.打印㈡.仪器使用方法:1.使用前，应检查仪器各部件是否正常。2.转动波长选择器（在波长显示窗上观察），选取所需波长。3.打开仪器电源开关，方式选择指示灯应在透光率位置，选标样点应在第一点，预热10分种。4.在样品池中，第一格放置空白杯，第二格放置挡光块，第三、四格放置待测样品杯。随手关好样品室门。5.拉动样品室拉手，使空白杯处于光路中，按调100选择键，待显示100.0时，即表示已调好T=100％。6.再拉动样品室拉手，使挡光块处于光路中，观察显示是否为零，如不为0.0，则按调零选择键使显示为0.0。7.打开样品室门，取出挡光块，换入标准杯，关好样品窗口。8.拉动样品室拉手，再使空白杯处于光路，按工作方式选择键为“测光密度”，此时显示应为0.000（如不为零再按一次调100选择键）。然后将其它比色杯送入光路，从显示窗口中读取相应的光密度值。9.使用完毕，关好电源，关好样品室门，洗净比色杯并空干。㈢.注意事项1.分光光度计属精密仪器，应精心爱护使用，防震、防潮、防腐蚀。2.比色杯的好坏对光密度数影响很大，要保持比色杯的清洁、干净和透明度，更不能因不慎打碎比色杯，影响他人使用。3.比色时间应尽量缩短，以防电光系统疲劳。127 附:应用比色分析法绘制测定无机磷的标准曲线一.原理无机磷可与钼酸结合生成磷钼酸，后者又可被硫酸亚铁还原成钼兰（生色反应）。现以不同量的无机磷分别作上述生色反应，测其光密度，作出无机磷含量与光密度的关系曲线(即标准曲线)，借以熟悉7220型分光光度计的使用方法。二.操作步骤:取试管6只，依下表加入各试剂：选用波长为650nm的单色光，用空白管调“零”，测定1～5管光密度。在坐标纸上，以无机磷的含量为横坐标，以光密度为纵坐标，绘制曲线。注：试剂的配制（1）三氯醋酸-硫酸亚铁试剂：取三氯醋酸50g，硫酸亚铁10.6g，硫脲5g，加蒸馏水溶解并稀释至500ml，保存冰箱中备用。（2）钼酸试剂：取浓硫酸45ml，溶于200ml蒸馏水中待冷，另取钼酸22g溶于200ml蒸馏水中，待溶解后，将两溶液混合，加蒸馏水至500ml。（3）磷标准贮存液（1mg/ml）：称取KH2PO40.4399g，以少量蒸馏水溶解，移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，加氯仿1ml防腐。（4）磷标准应用液（0.04mg/ml）：取贮存液4ml置100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。127 实验十七维生素C的提取与定量（2,4-二硝基苯肼法）一.实验目的掌握维生素C的测定方法。二.实验原理维生素C在体内很不稳定，易被氧化成脱氢维生素C，后者在碱性条件下可继续被氧化成无活性的二酮古洛糖酸。维生素C、脱氢维生素C和二酮古洛糖酸合称为总维生素C。测定时，先将样品中的维生素C氧化成脱氢维生素C。因脱氢维生素C和二酮古洛糖酸都能与2,4-二硝基苯肼作用生成红色的脎，脎的生成量与总维生素C量成正比。于是将脎溶于硫酸，再与同样处理的维生素C标准液比色，即可求出样品中总维生素C的含量。三.实验方法和步骤⒈提取：取小白菜2g（也可用广柑、枣、青椒等代替），置研钵中，加1%草酸10～15ml，研磨5～10分钟，将提取液收集在50ml容量瓶中，如此重复提取2～3次，最后加1%草酸至50ml。⒉氧化、脱色：将提取液约10ml倒入干燥椎形瓶中，加入半匙活性炭充分振摇1分钟后过滤。取约10ml维生素C标准液于另一干燥椎形瓶中，加入半匙活性炭，同样振摇、过滤。⒊显色：取3支大试管，编号，按下表操作。试管号试剂（ml）空白管标准管测定管样品提取液2.5—2.5维生素C标准液（0.01g/L）—2.5—10%硫脲1.01.01.02%2,4-二硝基苯肼—1.01.0混匀，置沸水浴中10分钟，流水冷却2%2,4-二硝基苯肼1.0——85%硫酸3.03.03.0注意：加85%硫酸时，要逐滴慢加，并将试管置于冷水中，边加边摇边冷却。加完后混匀，静置10分钟，选用500nm的单色光，用空白管调零，测定其他两管的光密度。127 四.计算　样品中维生素C含量（mg/dl）=D测定管/D标准管×0.01×2.5×100/[2×(2.5/50)]　　=D测定管/D标准管×25注：试剂的配制(1)白菜（或新鲜广柑、枣、青椒等）(2)1%草酸溶液(3)活性炭：100g活性炭加1mol/LHCl750ml加热回流1小时，过滤，用蒸馏水洗涤数次，至滤液中无Fe3＋为止，然后置110℃烘箱中烘干。(4)维生素C标准贮存液：溶解100mg纯维生素C于100ml1%草酸溶液中。(5)维生素C标准应用液（0.01g/L）：取贮存液1.0ml，用1%草酸溶液稀释至100ml。(6)2%2,4-二硝基苯肼：溶解2,4-二硝基苯肼2g于100ml9N硫酸内，过滤，不用时放入冰箱内，每次用时必须过滤。(7)9N硫酸：谨慎地加250ml浓硫酸（比重1.84）于70ml蒸馏水中，冷却后稀释至1000ml。(8)85%硫酸：谨慎地加90ml浓硫酸（比重1.84）于100ml蒸馏水中。(9)10%硫脲：溶解50g硫脲于1%草酸溶液500ml中。实验十八血中葡萄糖含量的测定（邻甲苯胺法）一.实验目的掌握血糖的测定方法。二.实验原理葡萄糖在热的醋酸溶液中，与邻甲苯胺缩合成雪夫氏碱(Schiffbase)。雪夫氏碱呈兰绿色，其最高吸收峰为620nm波长，颜色深浅与葡萄糖量成正比，和标准液比较求得其量。反应式如下:127 三.实验方法及步骤取试管三支，标号，依下表加入试剂，混匀，置沸水中15分钟，立即移入冷水浴中3-5分钟，选用620nm的单色光，以空白管调零，读取各管光密度。四.计算葡萄糖mg/dl＝×0.1×＝×100正常值:70━100毫克/100毫升（血浆或血清）。五.附注1.本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性物质基本上无影响。127 2.邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。此法显色稳定，24小时内无变化。如将加热时间缩短，生成颜色容易消褪。3.此法也适用于全血葡萄糖测定，特别是小儿病人作静脉抽血困难时，可采用指端血或耳垂血0.1毫升，加入3%三氯醋酸溶液1.9毫升中，以沉淀蛋白质。离心后吸取上清液1.0毫升，加入邻甲苯胺试剂5毫升作为测定管。在标准管中加入葡萄糖标准应用液（0.05mg/ml）1.0毫升及邻甲苯胺试剂5毫升，在空白管中加入蒸馏水1.0毫升及邻甲苯胺试剂5毫升，然后按上表进行测定。测定结果即为全血葡萄糖含量。4.轻度溶血的血清对结果无明显影响。根据推导，血清中含血红蛋白450毫克/100毫升时，可使测定结果降低约10%。5.高脂血的标本最后显色有时会出现浑浊，影响测定结果。可先制备血滤液后再行测定。注：试剂的配制（1）邻甲苯胺试剂：取冰醋酸920毫升，硫脲1.5克，溶解后加入邻甲苯胺80毫升，混匀，再加入饱和硼酸溶液（硼酸6克加水100毫升，放置过夜后过滤备用）42毫升，充分混匀。置于棕色瓶内密闭保存，至少可用两个月。（2）葡萄糖标准贮存液(10mg/ml)：准确称取干燥无水葡萄糖1克，加0.25%苯甲酸液至100毫升，置冰箱内保存备用。（3）葡萄糖标准应用液(1mg/ml)：准确吸取上述贮存液10ml，加0.25%苯甲酸至100毫升。（4）0.25%苯甲酸液：称取苯甲酸2.5克，加入煮沸的蒸馏水1000毫升中，使成饱和液，冷却后，取上清液备用。（5）蒸馏水。实验十九糖酵解一.实验目的了解糖酵解过程，掌握乳酸的测定方法。二.实验原理127 组织中的葡萄糖或糖原在缺氧条件下，受酶体系的催化分解成乳酸的过程称为糖酵解。糖酵解是机体供能的一种重要过程。在供氧充分的情况下，组织内糖酵解的产物能继续分解完全氧化成二氧化碳和水，因此在进行糖酵解实验时，反应体系必须与空气隔绝方可检出乳酸的生成。在体外实验，可用淀粉代替价格昂贵的糖原。糖酵解产生的乳酸，在除去反应体系中的蛋白质及糖后，与硫酸共热即生成乙醛，后者可与对苯基苯酚呈色，然后用光度法测得乳酸的生成量。一.实验方法及步骤1.取干试管2支，标号（1号管即对照管、2号管即酵解管），各加磷酸缓冲液2ml。2.向1号管加蒸馏水2ml，向2号管加0.5％淀粉溶液2ml.3.两管各加入肌肉匀浆0.2ml，混匀后再各加入一层液体石蜡（约2～3mm厚），将1号管立即放在沸水浴中煮沸5分钟，以破坏酶的活性。4.将两管均置于37℃水浴保温1.5小时，然后再移至沸水浴煮沸5分钟。5.向两管各加固体氢氧化钙0.5g及饱和硫酸铜溶液2ml（目的是除去反应体系中的糖类及其它干扰物质）。用玻璃棒充分搅拌，并放置30分钟（在放置期间亦应经常搅动均匀）。6.用滤纸过滤（滤纸和漏斗都应是干的），将滤液收集于两支相同编号的干试管中。7.自每管中各取滤液0.5ml，分别置于两试管中，各加蒸馏水0.5ml。另取一支试管，内加乳酸标准液1ml，作为标准管。向三管中各加入12％硫酸铜溶液0.05ml（1滴），并在冷水浴中冷却3分钟，然后向各管加浓硫酸6ml，混匀。8.将三管置于60℃水浴中保温30分钟，此时乳酸已氧化成乙醛。9.保温后将试管在冷水浴中冷却3分钟，向三管各加对苯基苯酚溶液0.1ml，充分混匀。注意加对苯基苯酚试剂时，必须在接近试管液面处加入，以防对苯基苯酚析出附着在管壁的上方。10.在室温静置20分钟后，于60～70℃水浴中保温3分钟，此时即出现紫色。选用520nm的单色光，以蒸馏水调零，测定三管的吸光度，计算对照管及酵解管中的乳酸含量。注：试剂的配制⑴pH8.0磷酸缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO494.7ml，加0.2mol/LNaH2PO45.3ml，用蒸馏水稀释至200ml。⑵0.5％淀粉溶液⑶液体石蜡⑷氢氧化钙⑸饱和硫酸铜⑹12％硫酸铜溶液⑺浓硫酸127 ⑻乳酸标准溶液（10μm/ml）：精确称取乳酸钙1.211g，溶于蒸馏水，并稀释至1000ml，即为1mg/ml乳酸液；临用前再将此溶液稀释100倍，即为10μm/ml的乳酸标准溶液。浓溶液须置于冰箱内保存。⑼1.5％对苯基苯酚溶液：取对苯基苯酚1.5g，加于10ml5％NaOH溶液中，用少量蒸馏水稀释并不断振摇使其溶解，如溶解不完全可用温水保温，待完全溶解后冷至室温，再稀释至100ml。用棕色瓶保存。⑽肌匀浆：将动物处死后立即取下肌肉，用台秤称取重量，然后按每克肌肉加3ml生理盐水的比例用匀浆器制成匀浆。实验二十肝糖原的提取与鉴定一.实验目的掌握糖原的测定原理及方法。二.实验原理正常肝糖原的含量约占肝中重的5％。许多因素可影响肝糖原的含量，如饱食、饥饿、糖皮质激素及肾上腺素等。糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使后者进一步脱水生成糖醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛。此化合物再和蒽酮作用生成蓝色化合物，用同法处理的标准葡萄糖溶液比色，即可推算出糖原含量。糖原在浓硷溶液中非常稳定，故在显色之前肝组织先放在浓硷中加热，破坏其它成分，而保留肝糖原。三.实验方法及步骤1.糖原的提取：取体重在25g以上的健康小白鼠1只，断头处死，剖腹取出肝脏，用生理盐水冲洗后，再用滤纸吸干水分，准确称取肝组织0.5g，放入盛有30％KOH溶液1.5ml的试管中，置沸水浴煮20分钟（肝组织必须全部溶解，否则影响比色），取出后冷却，将试管内容物全部移入100ml的容量瓶（用蒸馏水多次洗涤试管，一并收入容量瓶内），加蒸馏水至刻度，仔细混匀。2.糖原的测定：取干净试管3支，编号后按下表操作：试管号试剂（ml）1（空白管）2（标准管）3（测定管）糖原提取液0.5葡萄糖标准液（0.05mg/ml）2.0127 蒸馏水2.01.50.05％蒽酮试剂4.04.04.0混匀，置沸水浴中10分钟，冷却后选用620nm的单色光，用空白管调零，测定2、3管的吸光度。3.计算：此法测定值宜在肝糖原含量为1.5～9％之间。若肝糖原小于1％时，由于蛋白质的干扰测定结果不准确，须改用间接法测定，即在肝组织消化后用95％乙醇沉淀肝糖原（1∶1.25），离心分离，用蒸馏水2ml溶解肝糖原，再按上表操作。公式中的1.11为此法测得葡萄糖含量换算成糖原含量的常数，系100μg葡萄糖用蒽酮试剂显色相当于111μg糖原用蒽酮试剂所显之色。注：试剂的配制⑴生理盐水（0.9％NaCl溶液）⑵30％KOH⑶葡萄糖标准液（0.05mg/ml）⑷0.05%蒽酮试剂：取重结晶蒽酮0.05g及硫脲1g，溶于66％硫酸100ml中，加热溶解，置棕色瓶中，放冰箱中可保存两周。蒽酮的重结晶方法：市售蒽酮6g溶于300ml无水乙醇中，加热至完全溶解，加蒸馏水直到不再析出结晶为止，放入冰箱过夜，抽滤得淡黄色结晶，置棕色瓶内，放入干燥器备用。实验二十一血清总胆固醇的测定（硫磷铁法）一.实验目的掌握血清总胆固醇的测定方法。二.实验原理127 用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与硫磷铁试剂作用，产生颜色反应，其呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中总胆固醇含量。三.实验方法及步骤1.取离心管一支，准确加入血清0.1ml，再向管底加入无水乙醇4.9ml。用玻璃纸堵住管口，用力振摇15秒钟，室温放置15分钟，再振摇混匀，然后离心5分钟（2000转/分），取上清液备用。2.取干燥试管三支，编号，分别在测定管内加入上述乙醇提取液3ml，标准管内加入胆固醇标准应用液3ml，空白管内加入无水乙醇3ml。3.各管中分别加硫磷铁试剂3ml，须沿管壁缓缓加入，与乙醇液分成两层，立即迅速振摇20次，放置10分钟（冷却至室温），于520nm进行比色，以空白管调零，读取各管光密度。四.结果计算:五.附注:1.颜色反应与加硫磷铁试剂混合时的产热程度有关，因此，所用试管口径及厚度要一致，加硫磷铁试剂时必须与乙磷分成两层，然后混合，不能边加边摇，否则显色不完全，硫磷铁试剂要加一管混合一管，混合的手法、程度也要一致。2.所用试管和比色杯必须干燥，浓硫酸的质量很重要，放置日久，往往由于吸收水分而使颜色反应降低。3.空白管应接近无色，如代橙黄色，表示乙醇不纯，应做去醛处理。4.人血清总胆固醇正常含量为130━250mg%。注：试剂的配制（1）无水乙醇（A.R）（2）2%FeCl3贮存液：称取三氯化铁（FeCl3·6H2O）2g，经研碎溶于100ml浓磷酸内，一天后即可完全溶解，再放于暗处，至少可用一年。（3）硫磷铁试剂：取上述2%FeCl38ml，放入100ml容量瓶内，加浓硫酸至刻度，混合，放置暗处，约可使用2月。如出现沉淀，则应重新配制。（4）胆固醇标准贮存液(3mg/ml):精确称取重结晶、干燥的胆固醇300mg，溶于无水乙醇中至100毫升。（5）胆固醇标准应用液(30μg/ml):取上液用无水乙醇稀释100倍。127 实验二十二肝的生酮作用一.实验目的加深对肝脏生成酮体的认识。二.实验原理以丁酸作为底物与肝组织匀浆（内含合成酮体的酶系）保温后，即有酮体生成，酮体与显色粉（亚硝基铁氰化钠）反应产生紫红色物质；而经同样处理的肌肉匀浆则不产生酮体，故无显色反应。三.实验方法及步骤1.肝匀浆和肌匀浆的制备：取小鼠1支，断头处死，迅速剖腹取出全部肝脏和部分肌肉组织，称重后用剪刀剪碎，分别置入研钵中，加入生理盐水（重量/体积＝1∶3）和少许细砂，研磨成匀浆。2.取试管2支，编号，按下表操作：管号试剂（滴）12罗氏溶液15150.5mol/L丁酸溶液30301/15mol/L磷酸缓冲液1515肝匀浆20肌匀浆20置于37℃水浴保温50分钟15％三氯醋酸2020将1号和2号试管分别摇匀混和5分钟后，再离心（3000r/min）5分钟，取上清液分别转移至相同编号的试管内备用。3.另取试管4支，编号，按下表操作：管号试剂（滴）1234上清液（1）20上清液（2）200.5mol/L丁酸溶液20酮体溶液204.各管加显色粉1小匙（绿豆粒大），观察各管颜色反应，并予以解释。注：试剂的配制⑴生理盐水⑵罗氏溶液：NaCl0.9gKCl0.042gCaCl20.024gNaHCO3127 0.02g葡萄糖，溶解后加蒸馏水至100ml。⑶0.5mol/L丁酸：取44.0g丁酸溶于0.1mol/LNaOH溶液中，并用0.1mol/LNaOH溶液稀释至1000ml。⑷1/15mol/L磷酸缓冲液（pH7.6）⑸15%三氯醋酸⑹酮体溶液⑺显色粉：亚硝基铁氰化钠1g、无水碳酸钠30g、硫酸銨50g，混合后研碎。实验二十三薄膜层析法分离血清脂类一.实验目的掌握脂类薄层层析法的具体操作，了解薄层层析在脂类成分分析及脂代谢研究中的用途。二.实验原理脂类物质可用薄层层析法、纸层析法、柱层析法及气液层析法等分离鉴定。薄层层析法因其设备简单易行并且分辨率较高而常被应用。本实验以硅胶G为支持物制成薄层观察血清脂类的薄层层析。本实验用于脂类的显色剂由过氯酸与磷钼酸等组成。层析展开后喷以显色剂，其中过氯酸使脂类物质中的不饱和键氧化断裂生成醛类物质，然后醛类使磷钼酸还原生成钼蓝而显色。三.实验方法及步骤1.层析薄板的制作（铺板）：称取硅胶G1.5g置研钵中加入蒸馏水5ml，充分研匀至光泽洁白呈凝胶状时，迅速将其倾倒在干燥清洁的6×15cm玻片上（如有油渍可用95％的乙醇擦净），轻轻晃动玻片使其分布均匀，然后置于水平桌面风干1～2小时。当薄膜凝固且表面无水渍后置烘箱中，让温度升到105℃保持1小时，关闭电源，待温度降至接近室温时，取出放入干燥器备用。2.点样：分别用毛细玻管吸取各种脂类的标准液及试样在硅胶薄板的一端约距边缘1.5cm处取1cm间距点样，记录各样本在薄板上的排列位置。127 3.展层：待点样的溶剂挥发后，将玻板放入预先饱和的展层标本缸内，让点样一端浸入展开剂中，其深度约为0.5cm（切忌样品点浸入展开剂中），当展开剂上升到距玻板的另一端0.5～1.0cm时，停止展层，取出玻板并立即划下展开剂的前缘，任展开剂大部分挥发后置烘箱烘干。4.显色：喷以磷钼酸显色剂，放置片刻则见色斑显出。比较试样及各种脂类标准液的位置，作图记录后并予以分析。注：试剂的配制⑴硅胶G（即含有10～15％煅石膏和5％淀粉的硅酸凝胶）⑵展开剂：由石油醚（沸点在60～90℃之间）、丁酮、乙酸组成，比例为95∶4∶1（体积）。⑶油酸甘油三酯标准液（1mg/ml的氯仿溶液）⑷卵磷脂标准液（1mg/ml的氯仿溶液）⑸胆固醇标准液（1mg/ml的氯仿溶液）⑹试样：鸡蛋黄的氯仿提取液。⑺显色剂：磷钼酸5g溶于70ml蒸馏水与25ml95％乙醇，添加70％过氯酸5ml，混匀，室温中保存。实验二十四血清甘油三酯的测定（异丙醇抽提，乙酰丙酮显色法）一.实验目的了解异丙醇抽提、乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯的原理，掌握测定血清甘油三酯的方法。二.实验原理用异丙醇抽提血清中的甘油三酯，再以氧化铝吸附磷脂，经皂化后释放出的甘油用过碘酸钠氧化生成甲醛，甲醛与乙酰丙酮在有銨离子存在下生成黄色的3,5-二乙酰-1,4-双氢二甲基吡啶。再与同样处理的标准管比色计算出含量。一.实验方法及步骤1.取血清0.2ml加入有塞磨口试管中，向管底部吹入异丙醇4.8ml，冲散血清使蛋白沉淀很细，加塞混合后置60℃水浴2分钟。然后加入氧化铝1g，加塞，快速振摇2分钟。离心（3000r/min5分钟），上清液即为抽提液。2.取试管3支，标号后按下表操作：127 管号试剂（ml）1(空白管)2（标准管）3（测定管）抽提液1.0甘油三酯标准液1.0异丙醇1.050g/LKOH溶液0.10.10.1混匀后，放入60℃水浴中保温10分钟氧化剂0.50.50.5显色剂0.25.250.25混匀后，置60℃水浴中保温20分钟1.取出试管冷却后，选用420nm的单色光，用空白管调零，测定其它两管的吸光度。四.结果计算:注：试剂的配制⑴异丙醇⑵氧化铝（中性、层析用）：用蒸馏水反复洗去不易下沉的细颗粒，置100～110℃烘箱中过夜，贮存于干燥器内。⑶50g/LKOH溶液⑷氧化剂：取过碘酸钠325mg，溶于蒸馏水250ml中，然后加入无水醋酸銨38.5g，使其溶解。再加冰醋酸30ml，加蒸馏水至500ml，混匀，保存于棕色瓶中。⑸显色剂：乙酰丙酮0.75ml，异丙醇20ml，用蒸馏水稀释至100ml，贮存于棕色瓶中。⑹甘油三酯标准液：A贮存液（4mg/ml）：精确称取三油酸甘油酯400mg，用异丙醇溶解并稀释至100ml，混匀，冰箱保存。B应用液（0.08mg/ml）：取贮存液2ml，用异丙醇稀释至100ml，混匀，冰箱保存。127 实验二十五氨基移换作用一.实验目的验证氨基移换作用，熟悉纸层析操作方法。二.实验原理氨基移换作用在动植物的各组织中广泛进行。由于该作用使某些氨基酸得以合成或脱去氨基。在机体内，氨基移换作用是在氨基移换酶（即转氨酶）的催化下进行的，这类酶在弱硷性环境中活性较强。本实验是以肌匀浆提取液中所含的谷丙转氨酶，催化谷氨酸与丙酮酸所进行的反应作为观察对象。为了防止丙酮酸被肌匀浆提取液中其它酶氧化分解，用溴代乙酸加以保护。反应生成的丙氨酸用纸层析法检出。三.实验方法及步骤1.肌匀浆提取液的制备：取新鲜大鼠肌肉10g加入生理盐水30ml,放少许细砂研磨成细浆，用双层纱布过滤后即得肌匀浆提取液。2.取试管2支，编号（1号和2号），各加入肌匀浆提取液0.5ml，其中一管(1号)煮沸2～3分钟，另一管（2号）不作处理。然后再向两管各加入1％谷氨酸溶液10滴、1％丙酮酸溶液10滴、0.1％碳酸氢钾溶液10滴和0.025％溴代乙酸5滴，混匀。3.将此两试管同时置40℃水浴，保温1～1.5小时，并经常振荡之。保温结束后取出试管，各加2％醋酸4滴，并加热至蛋白质全部沉出。4.将各管内容物分别过滤到干净的相同标号的试管内，作为纸层析点样时的样品。5.向层析缸中装入水饱和的酚溶液（其高度约1.5cm）。6.洗净手后，用竹镊子取4.5×18cm层析用的滤纸一张(手指不可接触纸面)，在距滤纸一端2cm处用铅笔划一水平线（原线），在此线上再画出四个等距离的直径为3mm的小圆圈，并标明号码。7.用四支毛细玻璃管分别蘸取1号滤液、2号滤液、谷氨酸溶液、丙氨酸溶液，点在以上四个小圆圈内（勿使溶液扩散到圈外），并作记录。待干燥后，可重复点3次。8.再干燥后，将此滤纸条插入上述准备好的层析缸中。先将滤纸条悬挂于玻璃缸内的横玻棒上（或用棉线代替），调节其高度，使滤纸的下端浸入酚溶液内约1cm（勿使点有样品的小圆圈与溶液直接接触），然后将层析缸的盖子盖紧。127 9.经1.5～2小时，当溶剂上升至10～15cm高时，取出滤纸，用铅笔在溶剂到达的前缘处划线作记号。把滤纸条置干燥箱中烘干（或用电吹风吹干），使酚蒸发至滤纸上无酚味为止。10.用喷雾器喷上茚三酮酒精溶液（注意喷匀），再将滤纸置于干燥箱中烘干。这时在滤纸的的不同位置即可见到紫红色斑点出现。11.计算各斑点的Rf值，判断1号及2号样品液中分离得到的是何种氨基酸。注：试剂的配制⑴生理盐水（0.9％NaCl溶液）⑵1％谷氨酸溶液（用KOH中和）⑶1％丙酮酸溶液（用KOH中和）⑷1％丙氨酸溶液（用KOH中和）⑸0.1％KHCO3溶液⑹0.025％溴代乙酸溶液（用KOH中和）⑺2％醋酸溶液⑻用水饱和的酚溶液：取重蒸馏酚50g（隔水熔化，量取50ml）与25ml水，在分液漏斗中充分混匀，于暗处放置过夜（7～10小时），分成两层，收集下层清液放入棕色瓶中保存。注意：在重蒸馏和移取酚时，务必防止溅在皮肤上，若溅在皮肤上立即用70％酒精擦洗，以免腐蚀皮肤。⑼0.1％茚三酮乙醇溶液实验二十六血清谷丙转氨酶的测定一.实验目的掌握血清谷丙转氨酶的测定方法。二.实验原理血清谷丙转氨酶（S、G、P、T）作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，结果生成谷氨酸与丙酮酸。丙酮酸与2.4-二硝基苯肼作用，生成二硝基苯腙，此物在碱性溶液呈红棕色，与经同样处理的标准丙酮酸比色，求得丙酮酸的生成量以表示酶的活性。127 三.实验方法及步骤取15×150mm中试管4支，标号，按下表操作:静止10分钟后，选用520nm的单色光，以蒸馏水调零，测定各管光密度。四.计算本法所规定的谷丙转氨酶活性单位的定义是：1ml血清于37℃与底物作用30分钟，产生2.5μg丙酮酸为一个谷丙转氨酶活性单位。127 正常值：2～40单位/ml血清。五.附注1.2.4-二硝基苯肼与丙酮酸的颜色反并不是特异性的，α-酮戌二酸也能与2.4-二硝基苯肼作用而显色。此外，2.4-二硝基苯肼身也有类似的颜色，因此空白管颜色较深，吸光度常在0.18左右。1.可用小白鼠肝匀浆（20倍稀释）代替血清进行实验。3.肝匀浆的制备:用右手抓住小白鼠的尾巴，令其头朝下，然后迅速置桌上，立即用左手按住鼠的颈子，右手猛拉老鼠尾巴，使颈椎卡断死亡。将肝脏取出，放在滤纸上，用天平称重，放在研钵中，生理盐水5ml研磨，然后再加生理盐水，配成1:19（即20倍稀释）的肝匀浆，用双层纱布过滤，收集滤液备用，此液每ml含G.P.T200单位。注：试剂的配制（1）M/10磷酸盐缓冲液（PH=7.4）：取磷酸二氢钾2.69g，磷酸氢二钾13.97g加水溶解后移至100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，贮于冰箱中备用。（2）底物液（基质液）：取DL-丙氨酸1.79g，α-酮戌二酸29.2mg，先溶于约50ml磷酸缓冲液中，然后以1NNaOH校至PH=7.4，再以磷酸盐缓冲液稀释到100ml，加氯仿数滴防腐，贮存冰箱中一般可用一个月（不生混浊，不生霉即可用）。（3）丙酮酸标准液（100μg/ml）：准确称取已干燥至衡重的丙酮酸12.64mg，置于100ml容量瓶中，以PH=7.4的磷酸缓冲液稀释到刻度。此液必须临用前配制，不能存放。（4）2.4-二硝基苯肼液（0.02%）：称取2.4-二硝基苯肼20mg，溶于10NHCl10ml中（或4NHCl125ml中），溶解后再加蒸馏水至100ml。127 实验二十七血浆二氧化碳结合力的测定（中和滴定法）一.实验目的掌握二氧化碳结合力的测定方法。二.实验原理血浆中的NaHCO3与加入的过量盐酸反应，生成碳酸，经振荡除去CO2，再用标准氢氧钠滴定（中和）剩余的盐酸（以酚红或酚红兰作指示剂），可根据氢氧化钠的消耗量，计算出NaHCO3的含量。再根据每摩尔任何气体在标准状况下体积为22.4升的规律，推算出血浆二氧化碳结合力的容积量。└─→(剩余量)三.实验方法及步骤取二支清洁、干燥的中试管，标上“测定”和“空白”，按下表进行操作：试管号试剂（ml）空白管测定管血浆－0.10.01mol/LHCl0.50.5充分振荡(3～5分钟),尽量使CO2全部逸出酚红美兰指示剂（滴）110.9NaCl溶液1.51.4混匀消耗0.01mol/LNaHO体积A＝mlB＝ml充分振荡，尽量使CO2气体全部逸出，用0.01mol/LNaOH液先滴定空白管，使颜色由绿→灰兰色→微紫兰色（三秒钟不变色，即为滴定终点）。若呈亮紫色，则为过量。记住终点颜色所消耗碱液体积(A)。再用0.01mol/LNaOH液滴定测定管至同样颜色，记下消耗碱液体积(B)。四.计算127 二氧化碳结合力(ml/dl)＝（A－B）×0.244×＝（A－B）×224五.附注1.0.224的来源：从原理的反应式可知，1mol/L盐酸溶液1000ml在上述反应中可释出1molCO2（标准状况下为22.4L）。0.01mol/L盐酸溶液1000ml，可释出CO2224ml。0.01mol/L盐酸溶液1ml，可释出CO20.224ml。2.正常人CO2结合力为：50-70ml/dl。3.所用试剂应用无CO2蒸馏水配制，并保持新鲜，不宜使用过长。4.酚红美兰指示剂，最好在临用前混合。注：试剂的配制（1）0.9NaCl溶液。（2）0.01mol/LHCl溶液。（3）0.01mol/LNaOH溶液。（4）酚红美兰指示剂:①0.1%酚红液:称取酚红0.1g，加0.05mol/LNaOH液7.5ml于研钵中研磨溶解，再加无水乙醇至100ml。②0.1%美兰液:称取0.1g美兰，加入无CO2蒸馏水于研钵中研磨溶解，再加入该蒸馏水至100ml。应用时，取①液2份，②液1份混合即可，临用时混合，以免失效。实验二十八维生素C的定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）一.实验目的1.学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。2.了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。二.实验原理维生素c是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸(ascorbicacid)。它对物质代谢的调节具有重要的作用．近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有对化学致癌物的阻断作用。127 维生素C是具有L系糖构型的不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，植物的绿色部分及许多水果(如橘子、苹果、葡萄、山楂等)、蔬菜(黄瓜、洋白菜、西红柿等)中的含量更为丰富。维生素C具有很强的还原性。它可分为还原型和脱氢型。金属铜和酶(抗坏血酸氧化酶)可以催化维生素C氧化为脱氢型。根据它具有的还原性质可测定其含量。还原型抗坏血酸能还原染料2，6—二氯酚靛酚（Dichlorophenolindopheno1一DCPIP)．本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2，6—二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此．当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色转变成微红色时即表示溶液中的维生索C刚刚全部被氧化此时即为滴定终点。如无其他杂质干扰．样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原型抗坏血酸量成正比。本法用于测定还原型抗坏血酸，总抗坏血酸的量常用2，4—二硝基苯肼法和荧光分光光度法测定．三.实验方法及步骤一、提取水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果．用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取50－100加入等体积2％草酸，置组织捣碎机中打成浆状，滤纸过滤，滤液备用。滤饼可用少量2％草酸洗几次，合并滤液，记录滤液总体积。127 一、标准液滴定准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mL(含0.1mg抗坏血酸)置100mL维形瓶中，加9mL1％草酸，用微量滴定管以0.1％2，6—二氯酚靛酚滴定至谈红色，并保持15s不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸(取10mLl％草酸作空白对照，按以上方法滴定)。三、样品滴定准确吸取滤液两份，每份10.0mL分别放人2个100mL锥形瓶内，滴定方法同前。另取10mLl％草酸作空白对照滴定。四.计算五.附注试剂和器材一、材料苹果、洋白菜等。二、试剂1．2％草酸溶液草酸2g溶于100mL蒸馏水中。2．1％草酸溶液草酸1g溶于100mL蒸馏水中。3．标准抗坏血酸溶液准确称取10mg纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用)溶于1％草酸溶液中，并稀释至I00mL贮于棕色瓶中，冷藏．最好临用前配制。4．0.1％2，6—二氯酚靛酚溶液250mg2，6—二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后加水稀释至250mL，滤去不溶物，贮于棕色瓶中冷藏(4℃)约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。三、器材127 锥形瓶(100mL)，组织捣碎器，吸量管(10mL)，漏斗，滤纸，微量滴定管（5mL），容量瓶（100mL，250mL）注意事项(1)某些水果、蔬菜(如橘子、西红柿)浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。(2)整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时酌情增减样液用量或改变提取液稀释度。(3)本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下干扰物质反应进行很慢。(4)2％草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1％草酸无此作用。(5)干扰滴定因素有：●若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加lmL氯仿，到达终点时．氯仿层呈现淡红色。●亚铁离子可还原二氯酚靛酚，对含大量亚铁离子的样品可用8％乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时亚铁离子不会很快与染料起作用。●样品中可能有其他杂质还原二氰酚锭酚，但反应速度均较抗坏血酸慢．因而滴定开始时染料要迅速加人，而后尽可能一滴一滴地加人，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内不消退为终点。(6)提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清液进行滴定。维生素C标定法。为了准确知道标准维生素C含量，须经标定，方法如下：1.将标准维生素C溶液稀释为0.02mg/mL.2.量取上述标准维生素C溶液5mL于锥形瓶中，加入6％碘化钾溶液0.5mL，1％淀粉液3滴，再以0.001mol/L碘酸钾标准液滴定，终点为蓝色。抗坏血酸浓度（mg/mL）=(V1x0.088)/V2式中：V1――滴定时所消耗0.001mol/L碘酸钾标准液的量（mL）；V2――滴定时所取抗坏血酸的量（mL）；0.088――1mL0.001mol/L碘酸钾标准液相对于抗坏血酸的量（mg）。六.思考题1.为了测得准确的维生素C含量，实验过程中应注意哪些操作步骤？为什么、2.试简述维生素C的生理意义。实验二十九127 脂类组成对脂类单分子层通透性的影响一.实验目的1.学习制作脂类单分子层和鉴定它的通透性的原理和方法。2.比较不同脂类所形成的脂类单分子层通透性的差异。二.实验原理细胞膜主要是脂类(绝大多数是磷脂)和蛋白质组成。脂类都是由具有一个亲水的头部和两个疏水的尾部(脂肪酸的烃链)的分子组成，头尾衔接处是甘油基团。这种一头亲水一头疏水的分子称为双亲媒性分子。本实验以脂类单分子层作为模式膜，用甲烯蓝为指示剂．观察不同脂类对脂类单分子层通透性的影响。首先利用正丁酵和水形成清楚的两相。溶解于正丁醇中的双亲媒性脂类则移到界面处．其亲水部分伸到水相．而疏水部分仍在有机相内，于是便排列形成了脂类单分子层。甲烯蓝是有色的高分子，肉眼可以直接观察到它通过两相界面处脂类单分子层的情况。这个模式膜不含有蛋白质，因而不同子生物膜，但是通过它可以了解到被动扩散作用与膜的脂类组分的关系。三.实验方法及步骤取7支刻度试管，各加人5mL蒸馏水，再分别加入5mL含有不同脂类和甲烯蓝的正丁醇溶液。在向各试管加人有机相溶剂时，应先将试管倾斜，再用小滴管小心地沿管壁慢馒加人，以便形成清楚的两相。将试管轻轻竖直后，在室温下静置1—2h。对照管加入不含脂类的甲烯蓝正丁醇溶液。观察各管内水相颜色的变化。吸出各管的水相溶液，测定它们在660nm波长处的光吸收值。并以对照管的光吸收值为100％计算各管的相对百分数。根据实验结果，比较各种脂类对于各自的单分于层通透性的影响，说明被动扩散作用与膜内脂类组分的关系。四.附注试剂和器材一、试剂甲烯蓝的正丁醇溶液(0.25g／L)，并用此液作为溶剂，配制4％硬脂酸溶液，4％油酸溶液，2％甘油三油酸酯溶液，4％甘油三棕榈酸酯溶液，4％卵磷脂溶掖，4％胆固醇溶液。二、器材刻度试管，试管架，滴管，吸量管（5mL），722型分光光度计。五.思考题127 1．试述生物废的基本结构和功能。2．解释下列名词：双亲媒性分子，脂类单分子层，磷脂双分子层，膜的内在蛋白质和膜的外周蛋白质。实验三十粘多糖—肝素钠效价的测定一.实验目的1.了解粘多糖的化学性质。2.学习测定肝素钠效价的原理和方法。二.实验原理肝素(heparin)是一种粘多糖(mucopolysaccharide)。在其多糖链上带有许多阴离子基团，如磺酸基、羧基等．而使肝素具有强的负电荷性，能与阳离子或带正电荷的分子结合生成复合物；肝素同钠离子结合即生成肝素钠。肝素具有抗血凝功能其效价测定方法有两种：生物核定法和天青A(AzurA)比色法。本实验采用后一方法。利用碱性染料天青A的正电荷与肝素磺酸基、羧基负电荷结合，生成“肝素一天青”复合物．使得天青A产生与原来染料不同的颜色反应。在低浓度，波长505nm和pH8.6条件下，肝素浓度与光吸收值之间将合Lambert-beer定律。天青A比色法简单，易掌握，重复性强，适用于粗制品的快速鉴定。三.实验方法及步骤一、制备标准曲线取12支15rnL的试管，编号后，按下表配比依次加样并做平行管。127 加完样品、试剂后立即摇匀，于722型分光光度计上测定A值，以0号管做空白对照。以肝素效价单位作横坐标，A值作纵坐标，绘制标准曲线。一、样品测定精确称取10－15mg待测样品，先用蒸馏水溶解成样品液，浓度为1mg／mL。再取上述溶液2.5mL，加到250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，即配成1mg/mL的测定液。吸取0.2－1.2rnL测定液，加水补足至2rnl，再依次加巴比妥缓冲液2rnL，天青A0.5rnL，摇匀后置722型分光光度计上测定波长505nm处的A值，从标准曲线上查到肝素的效价，按下式计算样品的效价。式中，Pi＝测定样品的A值在标准曲线上查出的单位数，V＝测定样品总容积(rnL),Vi=测定时所用的测样液容积(mL)，Sw＝待测样品称取量(mg)。四.附注试剂和器材一、试剂1．巴比妥钠缓冲液称取4.12巴比妥钠，加蒸馏水到500mL，再加19mL0.2mol/L盐酸，混匀后pH应为8.6。如pH偏高或偏低，可用盐酸或氢氧化钠调整到pH8.6。将缓冲液保存在冰箱中待用。2．肝素标准液127 准确称取一定量的肝素标难品(药捡所供给)，用蒸馏水配制成100单位/mL，保存在冰箱中。测定时，取2.5mL稀释到250mL,成为1单位/mL。3．天育A溶液称取0.5g天青A(生物染料，上海新午化工厂)，先用少量蒸馏水使其完全溶解，再用水稀释到500mL。经过滤后，置于冰箱中保存。临用前取5mL，用蒸馏水稀释到25mL，温匀，供测定用。二、器材722型分光光度计，分析天平(感量万分之一)，pH计（或精密pH试纸)，容量瓶(500rnLx2,250rnLx1,25rnLx1)，移液管(1mLx2，2mLx2),坐标纸，试管(20mLx20)。注意事项(1)精制过程中，失去抗凝血功能的肝素仍保留使天青A变色的活性，为此，必须对出厂肝素精制品进行生物活性鉴定。(2)肝素钠吸湿性很强．最好应用称量瓶减重法称取。(3)天青A含80％天青A和少量天青B。天青A的纯度对比色影响很大，应选用上海新中化工厂生产的天青A较为合适，而且一定要过滤后，方可使用。(4)用天青A测定过的比色杯应注意洗净．每次用完后应用乙醇洗去染料残留物，再用水、蒸馏水冲洗干净，备下次使用。使用天青A较久的比色杯，应用乙酪—盐酸(10:1)洗净。五.思考题1.天青A比色法测定肝素钠效价的原理时什么？此法同生物测定法比较有何缺点？2.在测定过程中应注意哪些因素的干扰？实验三十一细胞色素C的制备和测定一.实验目的1.通过细脑色素c的制备，了解制备蛋白质制品的一般原理和步骤。2.掌握制备细胞色素c的操作技术及含量测定方法。二.实验原理细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。它广泛存在于各种动物、植物组127 织和微生物中。细胞色京素是呼吸链中极重要的电子传递体，细脑色素C（CytochromeC)只是细胞色素的一种。它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。细胞色素C为食铁卟啉叶琳的结合蛋白质，分子量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸贱基组成。它溶于水．在酸性溶液中溶解度更大，放可自酸性水中提取，制品可分为氧化型和还原型两种．前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素c对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。本实验以新鲜猪心为材料．经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱和沉淀等步骤制备细胞色素c，并测定其含量。三.实验方法及步骤一、材料处理新鲜或冰冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放人纹肉机中绞碎。二、提取称取心肌碎肉150g放入1000mL烧杯中，加蒸馏水300mL．用电动搅拌器搅拌，加人2mol/L硫酸，调pH至4.0（此时溶液呈暗紫色)，在室温下搅拌提取2h。用1mol／L氨水调pH至6.0，停止搅拌。用数层纱布压挤过滤，收集滤液，滤液加入750mL蒸馏水．按上述条件重复提取1h，两次提取液合并(为减少学时，可只提取一次)。三、中和用1mol／L氨水将上述提取掖调pH至7.2，静置适当时间后过滤，所得红色滤液通过人造沸石柱吸附。四、吸附人造沸石容易吸附细胞色素C，吸附后能被25％硫酸铵溶液洗脱下来，利用此特性将细胞色素c与其他杂蛋白分开。具体操作如下：称取人造沸石11g，放人烧杯中，加水后搅动．用倾泻法除去12s内不下沉的细颗粒。剪裁大小合适的一块圆形泡沫塑料，安装入于净的玻璃枝底部，将柱架至垂直，柱下端连接乳胶管，用夹子夹住，向柱内加蒸馏水至2/3体积，然后将预处理好的人造沸石装填人柱，避免柱内出现气泡．装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。将中和好的澄清滤液装人下口瓶．使之措枝壁轻暖流入柱内，进行吸附，流出液的速度约为10mL／min。随着细胞色素C的被吸附，人造沸石逐渐由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。五、洗脱127 吸附完毕，将红色人造沸石自柱内取出，放人烧杯中．先用自来水，后用蒸馏水洗涤至水清，再用100mL0.2％NaCI溶液分3次洗涤沸石．再用蒸馏水洗至水清，重新装柱，也可在柱内．用同样方法洗涤沸石．然后用25％硫酸铵溶液洗脱，流速控制在2mL／min以下，收集红色洗脱液〔洗脱掖一旦变白，立即停止收集)，洗脱完毕，人造沸石可再生使用。一、盐析为了进一步提纯细胞色素C，在洗脱液中．继续慢慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液浓度为45％(约相当于67％的饱和度)放置30min以上(最好过夜)．杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤波。二、三氯乙酸沉淀在搅拌下，每100mL细胞色素C溶液加入2.5－5.0mL20％三氯乙酸，细胞色素C沉淀析出，立即以3000/min的转速离心15min，倾去上清液(如上清液带红色，应再加入适量三氯乙酸重复离心)，收集沉淀的细胞色素c，加入少许蒸馏水，用玻璃棒搅动，使沉淀溶解。三、透析将沉淀的细胞色素c溶解于少量蒸馏水后．装入透析袋，放进500mL烧杯中(用电磁搅拌器搅拌)，对蒸馏水透析，15min换水一次，换水3—4次后，检查硫酸根离子是否已被除净检查的方法是，取2mL氯化钡溶液放人一支普通试管，滴加2—3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示未除净，如果无沉淀出现．表示透析完全。将透析液过滤，即得清亮的细胞色素C粗品溶液。四、含量测定本实验方法制备的细胞色素C是还原型和氧化型的混合物，因此在测定含量时，要加入联二亚硫酸钠，使混合物中的氧化型细胞色素C变为还原型。还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大吸收值，根据这一特性，用国产722型分光光度计选一标准品，作出细胞色素C浓度和对应的光吸收值的标准曲线，然后根据所测溶液的光吸收值，由标准曲线的斜率求出所测样品的含量。具体操作如下：127 取l加工标准品(81mg／mL)，用水稀释至25mL，从中取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，分别放人5支试管中，每管补加蒸馏水至4mL，并加少许联二亚硫酸钠作还原剂，然后在520nm波长处测得各管的光吸收值分别为0.179，0.350，0.520，0.700，0.870。以上述经稀释25倍标准样品的毫升数或计算得到的浓度值(mg／mL)为横坐标，A值为纵坐标，作出标准曲线图（图26.1）。从而求得斜率为1／3.17。取样品lmL，稀释适当倍数(本实验稀释25倍)，再取此稀释液1mL，加水3mL，再加少许联二亚硫酸钠，然后在波长520nm处测得A值为0.342和0.344，其平均值为0.343。根据此A值查标准曲线．得细胞色素C浓度，再计算其样品原液浓度，或根据标准曲线斜率计算样品原液浓度。在本实验中，每500g猪心碎肉，应获得75mg以上的细胞色素C粗制品。也可以用标准管方法测定粗品液浓度：取已知浓度的细胞色索C标准液1mL与样品稀释1mL，按上述方法分别测得520nm处A值(调节二者浓度，使A值在0.2－0.7范围)。根据标准液浓度和A值，计算样品液浓度和粗品总量。注意事项1.力争除尽猪心非心肌组织，如脂肪、血管、韧带和积血。2.提取、中和要注意调节pH。吸附、洗脱应严格掌握流速。3.盐析时，加入固体硫酸铵，要边加边搅拌，不要一次快速加人。127 4.逐滴加人三氯乙酸，搅匀，加完后，尽快离心。5.透析袋要求不漏。四.附注试剂和器材一、材料猪心。二、试剂2mol／L硫酸溶液，1mol／L氨水溶液，0.2％NaCl溶液，．25％硫酸铵溶液(100mI溶液中含25g硫酸铵，约为25℃40％的饱和度)，氯化钡试剂(称氯化钡12g溶于100mL蒸馏水中)，20％三氯乙酸(TCA)溶液，人造沸石(Na2O·Al2O3·xSiO2·yH2O)白色颗粒，不溶于水，溶于酸，选用60—80目。联二亚硫酸钠(dithionite，)。三、器材纹肉机，电磁搅拌器，电动搅拌器，离心机，722型分光光度计，玻璃柱(2.5x30cm)，500rnL下口瓶．烧杯(2000mL，500mL，400mL，200mL各一个)，量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃搅棒，透析纸．纱布。人造沸石的再生方法：使用过的沸石先用自来水洗去硫酸铵，再用0.2－0.3mol/L氢氧化钠和1mol/L氯化钠混合液洗涤至沸石成白色，最后用水反复洗至pH7—8，即可重新使用。五.思考题1．为做好本实验应注意哪些关键环节?为什么?2．试以细胞色素c的制备为例，总结出蛋白质制备的步骤和方法。实验三十二枯草杆菌碱性磷酸酶的制备及酶活力的测定一.实验目的①掌握枯草杆菌碱性磷酸酶的制备方法。②学习离子交换纤维素柱层析的工作原理及其操作技术。③学习测定枯草杆菌碱性磷酸酶活力的方法。二.实验原理127 枯草杆菌在无机磷受限制的培养中能合成碱性磷酸酶，该酶主要存在于细胞质中。获取该酶首先必须培养细菌，再用高渗的镁离子溶液将该酶抽提到溶液中，再经硫酸铵分级沉淀，最后用DEAE—纤维素层析纯化即可得到纯酶。纤维素经过一定的化学处理后即可带上某些功能基团而进行离子交换，这种含有功能基团的纤维素称为离子交换纤维素。它的性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子物质。用柱层析进行分离可以将性质相近的大分子物质分开。常用的离子交换树脂有弱碱性阴离子交换剂DEAE—纤维素(功能基为二乙氨基乙基)，弱酸性阳离子交换剂CM—纤维素(功能基为羧甲基)及强酸性阳离子交换剂磷酸—纤维素(功能基为磷酸基)。碱性磷酸酶能在碱性条件下水解磷酸单酯键，放出无机磷酸。用硝基酚磷酸(NPP)为底物，通过碱性磷酸酶的作用，生成硝基酚和磷酸，测定420nm的吸光值，即可得到酶的活力。三.实验方法及步骤1.枯草杆菌的培养①斜面活化：从保存于4℃冰箱中的枯草杆菌斜面上挑取一环菌接种于另一新鲜的斜面培养基中，于37℃培养18h。②种子培养：从活化后的斜面中挑取一环菌接种于25mLTris培养基中，于37℃振荡培养10h。③发酵培养：按5％接种量吸取5mL种子液接人100mL(500mL三角瓶装)Tris培养液中，剧烈振荡培养10一14h。(由于碱性磷酸酶产生于对数生长后期，因此在培养过程中要不断取样测定酶活力，直到酶活力保持稳定时，停止发酵。)④培养完毕后，将培养液于8000r／min离心5min，收集菌体。并用预冷的0.1mo1/LTris—HCI缓冲液(PH7．4)洗涤菌体3次。2．碱性磷酸酶的分离将收集的湿菌体悬浮在0.1mo1/LTris—HCI缓冲液(PH7．4)中，加入2mL1mo1/LMgClz溶液于37℃振荡30min后，13000r／min离心10min，弃去沉淀物，上清液即为酶的粗提液。取上述酶液(注意留样测酶活力)，在磁力搅拌器搅拌下，慢慢加入硫酸铵粉末，使其达50％饱和度(313g/L，25℃)，静置30min，于13000r／min离心20min去除杂蛋白沉淀。将上清液分成五部分，分别加入固体硫酸铵，使其达到70％，75％，80％，85％和90％的饱和度，充分混匀后，静置30min以上，分别于13000r／min离心20min。收集各管沉淀并混合，用l／50体积的含lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)溶解。将此酶液装入透析袋，然后用lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)透析20一30h，每隔5h更换一次透析液，除去硫酸铵。直到用5％氯化钡检查无硫酸根离子或用荼氏试剂检查无氨根离子为止，最后再用缓冲浪透析一次。127 3.碱性磷酸酶的纯化①DEAE—纤维素的预处理称取DEAE—32干粉4g，在重蒸水中溶胀4h以上。悬浮除去小颗粒，加入200mL0.5mol/LNaCl，室温搅拌20min，用重蒸水洗至中性。再加人200mL0.5mol/LNaOH室混搅拌20min，用含lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液洗涤至PH7.4。②层析柱的安装如图4—4所示，准备内径为1.5cm，高20cm的双通玻璃管，两头配亡橡皮塞，其中一个橡皮塞中央插入一根玻璃滴管，橡皮塞上盖一块圆形尼龙网片和一块绢布。玻璃滴管上一根硅胶管，与分部收集器相连。③装柱向层析柱内加人一些含lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)以除去柱底的气泡，然后将经过预处理的DEAE—32装柱。然后用上述缓冲液平衡，控制流速为0.2mL／min，直至流出液pH值为7.4为止。将层析柱放人冰箱中预冷。④加样使层析柱内水面下降到刚接近DEAE纤维素表面，关闭下口，小心地用移液管将上述透析液加到纤维素表面，然后慢慢放松下口螺旋夹使样品液面降至接近DEAE纤维素表面再加人少量缓冲液，如此反复2—3次。开始进行梯度洗脱。⑤梯度洗脱先以50mL含lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)淋洗，流速控制在0.5mL／min。直到流出液的吸光值低于0.1后依次换用含0.2mo1/L，0.3mo1/L，0.4mo1/L氯化钠。lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，流速为0.5mL／min。每5mL收集一管，于280nm处测定吸光值。以OD值为纵坐标，洗脱液体积为横坐标绘出洗脱曲线。将洗脱的蛋白峰合并(留取lmL测定酶活力)。用饱和硫酸铵(约900g/L)反透析约5一10h。透析液用冷冻离心机于0℃13000r／mm离心20min，收集沉淀．即为磷酸化酶的127 纯品。4．碱性磷酸酶活力的测定取纯化液0.5mL于小试管中，加人1mo1/LTris－HCl缓冲液(PH9.5)1mL，混合后30℃水浴预热5min，然后加入40mmol/LNPP溶液0.5mL，于30℃恒温水浴反应10min，分别测定反应前后420nm下的吸光值。吸光值每变化0.001定义为酶的一个活力单位。即：四.附注试剂和器材一、器材试管及试管架，250mL三角瓶，酸度计，高速冷冻离心机，恒温振荡器，分光光度计，恒温水浴，层析柱，透析袋，磁力搅拌器，铁架台，分部收集器，电冰箱。二、试剂和材料①斜面培养基：将0.5％牛肉膏、1％蛋白胨、0.5％NaCl、2％琼脂加水溶解。调pH为7.4定容至200mL，121℃灭菌20min。②种子及发酵培养基(Tris培养基)：将0.4％葡萄糖、0.1％酪蛋白水解物、0.5％NaCl、1％硫酸铵、0.1％KCl、0.1mmol/L氯化钙、lmmol/L氯化镁、20mmol/L磷酸氢钠、溶解于0.01mo1/L的Tris－HCl缓冲液中，调pH至74，定容至500mL，12l℃灭菌20min。①1mo1/LTris－HCl缓冲液(PH9.5)。②0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)。⑤含有lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)⑥40mmol/L对硝基酚磷酸溶液(NPP液)。⑦含有0.3mol/LNaCl、lmmol/L氯化镁的0.0lmo1/LTris－HCl缓冲液(pH7.4)：将0.3mol/LNaCl溶于试剂⑤中。⑧DEAE纤维素(DEAE—32)。⑨奈氏(Nessler)试剂：称取5gKI溶于5mL水中，加入饱和HgClz溶液(每100mL水中溶解5.7g氯化汞)，不断搅拌，至产生的朱红沉淀不再溶解时，加人40mL50％NaOH溶液，稀释至100mL，静置过夜取上清液。⑩5％氯化钡。五.思考题127 1.为什么可以用DEAE纤维素离子交换层析提纯酶?2.本实验是采用何种方法测定碱性磷酸酌活力的?实验三十三酯酶的分离、纯化与活性测定二.实验原理(1)通过酯酶的分离和纯化，了解离子交换层析法的原理(2)掌握梯度洗脱的方法和技术。二.实验原理酯酶是A—酯酶、B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机制有关。本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素(CM—纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素〔DEAE—纤维京)：蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂解离基因与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此．被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现。与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM—纤维素离子交换剂，通过柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶．127 梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连续的梯度变化、从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液(低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放人高浓度的盐溶液，其浓度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也应该相同。这样．当两容器之间的通道打开．并使混合瓶溶液流进层析柱时、梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的。当混合瓶的溶液开始流入层析柱，它的液面高度就逐渐下降．为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶液即从导管流人混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。三.实验方法及步骤一、粗酶制剂的制备杀死大白鼠，迅速剖腹取肾，置于冰浴中剔除脂肪和结缔组织。新鲜肾组织和－15℃丙酮，按10g重量和100mL容积的比例，一同置人Waring捣碎器中捣碎．为避免温度升高，捣碎0.5min后，把匀浆倒人烧杯中，置于冰盐浴冷至一15℃，再捣碎0.5min，反复3次。然后把匀浆倾入布氏漏斗抽滤，用一15℃丙酮洗涤3次，按上述方法再捣碎滤饼，抽滤和洗涤一次。将最后得到的滤饼散置于表面皿，放人真空干燥器干燥数天．即得丙酮粉干品．每10g新鲜肾组织可制得丙酮粉3—4g。按100mg丙酮粉加入5mL0.01mol／LpH6.0磷酸缓冲液的比例，将二者放入烧杯中，置于冰箱内抽提30min，不时搅拌。抽提液在3000r／min下离心10min，上清液即为粗酶制剂（保存于冰箱待用）。测定此粗酶制剂的蛋白含量和酶活性。二、CM—纤维素离子交换剂的处理称10gCM—纤维素干品置于烧杯中，加入100mL0.5mol／LNa0H—0.5mol／LNaCl溶液，混匀，静置15min后，在布氏漏斗中抽滤，水洗滤饼至中性。此滤饼再悬浮于100mL1mol／LHCl溶液中，混匀，静置10min后放入布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。再将滤饼悬浮于100mL0.5mol／LNa0H—0.5mol／LNaCl溶液中，混匀，静置15min后放人布氏漏斗抽滤，水洗滤饼至中性。最后将滤饼悬浮于所选择的起始洗脱缓冲液中，使用后的回收处理和上述步骤相同，只是省略了将滤饼悬浮于1mol／LHCl溶液这一步。三、层析柱的安装和平衡洗净一支15x40cm127 的玻璃(管)柱(也可选用规格合适的商品层析柱)，准备两个橡皮塞将其中一个的中央插入一根玻璃细管，上面覆盖一圆形尼龙网片或一块绢布。玻璃细管上连接一根细胶管，与部分收集器相连。将这个橡皮塞安入层析柱的下端，另一橡皮塞中央也括入一根玻璃细管，并接上一根胶管与洗脱液混合瓶下口相连。此橡皮塞塞入层析柱的上端，两端胶管上各备一个螺旋夹。将层析柱架至垂直，夹紧下端胶管，向层析柱内加入蒸馏水(约2／3住高)，然后将预处理好的离子交换纤维素装入柱内，使其自由沉降至柱的底部，放松柱下端螺旋夹，让柱内液体慢慢流出。待树脂沉降至所需高度(约30cm)后，置一圆形滤纸或尼龙片于胶面，待胶面只剩下一薄层水时，夹紧下端夹子，向柱内加入数毫升洗脱起始缓冲液，松开下端夹子，用起始缓冲液渗洗平衡，先是压力较小．后增至洗脱时的压力(平衡10h左右为宜)。若平衡压力过大，柱内树脂被压迫太紧，影响流速。平衡好的柱面应存留一薄层缓冲液，旋紧下端螺旋夹。四、加样和梯度洗脱用滴管将4mL粗酶制剂溶液(总蛋白含量15mg)沿柱内壁徐徐地加到纤维素柱面，然后慢慢放松下端螺旋夹、使样品液面降至纤维素柱表面，再加入少许洗脱起始缓冲液洗涤柱壁，如上操作，反复进行2次。梯度洗脱采用图50．1的装置实现。A为贮液瓶，B为混合瓶，二者容量相等，且置于同一水平面。C为A，B二瓶连通管的活塞，D为搅拌器，E为混合瓶的通嘴活塞。A盛高浓度洗脱缓冲液．B盛等体积起始洗脱缓冲液。洗脱前先开动搅拌器，后启开活塞C和E，B瓶洗脱液浓度呈直线式递增。关紧活塞C和E，在A瓶中加入0.1mol／LpH6.0磷酸缓冲液150mL，在B瓶中加入0.005mol／LpH6.0磷酸缓冲液150mL，将混合瓶B上的胶管与层析柱连接上之后．开动搅拌器．打开A，B两瓶之间连通管的活塞C，再打开B瓶的通嘴活塞E，控制流速在2mL／20min。开动部分收集器，分管收集流出液，每管收集2mL。实验在0－10℃的温度范围内进行。测定各管流出液的酶活性，同时用Folin－酶试剂法测定每管流出液的蛋白含量。127 五、酯酶活性的测定底物乙酰—2，6—二氯酚靛酚被酯酶水解后生成的2，6—二氯酚靛酚在pH8.0的条件下显蓝色，底物浓度恒定时，酶促反应速度取决于酶的活性。测定时，取4mL0.05mol／LpH8.0磷酸缓冲液，加0.2mL底物(最终浓度为0.000125mol／L)，再加适量酶溶液(0.5mL含200ug蛋白质)和水，使反应系统的最终容积为6mL，在30℃下反应5min后立即在60nm波长处测定A值。本实验是各管取0.5mL梯度洗脱液测定酶活性。若光吸收值越大，表示酶活性越高．六、结果处理(1)以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液的蛋白含量为纵坐标，作出洗脱曲线图，峰I和Ⅱ为两个主要酶蛋白峰。蛋白含量以1mL梯度洗脱液(Folin—酚试剂法测定)在500nm波长处比色的光吸收值表示．(2)以梯度洗脱流出液的管数为横坐标，以相应流出液酶活性(取0.5mL测定，在600nm波长处的A值)为纵坐标、绘制出酶活性曲线图，得到两个主要酶活性峰I和Ⅱ(见图50．2)。127 (3)以梯度洗脱流出液的管数为横坐标．梯度洗脱液浓度为纵坐标．绘制出梯度洗脱液液度曲线图。(4)分别合并峰I和Ⅱ两个组分，测定它们的蛋白含量和酶活性．并计算比活性。比活性的计算方法如下：最后列出鼠肾粗酶制剂(丙酮粉原抽提液)和层析洗脱液酯酶比活性的比较以及蛋白回收率（见表50.1）。127 由表列的数据看出，酯酶集中在峰Ⅱ。四.附注试剂和器材一、试剂丙酮，0.01mol／LpH6.0磷酸缓冲液，0.05mol／LpH8.0磷酸缓冲液，0.00375mol／L乙酰—2，6—二氯酚靛酚丙酮溶液，0.5mol／LNa0H—0.5mol／LNaCl溶液，1mol／LHCl溶液，0.005mol／LpH6.0磷酸缓冲液，0.1mol／LpH6．0磷酸缓冲液，CM—纤维素(0.069mmol/g干粉，PK＝3.5)。二、器材Waring捣碎器，布氏漏斗，抽滤瓶，表面皿，离心机，国产72型分光光度计，梯度混合器，1.5x40皿玻璃柱，试管，自动收集器．移液管，量筒，烧杯、玻璃漏斗。五.思考题1．离子交换纤维素有何特点?为什么人们常用它来分离纯化酶及其他生物活性大分子物质?2．何为梯度洗脱法?它有何特点？实验三十四蛋白质浓度测定――紫外线(UV)吸收法一.实验目的1.了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。127 2.了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。二.实验原理由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处．在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此．在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用．此法的缺点是：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质．有一定的误差；(2)若样品含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差．但可作为初步定量的依据．三.实验方法及步骤一、标准曲线法1.标准曲线的绘制按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各官溶液的A值。以A值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2．样品测定取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。二、其他方法127 (1)将待侧蛋白质溶液适当稀释．在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。计算此外，也可先计算出A280nm／A260nm的比值后，从表14.1中查出校正因子“F”值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将“F”值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。式中A280nm为该溶液在280nm下测得的光吸收值；d为石英比色杯的厚度(cm);N为溶液的稀释倍数。(2)对于稀蛋白质溶液、还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。从吸收差△A与蛋白质含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差△A＝A215nm－A225nm式中的A215nm、A225nm分别是蛋白质溶液在215nm和225nm波下测得的光吸收值。127 此法在蛋白质含量达20—100ug／mL的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及0.1mol／L磷酸、硼酸和三经甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是0.1mol／L乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至0.005mol／L才无显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而有高低，故应用紫外吸收法时要注意溶液的pH最好与标准曲线制订时的pH一致。(3)如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值，则取该蛋白质溶液于280nm处测定光吸收值后，便可直接求出蛋白质的浓度。四.附注试剂和器材一、标准和待测蛋白溶液1．标准蛋白溶液湛确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，配制成浓度为1mg/mL的溶液2．待测蛋白溶液配制成浓度约为1mg／mL的溶液。二、器材紫外分光光度计，试管和试管架，吸量管。五.思考题1．本法与其他测定蛋白质含量法相比．有哪些优缺点?2．若样品中肯有干扰测定的杂质．应如何校正实验结果?实验三十五核酸浓度测定――紫外线(UV)吸收法一.实验目的1.通过实验，了解紫外线(UV)吸收法测定核酸q2.进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。二.实验原理核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数(或称吸收系数)用来表示。127 为每升溶液中含有l克原子核酸磷的光吸收佰(即A值)(表321)。测得未知浓度核酸溶液的260nm处A值．即可计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损．用量也少。蛋白质和核昔酸等也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核昔酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。三.实验方法及步骤(1)准确称取核酸样品若干，加少0.01mol/LNa0H调成糊状．再加适量水，用5—6％氨水调至pH7.0，最后加水配制成每毫升含5—50ug核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算核酸浓度：(2)如果待测的核酸样品中含有酸溶性核昔酸或可透析的低聚多核苷酸．则在测定时需加钼酸铵—过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm波长处A值作为对照。127 ●准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量0.01mol／LNaOH调成糊状，再加适量水．用5—6％氨水调至pH7.0，定容至50mI。●取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水；乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min，在3000r／min下F离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处的A值．在本实验中，1mL待测液中制品量为50ug。四.附注试剂和器材一、试剂1．钼酸铁—过氯酸沉淀剂取3.6mL70％过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25％铂酸铵—2．5％过氯酸溶液。2．5—6％氨水用25—30％氨水稀释5倍。3．测试样品RNA或DNA干粉。二、器材分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，冰浴，容量瓶（50mL），吸量管，试管，试管架。五.思考题1.干扰本实验的物质有哪些?2．设计排除这些干扰物的实验。127 实验三十六酵母RNA提取与地衣酚显色测定法一.实验目的了解并掌握稀碱法提取RNA及地衣酚显色法测定RNA含量的基本原理和具体方法。二.实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这2种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核昔酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10％左右氯化钠溶液，90℃提取3—4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱(本实验用0.2％NaOH溶液)使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67—10.0％月化而DNA含量仅为0.03－0.516％，为此，提取RNA多以酵母为原料。RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5—二羧基甲苯(地衣酚orcinol)反应，在三价Fe离子或二价Cu离子催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在10一100ug／mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此．测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。三.实验方法及步骤一、酵母RNA的提取称4g干酵母粉置于100mL烧杯中，加入40mL0.2％Na0H溶液，沸水浴上加热30min经常搅拌。然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性(石蕊试纸检查)，4000r／min离心10—15min。取上清液，加入30mL95％乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后．布氏漏斗抽滤。滤渣先用95％乙醇洗两次，每次用10mL。再用无水乙醚洗两次．每次10mL，洗涤时可用细破棒小心搅动沉淀。最后用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：127 二、RNA地衣酚显色测定1．标准曲线的制作取12支干净烘干试管．按下表编号及加入试剂。平行作两份．加毕置沸水裕加热25min，取出冷却．以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值．以RNA浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作固，绘制标准曲线。2．样品的测定取两支试管，各加入2.0mL样品液，再加20mL地衣酚—Cu（二价离子）试剂。如前述进行测定。3．RNA含量的计算根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量按下式计算出制品中RNA的百分含量：四.附注试剂和器材一、材料干酵母粉二、试剂0.2％NaOH溶液，0.05mol／LNa0H溶液，乙酸，95％乙醇，无水乙醚。1．标准RNA母液(须经定磷法测定其纯度)准确称取RNAl0.0mg，用少量0.05mol／LNa0H湿透，用玻棒研磨至糊状的混浊液，加入少量蒸馏水、混匀、调PH7.0，再用蒸馏水定容至10ml，此溶液每毫升含RNA1mg。2．标准RNA溶液取母校1.0mL置10ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度．此溶液为100mg127 RNA／mL。3．样品溶液控制RNA浓度在10—100mg／mL范围内。本实验称量自制干燥RNA组制品10mg(估计其纯度约为50％)。按标准RNA溶液方法配制到100mL。4．地衣酚—铜离子试剂将100mg地衣酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgCuO，临用前配制。三、器材容量瓶(10mL)，吸量管(2.0mI，5.0mL)，量筒（10mL，50mL）,沸水浴，离心机，布氏漏斗，抽滤瓶，石蕊试纸等。注意事项(1)样品中蛋白质含量较高时，应允用5％三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。(2)本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，亦有干扰作用。如在试剂干加入适量二水氯化铜可减少DNA的干扰。甚至某些己糖在持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RKA和DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后，DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15min后，在670nm下呈现最大光吸收。五.思考题思考题1．用你所学过的化学知识，分析3种催化剂：6水三氯化铁，1水氯化铜，氧化铜，那种催化效果更好？2．地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能减少它们的影响?实验三十七猪脾脏DNA提取与二苯胺测定法一.实验目的了解并具体掌握脾脏DNA提取与二苯胺显色测定的原理和方法。二.实验原理DNA主要集中在细胞核内，因此．通常选用细胞核含量比例大的生物组织作为提取制备DNA的材料。小牛胸腺组织中细胞核比例较大，因而DNA含量丰富，同时其脱氧核糖核酸酶(DNase)活性较低，制备过程中．DNA被降解的可能性相对较低，所以是制备DNA的良好材料。但其来源较困难，脾脏较易获得，也是实验室制备DNA常用的材料。本实验选用猪脾脏作为材料，用浓盐法制备DNA。127 在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物而存在——核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白DNP)，这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低．当NaCl浓度达到0.14mol/L时DNP溶解度约为纯水中溶解度的1％，但当NaCl浓度继续升高时．DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol／L时，DNP的溶解度约等于在纯水中的溶解度．当NaCl浓度继续增至1.0mol／L时，DNP的溶解度约等于其在纯水中溶解度的两倍。但RNP则不一样，在0.14mol/LNaCl溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大．因此在制备DNA时，利用0.14mol／L稀盐溶液使DNP与RNP分开。由于DNP在浓盐溶液中的溶解度比稀盐溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶液(如1—2mol／L)尽量抽提DNP。分离得到DNP后再进一步将蛋白质等杂质除去。常用去除蛋白质的方法有(1)氯仿法：用含有异戊醇的氯仿溶液振荡核蛋白溶液，使其乳化．然后离心．此时蛋白质凝胶停留在水相和有机相之间，DNA则溶于上层水相。(2)苯酚法：用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相中或存在于中间残留物中、蛋白质变性后存留在酚层中。苯酚由于能迅速使蛋白质变性，因而也抑制了核酸酶的活性，有利于获得大分子核酸。此外，十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂也能使蛋白质变性．有利于除去蛋白质。去除蛋白质后的核酸盐溶液．再利用其不洁于有机溶剂的性质，应用适当浓度的有机溶剂(如两倍体积乙醇或0．5倍体积的异丙醇)使DNA呈絮状沉淀析出。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。在酸性溶液中，DNA分子的脱氧核糖转化为，它与二苯胺试剂作用生成蓝色化古物(最大波长值为595nm)，DNP在40一400ug范围内，光吸收与DNA浓度成正比，可用比色法测定。除DNA外，脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样反应，其他多数糖类包括核糖在内一般无此反应。三.实验方法及步骤一、DNA的提取(I)取新鲜(少冻)猪脾脏，称20g，剔去结缔组织，用0.1mol／LNaCl—0.05mol／L柠檬酸钠混合液冲洗除去血水，在冰浴上剪成碎末．(2)加入2倍组织重的01加l／LNacl—o05皿l／L柠檬酸钠混合液(奶rnJJ)置高速组织捣碎机内破碎纫脑膜(惧档，每次55，间隔30s，共绞3次)．获得组织浆该。127 (3)组织浆液于3000r／min离心15min，弃去上层液，收集沉淀(包括细胞核)。(4)向细胞核沉淀中加入6倍组织重的10％(1.71mol／L)NaCl溶液120mL，充分搅匀，置冰箱内过夜。(5)次日将所得到的半透明粘稠状液体连续注入预冷的11倍体积(1320mL)蒸馏水中．轻轻摇匀，DNP即呈絮状沉淀析出．置冰箱内放置数小时。(6)上层清液利用虹吸方法吸出，剩余含有沉淀的少量溶液经离心(3000r／min，10min)收集DNP沉淀。(7)将DNP沉淀再溶于原组织重约4倍体积(80mL)的10％饱和NaCl溶液中，轻轻搅拌加速溶解。(8)加入1／2体积的氯仿—异戊醇溶液(24：1V／V)40mL，上下剧烈振荡10min，使组蛋白分离，于3000r／mmin离心10min，吸出上面含有DNA和DNP的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶．回收下层有机相。(9)上层水相再次加入20mL氮仿—异戊醇混合液，继续抽提去除蛋白，多次重复此操作直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。(10)最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷至4℃的95％乙醇中。(11)用玻棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80％和95％乙醇洗涤．最后用少量无水乙醇洗涤．轻轻压挤沉淀．尽量吸尽乙醇后．铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。二、DrvA含量的测定1．标准曲线的制定取14文试管，分成7组按下表操作。127 每组取两管光吸收平均值．以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2．样品的测定取2支试管各加入2mL待测液(内含DNA应在标准曲线的可测范围之内)和4mL二苯胺试剂．其余操作同标推曲线的制作。3．DhA含量的计算根据测得的光吸收值从标淮曲线上查出相当的DNA含量，按下式计算制品中DNA的百分含量：四.附注注意事项(1)为了防止大分子核酸在提取过程中被降解．使其分子断裂，因而不能获得天然的大分子核酸。提取中需要加入柠檬酸钥、EDTA、8—羟基喹啉等抑制核酸酶的活力，并在低温下进行操作，此外提取过程中应避免加热，强酸，强碱和剧烈振荡等。本实验第一步进行组织匀浆时，不宜过于剧烈．时间不能太长，避免部分细胞核被破坏．导致DNA释放而被断裂，这将关系到最后是否能获得纤维状DNA。为此匀浆后应检查一下细胞核的完整性，方法如下：取绞碎后的浆液一滴在载玻片上，以曲利本蓝(trypanblue)染色．显微镜下(约200倍)观察．视野内应有大量完整的被染成蓝色的细胞核。127 (2)除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分DNA断裂．乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状DNA外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的DNA。但若振荡不够．蛋白质不能很好除去，则影响DNA制品的质量。(3)细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，有时可能形成块状凝胶(如以脾脏为材料制备DNA)、应置捣碎机内纹5s，打碎凝胶块，但此时DNA已从核内溶解出来、因此不宜剧烈打碎。(4)二苯胺试剂仅能与膘吟核昔酸中的脱氧核糖反应，因此测定的可靠性受到不同来源的DNA中嘌呤与嘧啶核昔酸比例变化的限制．为提高测定准确度，应使用经纯化的其含磷量已知的小牛胸腺DNA作为标准样品进行校正。试剂和材料一、材料新鲜或冰冻猪脾脏二、试剂1．0.1mol／LNaCl—0.05mol／L柠檬酸钠混合液称取0.58gNaCl和1.47g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解后稀释至100mI。2．DNA标准溶液称取适量小牛胸腺DNA钠盐(经定磷法确定其纯度)，以0.01mol/NaOH溶液溶解配成200ug／mL溶液(为便于溶解DNA，可先用少量稀碱液溶解后再稀释至要求的浓度)。3．DNA制品溶液估计制备的DNA样品纯度，称取适量DNA钠盐制品以0.01mol／LNa0H溶液配成含DNA浓度为100一300ug／mL(若测定RNA制品中的DNA含量时，要求RNA制品液中DNA含量至少为40ug／mL)。10％(1.71mol／L)NaCl溶液，氯仿—异戊醇溶液(24：1V／V)，80％乙醇，95％乙醇，2％曲利本蓝〔trypanblue)染色液。三、器材离心机，高速组织捣碎机，恒温水浴，试管，吸量管（2mL，5mL），72型分光光度计。五.思考题1.结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？2.DNA制品都可以用哪几种方法测定其含量？试从它们的原理、准确性等方面加以比较。127 实验三十八植物DNA的提取一.实验目的学习从新鲜的叶片中提取植物总DNA的方法二.实验原理随着植物基因工程的迅速发展，人们经常需要提取一些适合用限制性内切酶降解的高分子量植物的DNA(如构建某种植物的基因文库)。本实验介绍的就是一种快速简便提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，以机械力破碎细胞壁，然后加人十六烷三甲基溴化铵分离缓种液，使细胞膜破裂，同时将核酸与植物多糖等杂质分开(十六烷三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammoniumbromide，简称CTAB，是一种阳离子去污剂)。再经氯仿－异戊醇抽提去除蛋白，即可得到适合酶切的DNA。三.实验方法及步骤(1)将10mI—CTAB分离缓冲液加人30mL的玻璃离心管中，置于60℃水浴中预热。(2)称取1.0－1.5g新鲜叶片，置于预冷的研钵内，倒入液氮．将叶片研碎。可重复数直至叶片成为很细的粉末，称重。(3)将叶片粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动离心管使之混匀(4)样品于60℃保温30min。(5)加等体积的氯仿—异戊醇(24：1)，轻轻颠倒混匀。(6)室温下4000/min离心8min。(7)用一开口较大的滴管将上层水相取人另一干净的离心管中，加入2／3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来(有些情况下，在这一步会产生可以用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的沉淀。如果观察不到沉淀现象．样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜)。(8)用下述方法收集核破：●如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10—20rnL的洗涤缓冲液中；●如果DNA呈云雾状，可在2000r／min离心1—2min，小心地倒去上清液，在松散的沉淀物上加10—20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸悬浮起来；●如果DNA沉淀不可见．则可以在更高转速下离心，但这可能会形成更坚实的沉淀．并且含有更多的杂质。这种沉淀较难洗涤。加入洗涤缓冲液后，常需要用玻璃棒搅动．可能将长链DNA打断。127 (9)洗涤至少20min后．4000r／min离心10min，或用玻璃棒搅出沉淀。(10)小心倒去上溶液，在室温下，使DNA沉淀，空气干燥，称重，计算产率。(11)将DNA沉淀溶于1mLTE中。(12)取15—20uLDNA溶液〔如有条件，可取同样量的DNA溶液做HindⅢ酶切或EcoRI酶切)做0.7％的琼脂糖凝胶电泳，以和HindⅢ酶切的做分子量标淮，检查DNA的大小和质量。四.附注试剂和器材一、试剂1．CTAB分离缓冲液2％w/vCTAB，1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HCl(pH8.0),0.2%V/V巯基乙醇共100mL：称取2gCTAB，8.81gNaCl，0.74gEDTANa2·2H2O，加入10mL1mol/LTris-HCl(Ph8.0),0.2%巯基乙醇，加水定容至100mL。2．洗涤缓冲液76％V/V乙醇，10mmol／L乙酸铵共100mL：76mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水至100mL。新鲜的植物叶片，TE(1mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HCl(pH7.4))，氯仿—异戊醇(24：1，V:V)，液氮二、器材研钵，恒温水浴（37℃－100℃），离心机，离心管。注意事项提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。五.思考题为保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提及电泳时应注意什么？实验三十九鼠肝DNA的制备一.实验目的学习从鼠肝中提取动物DNA的方法二.实验原理127 DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质基础，它与生命的正常活动如种厉遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子生物学研究的主要内容之一。核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白(DNP)形式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类基因组含2.9×109bp。无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。要从生物组织中提取DNA，睱DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA。并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O.D260nm／O.D280nm能达到1.8左右为标准。分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有：(1)细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。，(2)DNA分子很大，分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA含量：O.D260nm×样品稀释倍数×50ug／ml=ug/m1样品。三.实验方法及步骤1．取新鲜鼠肝用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸千后，—70C127 冰箱中保存，用时取出。2.1克鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1分钟(2次，每次1／2分钟)3．取塑料离心管1支加入1／3支匀浆液(若匀浆液太稠，则再加入lmlTE缓冲液)，然后再加入等体积苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，然后离心t0000转／分钟×5分钟，水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提二次。注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提二次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数4．水相加入一刻度离心管中后，加入2．5倍体积的冰无水乙醇(可用刻度离心管测量体积)。加5mol／LNaGI到终浓度为0.1mol／L，在离心管中轻缓的混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。5．用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70％乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。6．沉淀取出放入一干净的塑料离心管中，用lmlTE缓冲液溶解。7．在lmlDNA溶液中加入10mg／ml的RNA酶20μl，使最终浓度达到200ug／ml，37℃保温30分钟。8．加入20％SDS25ul，使最终浓度至0．5％；加入0．5mol/lEDTA30ul至20mmol/l；加10mg／ml蛋白酶K20ul，使最终浓度为200ug／ml，50E保温30分钟。9．加等体积苯酚：氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K及其它残留的蛋白质，至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提轻缓地来回摇动5分钟，离心10000转／分钟X5分钟。127 10．吸取水相，水相吸至一干净刻度离心管中量出积体，再加入2．5倍体积的冰无水乙醇，加5mol／LNaCl至终浓度为0．1mol／L，混匀后可得较纯的DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤沉淀一次。11.在一干净的塑料离心管中用0．3—0．5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。12．吸取DNA原液100ul，用TE缓冲液稀释至3ml(1:30稀释)，(若DNA原液太浓，取原液50ul，太稀则取原液200u1)。在紫外分光光度计中测定O.D260nm及O.D280nm的读数。计算：O.D260nm／O.D280nm比值，DNA浓度及DNA总量。剩余原液写上自己的学号，交给带教老师保存，留作做PCR实验，注意事项：．1．为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须(1)匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。(2)实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。(3)酚抽提时勿剧烈振摇。2．保持DNA活性，避免酸、碱或其它变性因素使DNA变性。，3．苯酚是一种强列的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免碰到皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽毒性较大，实验中应注意将盛酚的试剂瓶盖好。4．离心时要注意管于间的重量平衡。管于要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。四.附注器材1．塑料离心管：62．刻度离心管：13.滴管：长：1吸酚：氯仿混合液中：1吸乙醇短(钝口)1吸DNA水溶液4．细玻棒：15．移液管：16．微量取样器17．手套：1副8．离心机9．紫外分光光度计10．37℃水浴，50℃水浴11．组织捣碎器12．电泳仪及电泳槽127 试剂1．裂解缓冲液：50mmol／lTris—HclpH7.420mmol/lEDTA、0.5％SDS100mmol/lNaCl配法：1mol/lTris—HClpH7.450ml20％SDS25ml2mol/lNaCl50ml0.5mol/lEDTA40ml蒸馏水稀释至1000ml其中Tris—HclpH7．4维持PH恒定，防止DNA变性和水解。EDTA能络合二价金属离子，当Mg+’被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。2．苯酚重蒸苯酚加入抗氧化剂8—羟喹啉1mg／ml，用1mol/lPH8．0Tris—HCl洗一次，再用0.1mol／1Tris—HclPH8．0洗二次，苯酚PH在7．6—7．8之间。3．苯酚：氯仿混和液(1：1)苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混和液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。苯酚和气仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，伹氯仿具有较好的分层作用。4．无水乙醇DNA在PH7．4条件下分于带负电，在NaCl存在条件下，DNA盐呈电中性，乙醇将DNA分子周围的水分夺去，DNA失水形成白色絮状沉淀。5．TE缓冲液50mmol/lTris—HClpH7.05mmol/lEDTA配法：lmol／lTris—HClpH7.410ml0．5mol/lEDTAEDTA127 蒸馏水稀释至1000ml6．RNase10mg/ml配法：称取RNase溶解在10mmol／lTris—HCl(PH7．5)和15mmol／LTris—Hcl(PH7.5)和15mmol／lNacl落液中使之浓度为10mg／ml。100℃加温15分钟，使夹杂的少许DNase失活，然后慢慢冷却，分装于小管中—20C保存。7．蛋白酶K(10mg/m1)—20℃保存。蛋白酶K优点——水解能力很强，作用广泛，可与SDS及EDTA合并使用。8．20％SDS9．0．5mol／LEDTA10．12mol／L高氯酸五.思考题1．如样晶中有蛋白质存在，其紫外分析结果有何表现?如何进一步纯化?2．DNA的定量可采用那些方法?目前常用的是哪种?如何测定DNA的含量?3．从生物细胞中提取DNA的主要注意点是什么?应如何控制?4．能引起DNA变性的因素有哪些?DNA降解和DNA变性有何区别?如何鉴别?实验四十DNA片段的琼脂糖凝胶电泳一.实验目的学习琼脂糖凝胶电泳技术二.实验原理琼脂糖凝胶电泳是重组DNA研究中常用的技术，可用于分离，鉴定和纯化DNA片段。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等)，有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。凝胶中的DNA可与荧光染料溴化乙锭(EB)结合，在紫外灯下可看到荧光条带，籍此可分析实验结果。127 三.实验方法及步骤1.将凝胶成形模具两端用医用胶布封好，水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间。2.称取DNA电泳用琼脂糖0.8g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于电炉上，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。3.关闭电炉，取下三角烧瓶，将其置室温下冷却至70℃左右(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭(10mg/ml)5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml。4.室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，揭去二端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。5.在电泳槽加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜。6.取Ep管三支，标号，如下表所示准备电泳样品123样品λDNA/HindⅢ未酶解质粒酶解质粒10μl(1r)10μl(～2r)10μl(～2r)6×点样液2μl2μl2μl7.将上面三管样品置震荡器上混匀，短暂离心。8.用加样器吸取样品。依序分别加入三个点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。9.接通电源，调节电压至50伏，电泳90分钟后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。注：1.细菌噬菌体λDNA全长49.01kb，其序列及酶切位点已研究清楚，它经不同的限制性内切酶消化后可产生不同的电泳带图谱。因为每条区带的DNA长度是已知的，所以被选为基因工程中常用的DNA分子大小标准，与其进行比较计算，即可得到待测DNA片断的长度，λDNA经HindⅢ消化后产生7条区带，依次为23.7；9.46；6.75；4.26；2.26；1.98；0.58(kb)2.溴化乙锭为一种有毒试剂，使用时一定要戴手套操作，注意防护。四.附注仪器与器材1．电泳仪2．平式核酸电泳槽3.紫外灯试剂与材料：1.琼脂糖2.6×点样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖3.DNA分子量标准：λDNA分子量标准：λDNA/HindⅢ127 4.50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：(50×)每升242gTris，57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1×缓冲液浓度：0.04mol/LTrisHAc、0.002mol/LEDTA5.0.8%琼脂糖：0.8g琼脂糖用100ml1×TAE沸水浴溶解6.10mg/mlEB1.0g溴乙锭100ml三蒸水附注：影响DNA片段琼脂糖电泳的几个因素：1.DNA分子的大小：线性DNA分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。2.琼脂糖浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的DNA，应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶浓度可分辨的线性DNA片段大小(kb)0.45~600.70.8~101.00.4~61.50.2~41.750.2~32.00.1~33.DNA分子的形态：在同一浓度的琼脂糖凝胶中，超螺旋DNA分子迁移率比线性DNA分子快，线性DNA分子比开环DNA分子快。4.电流强度：每厘米凝胶电压不超过5V，若电压过高分辨率会降低，只有在低电压时，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。附：琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段原理在pH8．0—8．3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同(忽略碱基上的部分电荷，每个核苷酸残基都带二个负电荷)，因此在自由泳动时，各种核酸分于的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分了筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分于大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度(4℃一30℃之间)无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分于量对数及胶浓度成反比，与电场强度(小于5V／cm)成正比。在核酸胶电泳中最常用的pH=8．3的TBE缓冲液(0．089127 mol／LTris—Borate--0．002mol／lEDTA)和TAE缓冲液(0．04moVLTris—Acetate--0．002mol／LEDTA)，也可用pH7．0，0．01mol／L磷酸缓冲液。TBE缓冲液的缓冲能力较强。在电泳过程中需马指示剂指示核酸迁移情况，常用的指示剂是溴酚蓝(Bromophenolblue，Bb，蓝紫色)和二甲苯蓝(Xylenecyanol，xc，蓝色)。溴酚蓝的结构式见图2—11，分子量很小，仅670，在通常使用的不同浓度胶中电泳时近似于自由电泳，不存在分于筛效应，所以迁移速度基本相伺。二甲苯蓝结构式见图2，分于量仅554．6，在不同浓度胶中迁移速度也基本相同。二甲苯蓝带电荷量与溴酚蓝不同，所以在同一浓度胶中迁移速度比溴酚蓝慢。这两种指示剂在不同浓度胶中迁移速度与一定长度的核酸分子相当，如在5％的聚丙烯酰胺胶中，Bb与Xc的迁移速度分别与65核苷酸和260核苷酸相同，在7—8moVL尿素—5％聚丙烯酰胺中则相当于35和130核苷酸片段。在0．6％、1．0％、2％的琼脂糖胶中，Bb的迁移速度大致与lkb、0．6kb和0．15kb的双链DNA片段相同。因此，按照所耍分离的核酸分子大小，可以根据指示剂迁移情况来决定电泳时间。电泳样品中除了加指示剂外；为了使加样品能沉入胶孔，还要加入适量蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。电泳后的核酸要经过染色才能显示出条带。常用染色剂有溴乙锭(Ethidiumbromide，EB)吖啶橙(Acridineorange，Ao)。荧光染料溴乙锭是扁平分子，结构式见图3。它可以嵌入核酸双链的碱基对之间，当受紫外光激发时，发射590nm的红色荧光。EB—DNA复合物的荧光比EB本身发射的荧光强许多倍，因此一般不必洗去背景就可观察到核骏电泳带。如果背景太深条带不够清晰，可将胶浸泡于lmmol／L127 MgSO4中1小时或10mmol/LMgCL2中5分钟，使非核酸结合的EB退色。染色一般在电泳结束后进行，将胶浸入0．5ug／ml的EB水溶液中10分钟即可。EB见光会分解，染色时应避光。染色与电泳同时进行，只须制胶时将EB加入胶内使浓度达0．5ug／ml，这样可在电泳过程中随时观察核酸迁移情况。EB带正电荷，会中和核酸分于的负电荷，同时由于它的嵌入增加了核酸分于的刚性，所以在含EB的胶内电泳，核酸的迁移速度减慢，如双链线状DNA迁移速度减慢约15％。因此，用胶电泳方法测定核酸分子(片段)大小时，不宜将EB加入胶内，应在电泳后染色。另外，在胶中未结合核酸的EB向负极泳动，会使样品中各条带染色不均匀，故此法也不宜用于根据荧光强度定量检测核酸。在琼脂糖凝胶电泳时，用荧光染料溴乙锭染色，可检测到少至lng的DNA。单链DNA、RNA分子中若有自身配对的双链区也可被EB分子嵌入，但嵌入量少，因而检出灵敏度较低，大于0.lug。器材和试剂1．器材(1)电泳仪、琼指糖电泳槽。(2)20ul微量加液器。(3)透射式紫外分析仪。2．试剂(1)50XTAETris—HCl242．2g冰乙酸57．1ml加水至1000ml0．5MEDTA(pH8.0)100ml127 (2)载样指示液25mg溴酚兰溶解于100ml40％蔗糠中。(3)1％溴化乙锭。(4)电泳液：1000mllXTAE加90ml1％溴化乙锭1g溴化乙锭加水100ml，充分溶解后，倒入棕色瓶中，避光保存。操作1．琼脂糖凝胶板的制备称取琼脂糖2克，倒入三角烧杯内，加100毫升电泳缓冲液，置沸水浴或微波炉中加热，使其充分溶解。将溶解后的琼脂糖，自然冷却至6012左右，缓缓倒入凝胶形成板上，待胶冷却凝固后，垂直拔出“木梳”即可。2．预电泳将制备好的凝胶板浸入电泳槽中，3—5mA／cm预电泳30分钟。3．上样与电泳①提取的鼠肝DNA原液10ul。②PCR反应物10ul。③标准分子量DNA3ul、加7ul。H2O，分别加1／10体积载样指示液，混匀后上样(不要刺破凝胶)。上样完毕，开启电源(5—7mA／cm)电泳30—60分钟。4．结果观察戴干手套取出凝胶板，沥去残留在胶上的液体，将疑胶板倒扣在紫外灯上观察结果。DNA片断的荧光强弱由DNA含量决定，而DNA的迁移率则反映了DNA片断的大小。127 图中：λ-DNA：50Kb，PGEM一7Zf(+)／HaeⅢDNA：区带为102、142、174、267、289、328、bp等，6、56Kb，4、37Kb，2、32Kb，2、03Kb．注意事项1．溴化乙锭是致癌物，操作时耍戴防护手套。2．在紫外灯下观察结果，耍放下防护罩，以免眼睛受紫外辐射损伤。也可用手提式紫外灯照射凝胶进行结果观察，这样安全些。，3．制备凝胶板时，一定要等溶解后的琼脂糖冷却至60℃左右再倒入成形板上，以免该板受热变形。实验四十一SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量一.实验目的学习聚丙烯酰胺凝胶电泳技术二.实验原理127 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。SDS的作用原理在于，这种阴离子去污剂能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。当有强还原剂（如巯基乙醇）存在时，可使蛋白质分子内的二硫键被彻底还原。并且当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长椭圆状。因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。据经验得知，当蛋白质的分子量在17,000～165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgK－bm，　　　　　　　　　　　　　　　　　上式中，MW为蛋白质的分子量，m为相对迁移率，K为常数，b为斜率。将已知分子量的标准蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。三.实验方法及步骤1．按图安装制胶模具2．根据所测蛋白质的相对分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按下表所列的试剂用量配。分离胶的配制127 7.5%(ml)10%(ml)15%(ml)H2O4.904.102.4030%丙烯酰胺2.503.305.00分离胶缓冲液(pH8.8)2.502.502.5010%SDS0.100.100.10TEMED0.020.020.0210%过硫酸铵0.020.020.02总体积10ml10ml10ml将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。3．浓缩胶的制备按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合的分离胶上，立即插入梳子，将凝胶垂直放于室温下聚合。浓缩胶的配制3%(ml)4%(ml)6%(ml)H2O3.23.052.730%丙烯酰胺0.50.651.0浓缩胶缓冲液(pH6.8)1.251.251.2510%SDS0.050.050.05TEMED0.050.050.0510%过硫酸铵0.050.050.05总体积5ml5ml5ml4．样品预处理：取样品液与等体积样品缓冲液混合，100℃加热1～2分钟。5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，然后将胶板固定于电泳装置上，上下槽各加入电极缓冲液。6．加样：用微量进样器加样。每个样品孔加入20ul样品。7．电泳：在100～150V的电压下电泳，直至溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。8．染色：从电泳装置上卸下玻板，小心橇开玻板取出凝胶，放入染色液中染色2小时以上。9．脱色：移出凝胶放入脱色液中脱色至本底无色为止。10．Mr的计算127 用直尺分别量出样品区带中心及染料与凝胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率(mr)=样品迁移的距离(cm)/染料迁移距离(cm)。以标准蛋白质的相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据等测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。四.附注【器材]电泳仪、垂直板电泳槽、进样器、乳头吸管、50ml小烧杯【试剂】1．标准蛋白质：细胞色素C、胰凝乳蛋白酶、2．30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。3．1.5mol/LTris-Hcl分离胶缓冲液pH8.8（4x）：取18.15gTris，用1MHCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。4．0.5mol/LTris-HCl浓缩胶缓冲液，pH6.8（4x）：取5.98gTris，用1NHCl调至pH6.8，加水至100ml，4℃保存。5．电极缓冲液（pH8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02gTris，加100ml10%SDS，加水至1升，4℃保存。6．10%SDS：取10gSDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。7．10%过硫酸铵溶液（AP）：临用前现配。8．染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、7%乙酸）：考马斯亮蓝R-2502.5g、甲醇（可用无水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸，溶解后补足水至总体积1000ml。9．脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用无水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml，补足水至1000ml。10．样品缓冲液（2x）：H2O2.4ml，浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10%SDS3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰0.2ml。11．TEMED（四甲基乙二胺）【注意事项】127 1．30%Acr-Bis是神经毒化合物，操作时要小心，做好个人防护2．过硫酸铵需现用现配3．过硫酸铵和TEMED在灌胶前加入即可4．用微量加样器上样时，勿刺破胶面五.思考题蛋白分子量的测定，除本实验采用的方法外，还有什么其它方法？实验四十二蛋白质印迹免疫分析一.实验目的学习蛋白质印迹免疫分析技术二.实验原理蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂—放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联抗免疫球蛋白抗体结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原—抗体—抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。三.实验方法及步骤一、样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。二、转移印迹1．转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏水中10-20min后浸入转移buffer中平衡30min。127 2．凝胶平衡：将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移buffer中平衡30-60min。3．按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。4．开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流0.8mA/cm，室温下转移1h，转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min，然后脱色检测转移效果。三、免疫染色1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。2．TBS洗膜1-2次，10min/次。3．加HRP标记的抗体，室温1h。4．TBS洗3次，10min/次。5．NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。滤纸凝胶转印膜转移单位示意图负极正极四.附注【器材】127 转移电泳仪，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀，手套，小尺【试剂】1．IgG标准品2．羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG抗体3．转移buffer：Tris3.03g，Gly14.4g，甲醇200ml，加三蒸水至1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。4．Trisbuffer（TBS）：Tris2.42g，NaCl29.2g，溶于600ml三蒸水，再用1NHCl调至pH7.5，然后补加三蒸水至1000ml。5．漂洗液（TTBS）：TBS液500ml，加Tween20250ul。6．封闭液：5%脱脂奶粉。7．抗体buffer：1.5gBSA溶于50mlTTBS。8．显色液DAB（3.3-diaminobenzidine，3.3-二氨基联苯胺）配制：5mgDAB溶于10ml柠檬酸buffer（0.01mol/L柠檬酸2.6ml，0.02mol/LNa2HPO417.39ml），加30%H2O210μl（临用时现配）。9．脱色液：甲醇250ml，冰醋酸100ml，加蒸馏水至1000ml。10．氨基黑染色液（0.1%氨基黑-10B）：0.2g氨基黑-10B溶于200ml脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸过滤。五.思考题此实验的注意事项是什么？实验四十三大鼠肝总磷脂的提取及薄层色谱分析一.实验目的学习薄层色谱分析技术二.实验原理127 1．磷脂提取磷脂是生物膜的主要成分，具有重要的生理功能。它们具有独特的物理性质，在脂类中极性较大。由于磷脂既具有疏水基团，又具有亲水基团，故在非极性溶剂及水中都有较大的溶解度。磷脂易溶于醇、氯仿、乙醚等有机溶剂，但不易溶于丙酮。利用后一性质可将其与三脂酰甘油分离。抽提磷脂通常用氯仿、甲醇混合液。甲醇有利于脂-蛋白复合体的裂解，溶解极性大的物质，并抑制脂酶，而氯仿则可溶解脂类。向氯仿-甲醇混合抽提液（含总脂，其中包括磷脂）中加水，使提取液分层，在下层溶剂相中可得到以磷脂为主的提取物。2．磷脂的薄层色谱薄层色谱是将支持物在玻璃板上均匀铺成薄层。将待分离样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，从而达到分离鉴定的目的。本实验以硅胶为支持物，属吸附层析。薄层层析所用设备简单，操作容易，层析时间短，分辨率高及需样量少，因此被广泛应用。将待测样品与已知图谱的标准样品在同样条件下进行层析，便可初步鉴定样品组分。大鼠肝磷脂图谱中性脂CL：心磷脂PE：磷脂酰乙醇胺PS：磷脂酰丝胺酸PI：磷脂酰肌醇PC：磷脂酰胆碱SM：神经鞘磷脂LPC：溶血磷脂酰胆碱原线三.实验方法及步骤一、总磷脂的提取1．匀浆：取大鼠肝1g，剪碎后加蒸馏水4ml匀浆，5000rpm/min离心1小时，弃上清，保留沉淀。2．总脂抽提：沉淀加水2.4ml、氯仿3.0ml、甲醇6.0ml（使氯仿：甲醇：水的体积比1：2：0.3）。混匀，放置并间歇振摇1小时。8000rpm/min离心20分钟，弃沉淀，脂类保留在上清中。127 3．脂类分配：向上清中加入蒸馏水2.4ml、氯仿3.0ml（使氯仿：甲醇：水的体积比1：1：0.8），振摇混匀，室温过夜。使磷脂主要进入下相（以氯仿为主的相），糖脂主要进入上相（以甲醇为主的相）。8000rpm/min离心20分钟，吸取下层液置于小蒸馏瓶中，-200C冷却20分钟。若有沉淀析出，离心除去，减压蒸发除去氯仿后，用N2吹干。4．用冷丙酮（-20℃过夜）洗涤提取物两次，用N2吹干，即得到总磷脂。用氯仿溶解至1.0ml，加塞保存备用。二、磷脂的薄板层析1．层析薄板的准备：取3×10硅胶板，在距一端1cm处，用铅笔轻划一条线（勿将硅胶划破），此为点样线。在点样线上按边缘0.8cm、点样长0.5cm、点样间距0.4cm划点（每块硅胶板可点两个样品），如图，然后置1100C烤箱中干燥活化1小时。3cm1cm122．点样：用微量进样器分别吸取磷脂标准液和上述肝脏提取液各10μL，点于薄板1，2号位上（见上图），吹干。3．展开：在衬有滤纸的层析缸中加入展开剂，使薄板展开后其下端浸如展开剂0.5cm,加盖，检查有无漏气（必要时可涂凡士林），置室温下平衡1小时。将点好样的薄板放入层析缸内（勿使展开剂浸入点样）进行层析，如下图，至展开剂距薄板上端0.5CM处时，取出立即吹干。4．显色：将层析后的薄板置于通风橱内，将磷脂显色剂喷于薄板上，约10分左右可见蓝色条带出现，将观察得到的结果记录下来（画在报告本上）》127 盖层析缸内衬滤纸展开剂层析板点样线四.附注【器材】匀浆器、带塞离心管（10ml）、高速离心机、旋转蒸发仪、蒸馏瓶、刻度吸量管、红外烤箱、微量进样器、电吹风机、层析缸、干燥器、层析板、喷雾器等。【试剂】1．氯仿2．甲醇3．蒸馏水4．丙酮5．层析溶剂：氯仿：甲醇：冰醋酸：H2O=75：35：15：5（V/V）6．磷脂显色剂（喷雾剂）：试剂Ⅰ：16克钼酸铵溶于120ml蒸馏水中。试剂Ⅱ：40ml浓HCl加10ml汞，再加80ml试剂Ⅰ。喷雾剂：200ml浓H2SO4加40ml试剂Ⅰ（呈深绿色），再将试剂Ⅱ小心加入，冷却后用蒸馏水稀释至1升（棕色）。实验四十四聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点一.实验目的学习等电聚焦电泳技术二.实验原理127 等电聚焦(isoelectricfocusing)，简称(IEF或EF)是1966年由瑞典科学家Rible和Vesterberg建立的一种高分辨率的蛋白质分离分析新技术。它是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离。由于它具有分辨率高(0.001pH单位)，重复性好、操作简便、迅速等优点，在生物化学、分子生物学、遗传学、分类学及临床医学等研究中广泛应用。该技术不仅适用于分离分析，而且也适用于分离制备，尤其是同工两和激素受体的制备。蛋白质分子是由不同数量和比例的各种氨基酸组成的，氛基酸侧链在不同的pH环境中所带的电荷不同。在蛋白质处于等电点时，它的净电荷为零，因此，可以利用电泳技术依照蛋白质等电点的差异进行分离分析。将混合的两性电解质分子在具有pH梯度的介质中进行电泳，由于pH引起的不同分子的内在电荷的差异在电场作用下按各自的方向泳动，最后聚集在各自的等电点相应的pH区带上，使不同的两性电解质分子按其等电点的差异得到分离。当两性电解质分子在pH值小于其等电点的环境中，就成为正离子(阳离子)，在电场中向负极泳动；当它在PH值大于其等电点的环境中，就成为负离子(阴离子)，在电场中向正极泳动；当在—个pH梯度的环境中，在电场中向其等电点方向泳动，直至所带净电荷为零，即正负电荷总数相等时停止泳动。产生pH梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同pH的缓冲液互相扩散．在混合区形成pH梯度，称为人工PH梯度。但这种pH梯度不相稳定，常用于制备电泳。另一种是利习两性电解质载体(carrierampholytes)在电场的作用下自然形成pH梯度，称为天然PH梯度。如果阴极电极液是强碱性的，阳极电极液是强酸性的，在两种电圾液之间充满／两件电解质，那么在阴极附近的两性电解质将带负电荷，在阳极附近的两件电解质将带正电荷。接通电源后，在电场中将受电极的排斥向中间区域泳动，各种两性电解质静止在与其相应的等电点附近的pH范围内。如果各种两性电解质的等电点不完全相同，只是相近似，那么最碱性的两性电解质静止在靠近阴极的位置，其他的两性电解质则依照其等电点的顺序排列。同理，最酸性的两性电解质静止在靠近阳极的位置。由于两性电解质的扩散作用，形成了一个从阴极到阳极之间均匀而又连续的pH梯度。如果不同pI值的两性电解质含量分布愈均匀则pH梯度线性关系愈好。这种PH梯度在电场作用下，在一定的温度范围内，并有防止对流的支持介质存在时是很稳定的。理想的两性电解质载体应该在自身的等电点范围内有足够的缓冲能力和良好的导电性，而且是一些有机小分子组成。两性电解质的组成与被分离样品要有所区别．并且对分离样品无变性作用，不发生任何化学反应。常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，它们是由一系列的异构体同系物组成，结构如下：127 Mr在300-1000之间，各组分的pK值和pI值既相近又有差异。pI的分布范围在2.5-11.0之间，比较精密的pI分布范围在3—4个pH之间。不同的厂家生产的载体两性电解质的方法略有差异，其产品也略有区别。目前常用的等电聚焦胶支持介质有：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶和葡聚搪凝胶。聚丙烯酰胺凝胶是等电聚焦电泳分析中最广泛采用的一种支持物。等电聚焦电泳的方式有很多种，大致可分垂直管式，毛细管式，水平板式及超薄水平板式等。这些方式各具其特点。目前在样品的分析中趋向于选用超薄水平板式。它具有分析样品多，两性电解质用量少，结果重复性好等优点，而且电泳后的凝胶容易固定，染色及干燥。若是作制备电泳也可选择水平板式法。三.实验方法及步骤1、取8ml两性电解质凝胶溶液，置于梨形瓶中，加入0.14ml白蛋白溶液（7mg白蛋白/ml），轻轻摇动混匀，抽去气泡。2、取内径0.5~0.6cm，长10cm的干净玻璃管4支，垂直放置在制胶管架上，玻管底端紧紧与橡皮塞相贴以保证底端封闭。假如40%蔗糖3~4滴，然后加第一步制好的凝胶液于玻管中，只至离玻管上端1cm处为止，上面再以2~3滴蒸馏水覆之，注意不要搅动凝胶，要保证混合液与空气隔绝，又要保持其与表面平整。3、等管内凝胶凝聚后，用滤纸吸去顶端的水，拔去管底部的橡皮塞，使蔗糖液流出，并用少量蒸馏水洗，然后将玻管放入圆盘电泳装置中，上槽注以5%磷酸溶液，接正极；下槽装2%NaOH溶液，接负极。注意应把凝胶与电极液之间存在的气泡排净。打开直流电源，恒压160伏，聚焦约4小时，当电流接近于零时停止电泳。4、聚焦结束后取出凝胶管，先用蒸馏水将其两端洗几遍，再用带有长针头（长约10厘米）的注射器吸水进行剥胶。先把长针头插入聚焦柱与玻璃管内壁之间，慢慢旋转玻管，一边压水一边将针头呈螺旋式推进，使凝胶条与管壁脱离，然后用吸耳球对玻管一端轻轻加压，使凝胶条从玻管内滑出。标明凝胶条的正负端，并对凝胶条编号。5、将凝胶条平放于胶条托板（黑色）上，用尺量出每一根凝胶条的长度并记录。127 6、将量过长度的凝胶条分别放入培养皿中，加入12%TCA固定2小时以上，即可看见白色蛋白带出现。7、将量过长度而未用TCA固定的另外一凝胶条放在玻璃板上，按照从正极端到负极端的顺序用刀片切成5mm的小段，各浸泡于1ml蒸馏水中过夜，测其pH值并记录。8．量出经TCA固定后的凝胶条长度以及凝胶条的正极端到蛋白质白色沉淀区带中心即聚焦部位的距离，并记录。9．数据的处理：（1）pH梯度曲线的制作：以凝胶柱长度为横坐标，pH值为纵坐标作图可得PH梯度曲线。由于所测得的每一管之pH值是以5mm长的小段胶条的pH混合平均值，作图时应把此pH值视为5mm小段的中心区pH值，即第一小段的pH值所对应的胶条长度应为2.5mm，依次类推有（5n-2.5）mm的式子。（2）蛋白质样品等电点的求算：蛋白质焦聚部位距正极端的实际长度Lp按下式计算：Lp=IpxI1/I2式中：Ip:所量出的蛋白质白色沉淀带中心距凝胶正极端的长度。I1:凝胶条固定前的长度。I2凝胶条固定后的长度。根据蛋白质聚焦部位距凝胶条的实际长度Lp，从pH梯度曲线上查得的对应pH值即为该蛋白的等电点。四.附注试剂两性电解质载体凝胶溶液：丙烯酰胺3.5g，甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3－10两性电解质载体2.5ml，核黄素溶液（4mg/ml）12.5ml，加水至50ml。蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。5%磷酸溶液：85%磷酸29.4ml加入稀释至500ml。染色液：取考马斯亮蓝R2500.1g，冰乙酸10ml，甲醇35ml，加蒸馏水定容至100ml，棕色瓶保存。脱色液：无水乙醇50ml,冰乙酸20ml，用蒸馏水定容至200ml。127 实验四十五　大蒜细胞SOD的提取与分离一.实验目的学习超氧化物歧化酶的提取与分离方法二.实验原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O2－）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2－＋H2＝＝O2＋H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。三.实验方法及步骤1．组织或细胞破碎称取5g左右大蒜蒜瓣或大蒜细胞，置于研磨器中研磨，使组织或细胞破碎。2．SOD的提取将上述破碎的组织或细胞，加入2－3倍体积的0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后用离心机在5000rpm，离心15min，弃沉淀，得提取液。3．除杂蛋白提取液加入0.25倍体积的氯仿－乙醇混合溶剂搅拌15min，5000rpm离心15min，去杂蛋白沉淀，得粗酶液。4．SOD的沉淀分离将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,5000rpm离心15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲液中，于55－60℃热15min,离心弃沉淀，得到SOD酶液。将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。5．SOD活力测定取3根小试管，按下表分别加进各种试剂和样品液。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(ml)试　　剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液5.05.05.0EDTA溶液0.50.50.5127 蒸馏水0.50.5－样品液－－0.5混　合　均　匀肾上腺素液－0.50.5在加入肾上腺素前，充分摇匀并在30℃水浴中预热5min至恒温。加入肾上腺素（空白管不加），继续保温反应2min，然后立即测定各管在480nm处的光密度。对照管与样品管的光密度值分别为A和B。在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化的50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。即：　　　　　　　　　酶活力（单位）＝2·（A－B）·N/A式中　　N――样品稀释倍数；　　　　2――抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数（100%/50%）。若以每毫升样品液的单位数表示，则按下式计算：　　　　　　酶活力单位/ml＝2·（A－B）·N/A·V/V1＝26·（A－B）·N/A式中V――反应液体积（6.5ml）；　　V1――样品液体积（0.5ml）。　　最后，根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化回收率。四.附注材料和试剂（1）新鲜蒜瓣（2）大蒜细胞，通过细胞培养技术获得（3）磷酸缓冲液：0.05mol/L,pH7.8的磷酸缓冲溶液。（4）氯仿－乙醇混合溶剂：　氯仿：无水乙醇＝3：5（V/V）。（5）丙酮：用前冷却至4－10℃。碳酸盐缓冲液：0.05mol/L,pH10.2。EDTA溶液：0.1mol/L。肾上腺素液：2mmol/L。实验四十六离子交换柱层析分离核苷酸一.实验目的学习离子交换层析分离技术127 二.实验原理离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的可逆的离子交换反应，它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引入若干活性基因。这样人工合成的离子交换剂具有各种各样的性能。作为不溶性母体的高分子有树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，引入的活性基因可以是酸性基团，如强酸型的含有磺酸基(一SO3H)、中强酸型的台有磷酸基(一P03H2)、亚磷酸基(一PO2H)、弱酸型的合有羧基(一COOH)或酚羟基(一OH)等。也可以是碱性基团，如强碱型的合季铵[一N＋(CH3)3]、弱碱型的含叔胺[一N(CH3)2]、仲胺(一NHCH3)、伯胺(一NH2)等。在一定条件下，离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时，两者数量之比称为分配系数(平衡常数)。理想的情况是洗脱曲线和分配系数相符合，待分离的各种物质的分配系数，应有足够的差别，以Kd表示分配系数：式中Ms和M1从分别代表单位重量离子交换树脂和单位体积溶液中溶质的mol数。当有A、B两种溶质进行离子交换校层析时，吸附在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分配系数成反比，因此由原点到A、B两种物质波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值。各波峰的幅度和形状由棒长及其他因素(如交换树胎颗粒的大小、形状、交联度、流速等)所决定。溶质的分配系数不仅与其电荷有关，也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及两者之间的空间关系等因素的影响。127 被吸附样品的洗脱通常采用改变pH或盐离子强度，或者两者同时改变来实现，这对分离复杂的混合物是有效的。因为在离子交换剂的活性集团中，可解离离子与被分离物质中具有相反电荷离子间因静电吸引而形成的离子键，由于pH的改变，使被分离物质的解离降低，电荷减少，从而降低其亲和力；或因盐离子浓度增加，盐离子与被吸附物质的亲和力增大，从而降低被分离物质与离子交换剂的亲和力，导致已结合物质被吸脱下来。核酸经酸、碱或酶水解可以产生各种核苷酸，核苷酸的可解离基因是第一磷酸基，含氮环上的一NH2和第二磷酸基等，它们的解离常数(pK)和由此得到的等电点差异，这是进行离子交换层析分离的基础。pKa1值在0.7—1.0之间，Pka3值在6.1—6.4之间，各个核昔酸之间的数值比较接近，因此不能作为彼此分离的主要依据。而含氮环(尿苷酸除外)的Pka2值却不同，在2.4—4.5之间，各个核昔酸之间的差别较大，导致各个核苦酸的pI值有显著差别(表5—2)，这是离子交换层析分离核苷酸的主要依据。为了增加单核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要：(1)控制条件，使单核苷酸带上大量相应的电荷。这主要是通过调节pH值，使单核苷酸的一些可解离基团(磷酸基、氨基、烯醇基)解离，4种单核苷酸相对分配系数与pH的关系如图5-7。(2)减少上柱溶液中除单核苷酸外的其他离子的强度。洗脱时则相反：使被吸附的中核苷酸的相应电荷降低；增加洗脱液中竞争性的离子的强度，必要时提高温度使离子交换树脂对单核苷酸的非极性吸引作用减弱。RNA可被碱水解成2’-或3’-核苷酸。可利用阳离子交换树脂(聚苯乙烯－二乙烯苯，磺酸型)或阴离子交换树脂(聚苯乙烯—二乙烯苯，季铵碱型)分离单核苷酸。本实验利用强碱型阴离子交换树脂(强碱型201×8、强碱型201×7、国产717、Dowexl、AmberliteIRA－400或Zerolit127 FF等)将各类核苷酸分开。首先，使RNA碱水解液的其他离子强度降至0.02以下，调pH值至6以上，样品核苷酸都带上负电荷。当上样后，它们都能与树脂结合。因为核昔酸的pI值越大、它与阴离子交换树脂的结合能力越弱，在洗脱时就越容易被洗脱下来。由表5-2可知，当用竞争性离子的洗脱液进行洗脱时，4种核营酸被浓脱的先后顺序应该是CMP，AMP，GMP和UMP。但由于本实验所用的树脂不溶性基质是非极性的，它与嘌呤碱某的非极性亲和力大于嘧啶的非极性亲和力，因而流出液中的核昔酸出现的顺序是CMP，AMP，UMP和GMP。而就同一种核昔酸的不同异构体而言，它们之间的差别仅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2’－磷酸基较3’—磷酸基距离碱基更近，因而它的负电性对碱基正电荷的影响较大，其pK值较大，例如2’—胞苷酸pKa1值为4.4，3’—胞苷酸pK2a1值为4．3，因此2’－核昔酸更容易被洗脱下来(见闻5—7)。测定核昔酸的紫外吸收光谱的比值：A250nm／A260nm，A280nm／A260nm，A290nm/A260nm对照标准比值(表5—3)，可以确定其为何种核苷酸，同时也能算出RNA中核苷酸的相对mol比。三.实验方法及步骤一、样品处理取20mg酵母RNA，溶于2mL0.3mol/L氢氧化钾溶液中，于37℃水解2h，RNA在碱作用下水解成单核苷酸，水解完成后，用2mol/L过氯酸溶液调pH至2以下，以4000r／min离心10min，取上清液，用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH8，并用紫外分光光度计准确测得含量后待用。二、离子交换柱肋安装取内径1.1cm—1.2cm、高20cm的玻璃管柱。下端橡皮塞中央插入一玻璃滴管供收集流出液，橡皮塞上盖以尼龙网和薄绢以防止离子交换树脂流出(见图5—8)。127 将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液1次倒入玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在树脂面上。缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上。(柱意在整个换作过程中防止液面低于树脂，当液面低于树脂表面时空气将进入，在树脂柱内形成气泡，妨碍层析结果)。经沉积后离子交换树脂柱床高7—8cm。三、加样将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片内时，用50mL蒸馏水淋洗树脂柱。碱基、核昔及其他不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出。四、核昔酸混合物的洗脱收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光光度计上测260nm处光吸收，待洗脱液不合紫外吸收物质(光吸收值低于0.02.)时，可用甲酸及甲酸钠溶液进行洗脱。127 1．分段洗脱法：依次用下列洗脱液分段洗脱，500mL0.02mol/L甲酸；500mLl5mol/L甲酸；500mL0.01mol/L甲酸—0.05mol/L甲鞍钠溶液(pH4．44)；最后用500mL0.1mol/L甲酸—0.1mol/L酸钠溶液(pH3.74)。用部分收集器收集流出液，控制流速5—6mL／管／15min。分段沉脱图谱如图5—9所示。2．梯度洗脱法：梯度仪的混合瓶装300mL0.02mol/L甲酸，贮液瓶装300mL0.2mol/L甲酸—0.2mol/L甲酸钠溶液，控制流速在5—6mL／管／15min，用部分收集器收集，用260nm检测，记录洗脱分离图谱。梯度洗脱曲线如图5—10所示。127 结果处理1．作出阴离子交换树脂柱层析的洗脱曲线。以层析流出液管数(或体积)为横坐标，以260nm光吸收值为纵坐标，作出洗脱曲线图(如用紫外检测自动记录，可以省略此步)。2．作出各组分的紫外吸收光谱图。以波长为横坐标，光吸收值为纵坐标，作出230nm一300nm波长范围内各级分的吸收光谱图。求出每个组分的最大吸收峰的波长值(入max)，同时，计算出各个组分的光吸收比值(250nm／260nm、280nm／260nm、290nm／260nm)将它们与标准核昔酸的对应值(表5—3)比较，从而可以签定4种组分各为何种核苷酸。3．单核昔酸的mol浓度计算。根据各组分溶液的合并体积(V)，平均光吸收值(A)再查出该127 核昔酸的摩尔吸收系数(k260nm)，从而可以计算出每种核昔酸的mol数(m)。式中，I为此色池的光程，一般取I＝1cm，而m＝cV，c为核苷酸的mol浓度。则由此，可以计算出各核苷酸的百分含量以及嘧啶核昔酸或嘌呤核苷酸的含量。4．回收率的计算。根据层析上样A260nm值以及层析后所得到各组分A260nm值，可以计算出离子交换柱层析的回收率(RNA的mol吸收系数7.7—7.8×l03，水解后增值40％)。四.附注试剂和器材一、试剂1．RNA(酵母RNA，商品)2．强碱型阴离子交换树脂20l×8(聚苯乙烯—二乙烯苯、三甲胺季铵碱型，全交换量大于3mmol／g干树脂，l00一200目)：用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒，使用时先用0.5mol／L氢氧化钠溶液浸泡14h，以除去碱溶性杂质，然后用无离子水洗至中性。再用1mol／L盐酸泡半小时，除去酸溶性杂质，再用无离子水洗至中性，然后用1m01／L甲酸钠溶液浸泡，使树脂转变成甲酸型。将树脂装入柱内，继续用lmo1／L甲酸钠溶液洗，直至流出液中不含氯离子(用1％硝酸银溶液检查)。最后用0.02mol／L甲酸洗，直至260nm处光吸收值低于0.020，并用蒸馏水洗至接近中性，即可使用(装置见图5—8)。3．1mol／L甲酸：取21.4mL88％甲酸定容至500mL。4．1mol／L甲酸钠溶液：称34.15g甲酸钠用水溶解定容至500mL。5．0.02mol／L甲酸：取10mLlmol／L甲酸定容至500mL。6．0.15mol／L甲酸：取75mLlmol／L甲酸定容至500mL。7．0.01mol／L甲酸—0.05mol／L甲酸钠溶液(pH4.44)：取5mL1mol／L甲酸、25mLlmol／L甲酸钠溶液定容至500mL。8．0.1mol／L甲酸—0.1mol／L甲酸钠溶液(pH3.74)：取50mLlmol／L甲酸、50mLlmol／L酸钠溶液定容至500mL。9．0.3mol／L氢氧化钾溶液：取1.68g氢氧化钾用水溶解定容至100mL。10．2mol／L过氯酸：取17mL70％一72％过氯酸定容至100mL。127 11．1mol／L盐酸。12．0.5mol／L氢氧化钠溶液。二、器材1．玻璃柱(内径1.1cm、高20cm)2.下口瓶3.紫外分光光度计4.恒温水浴5.部分收集器6.紫外监测仪实验四十七离子交换柱层析法分离氨基酸一.实验目的通过实验要求学会装柱、洗脱、收集等离子交换柱层析技术。二.实验原理树脂(惰性支持物)上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合。改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离，由于不同的氨基酸在不同的pH值及离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后顺序洗出，达到分离的目的。三.实验方法及步骤1．树脂的处理干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/LHCl及2mol/LNaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/LNaOH浸半小时(转型)，用蒸馏水洗至中性。2．装柱垂直装好层析柱，关闭出门，加入柠檬酸缓冲液约1cm高。将处理好的树脂12—18mL加等体积缓冲液，搅匀，沿管内壁缓慢加入，柱底沉积约1cm高时，缓慢打开出门，继续加入树脂直至树脂沉积达8cm高，，装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面．否则要重新装柱。3．平衡将缓冲液瓶与恒流泵相连，恒流泵出门与层析柱人口相连，树脂表面保留3—4cm左右的液层，开动恒流泵，以24mL／h的流速平衡，直至流出液pH与洗脱液PH相同(约需2—3倍柱床体积)。4．加样127 揭去层析柱上口盖子，待柱内液体流至树脂表面1.0－2.0mm关闭出口，沿管壁四周小心加入0.5mL样品，慢慢打开出口，使液面降至与树脂表面相平处关闭，吸少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至液层3—4cm左右，接上恒流泵。加样时应避免冲破树脂表面，避免将样品全部加在某一局限部位。5．洗脱以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速24mL／h，用部分收集器收集洗脱液，4mL/管×20。6．测定分别取各管洗脱液lmL，各加入显色剂1mL，混合后沸水浴5min，冷却，各加0.1％CuSO4溶液3mL，混匀，测A570nm。以吸光度值为纵坐标，洗脱液累计体积(每管4mL，故4mL为—个单位)为横坐标绘制洗脱曲线。四.附注器材1．层析柱1.2cmx19cm2．恒流泵。3．部分收集器。4．刻度试管10mL(x1)。5．烧杯250mL(x1)。6．吸管1.0mL(x2)。试剂1．732型阳离子树脂。2．柠檬酸缓冲液(洗脱液，0.45mol/L，pH5.3)：称取57g柠檬酸，用适量的蒸馏水溶解，加入37.2gNaOH,2lmLL浓HCl，混匀，用蒸馏水定容至2000mL。3．显色剂(0.5％茚三酮)：0.5g茚三酮溶于100mL95％乙醇中。4．0.1％CuSO4溶液。5．氨基酸样品：0.005mol/L的ASp和Lys(用0.02mol/LHCl配制)。127