微生物实验作业指导书

微生物基本操作作业指导书文件编号：文件类别：品质系统作业指导书撰写单位：品控部版本：第１版发行日期：机密等级：机密一般合计页数：共3页核准审核制定 名称微生物基本操作制作业指导书文件编号：1．目的：规范微生物基本操作。2．范围：适用于微生物检测。3．名词解释：无4．职责：微生物基本操作由检验组负责。5．作业内容：5．1器皿的清洗：凡被污染的器皿，应先经过121℃，30min高压蒸汽灭菌后再进行清洗。5．2玻璃容器的包扎：灭菌前器皿应包扎紧密完整后才进行灭菌，以防止灭菌后器皿受到污染。5．2．1平皿、吸管应用金属筒包装，或以牛皮纸包扎；5．2．2试管应冠以金属帽；5．2．3三角瓶及其它玻璃容器应在瓶口以牛皮纸内衬硫酸纸包扎。5．3培养基及器皿的灭菌：5．3．1器皿的灭菌：干燥加热空气灭菌法（在干燥箱中利用热空气灭菌）。适用于玻璃器皿、金属及其它干燥耐热物品，通常在160℃，2hr（温度不超过180℃，以免将棉塞或包装纸张烤焦着火）。另外，灭菌物品不宜摆放太紧密，应留有空隙；且不要直接接触干燥箱底和箱壁。在降温时要缓慢进行，以免玻璃破裂。5．3．2高压蒸汽灭菌：适用于金属器具、玻璃器皿、基础培养基及其它耐热物品。A含糖类不耐热培养基：115℃（0.0727MPa），15~20min。培养基的配制数量应以适量为宜，避免剩余部分多次灭菌后，使用时其性质已受到影响．　　　B染菌培养物：121℃(0.1034MPa),30min;C器械灭菌：121℃，30min；D灭菌锅的使用：a使用前请参照说明书加水至刻度，重复使用时应将水量补足，水边浑浊需更换；b接通电源，打开排气阀排气，水沸腾后排气10~15min；c排气后，关闭排气阀，使蒸汽压上升到规定要求并维持规定时间（按灭菌物品性质，参照5.3.2ABC）；d达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸汽，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物。如为液体物品不要打开排气阀，而应立即切断电源，待自然冷却，压力恢复至0℃以下再开盖取物，以防止突然减压液体剧烈沸腾或容器爆裂。e灭菌锅的温度、压力应定期测试。测试方法：去灭菌指示带置于灭菌锅的上、中、底部（灭菌物品间隙），在按照规定要求灭菌后，观察指示带的颜色变化是否达到标准，以判别灭菌锅之灭菌效果。生效日期页次1/2版序A 名称微生物基本操作制作业指导书文件编号：5．3．2灭菌后处理：灭菌后物品，注意放置场所，以免再度污染。A高压蒸汽灭菌后的物品除培养基及稀释液外的其他物品，如玻璃平皿金属器具或棉花等均应先置于105℃烘箱内，根据包装大小应保持1h以上，至干燥后使用。B包装损坏或塞子脱落者，不可作为无菌品使用。C如包装有明显浸水者,不可作为无菌品使用。D合格的灭菌物品应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放,玻璃器皿应坚持随用随灭的原则,灭菌后若保存最长不得超过24h。E灭菌合格的培养基不应贮存过久，一般不得超过24h，必要时可置于4℃冰箱存放。5．4无菌间的使用：5．4．1缓冲间的使用：实验室中需穿着之实验衣帽、鞋等物品需放置在缓冲间。并于实验前后打开紫外灯，照射时间不少于30min；5．4．2超净台的使用：A使用前应先用75%酒精棉擦拭台面，再打开超净配备的紫外灯，照射时间不少于30min；B使用时,应关闭紫外灯,打开日光灯,同时打开无菌风直至实验结束；C超净台灭菌效果应以落菌实验加以验证；555555　5．4．3无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，悬吊式紫外灯消毒，应选用30W,距离在1．0m处，照射时间不少于30min。5．4．4紫外灯管应常清洁，以防上面的灰尘污垢影响紫外线的穿透。紫外灯管应定期更换。5．5无菌操作要求：5．5．1接种样品时，必须穿专用的工作服、帽、口罩及鞋，且应放在无菌缓冲间，工作前经过紫外线消毒后使用；5．5．2接种样品时，应用75%的酒精棉球消毒双手；5．5．3打开包装未使用完的器皿，放置后再使用应新灭菌；5．5．4从包装中取出吸管时，尖端不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖端不得触及试管或平皿；5．5．5接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰灭菌。接种环和接种针在接种细菌前后应经火焰灼烧全部金属丝，必要时要烧到环和针的连接处。火焰灭菌的有效范围以火焰为中心半径9cm内。1．注意事项：无2．附件：无3．相关文件：无生效日期页次2/2版序A 微生物涂抹实验作业指导书文件编号：文件类别：品质系统作业指导书撰写单位：品控部版本：第１版发行日期：机密等级：机密一般合计页数：共3页核准审核制定 名称微生物涂抹实验作业指导书文件编号：1．目的：规范微生物涂抹实验样品采集方法。2．范围：适用于生产车间设备、厨具及成品包装容器的微生物检测。3．作业内容：3．1实验试剂：85%灭菌生理盐水；3．2实验仪器：3．2．1三角瓶：容量为250ml3．2．2灭菌镊子3．2．3灭菌棉球：体积为3×3×3cm33．2．4酒精灯3．3准备工作：配制85%生理盐水分装在一定数量的250ml三角瓶中，每瓶99ml，灭菌后待用；3．4样品采集：3．4．1设备取样：在酒精灯火焰下，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，反复擦拭需采集样品物体表面，接触面积视卫生状况，约100-200cm2，然后将该棉球迅速装入盛有99ml的灭菌生理盐水瓶中，摇匀待用；3．4．2成品包装容器取样：在酒精灯火焰下，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，以无菌操作方式于无菌操作台内反复擦拭包装容器表面，再将擦拭后的棉球装入盛有99ml的灭菌生理盐水瓶中，摇匀待用；3．4．3案板、刀具、餐盘、碗筷取样：在酒精灯火焰下，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，用此棉球反复擦拭待测案板、刀具、餐盘、碗筷，接触面积约为100-200cm2，然后将棉球迅速装入盛有99ml的灭菌生理盐水瓶中，摇匀待用；3．4．4操作人员手菌取样：在酒精灯火焰下，以无菌镊子镊取无菌棉球沾润灭菌生理盐水，用此棉球反复擦拭待测人员左手（或右手），接触面积约为100-200cm2，然后棉球迅速装入盛有99ml的灭菌生理盐水瓶中，摇匀待用；3．5样品检测：将带有检测棉球的生理盐水在微生物检验室按微生物检测的操作标准执行。3．6检测结果：3．6．1设备、案板、刀具：菌落总数=培养平皿增菌数（cfu/接触面积约为100-200cm2）要求：菌落总数<50cfu/（100-200cm2）大肠菌群：不得检出生效日期页次2/2版序A 名称微生物涂抹实验作业指导书文件编号：3．6．2餐盘、碗筷、成品包装容器：菌落总数=培养平皿增菌（cfu/接触面积约为100-200cm2）要求：菌落总数<10cfu/（100-200cm2）大肠杆菌：不得检出3．6．3人员手菌：菌落总数≤300cfu/只手大肠菌群：不得检出生效日期页次2/2版序A 落菌实验作业指导书文件编号：文件类别：品质系统作业指导书撰写单位：品控部版本：第１版发行日期：机密等级：机密一般合计页数：共3页核准审核制定 名称落菌实验作业指导书文件编号：1．目的：用于检测生产车间、微生物无菌室和无菌操作台的卫生状况。2．范围：适用于生产车间、微生物检验室。3．作业内容：3．1实验试剂：营养琼脂；3．2实验仪器：3．2．1试管3．2．2高压蒸汽灭菌锅3．2．3恒温培养箱3．3实验步骤：3．3．1在微生物检验室内将灭菌好的凉至45℃左右的营养琼脂倒入灭菌平皿内，每皿约15ml，待琼脂凝固后，将平皿翻转，待用；3．3．2生产车间环境落菌检测的操作方法：生产车间灭菌后或生产进行中进行测试。将6个装有营养琼脂培养基的培养皿,放置于所测车间的四个角落以及中间离四边各1/3处,测试时间为15min,然后将平皿盖好取回,放入培养箱内培养,同时做空白实验;A先将其在35±2℃的环境下培养36~48h,所得为细菌数；B再将其在25±2℃的环境下培养60~72h,所得为霉酵菌数；细菌、霉菌、酵母菌三类菌量之和即为空气中总菌量。以直径为9cm的平皿，检验时间为5min计算：总菌数=NN：每平皿平均菌落数，单位，个/[5min、1平皿（ø9cm）]空气清洁度与单皿(ø9cm)、5min的菌落数空气清洁度菌落数[5min、1平皿（ø9cm）]最清洁空气1~2清洁空气<30普通空气（30~70）~150清度污染空气<300严重污染空气〉3003．3．3微生物检验室检测的操作方法：3．3．3．1无菌操作台卫生检测的操作方法：无菌操作台开启后30min进行测试。将6个装有营养琼脂培养基的培养皿，放置于操作台的四个角落以及中间离四边各1/3处，测试时间为30min，然后将平皿盖好取回，放入培养箱内培养，同时做空白实验；生效日期页次2/2版序A 名称落菌实验作业指导书文件编号：A先将其在35±2℃的环境下培养36~48h,所得为细菌数；B再将其在25±2℃的环境下培养60~72h,所得为霉酵菌数；3．3．3．2无菌室卫生检测的操作方法：紫外线杀菌灯灭菌后30min进行测试。将6个装有营养琼脂培养基的培养皿，放置于操作台的四个角落以及中间离四边各1/3处，测试时间为30min，然后将平皿盖好取回，放入培养箱内培养，同时做空白实验；A先将其在35±2℃的环境下培养36~48h,所得为细菌数；B再将其在25±2℃的环境下培养60~72h,所得为霉酵菌数；3．3．3．3结果分析：35±2℃的环境下培养36~48h,所得为细菌数；25±2℃的环境下培养60~72h,所得为霉酵菌数；可分别以不同颜色的笔进行标示。所有培养基应全不长菌，若有任何一个长菌，则应将实验重复两次，而且测试前应进行消毒，若两次皆不长菌，则为合格，若有一次长菌，则无菌操作台应找厂家进行维修；对无菌室应检查其紫外灯的灭菌效果，同时应加大消毒力度及频率。生效日期页次2/2版序A