规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象论文

　　规模化蛋白质生物质谱鉴定中肽段氨基端环化修饰现象论文卢庄赵丽艳张养军蔡耘邓玉林张玉奎钱小红【摘要】对蛋白质样品制备中引入的氨基酸残基的一种现象——蛋白质酶切肽段氨基端的环化修饰现象的初步研究结果显示，很多以谷氨酰胺（Q）或氨乙酰化修饰的半胱氨酸（CAM_C）残基起始的肽段会发生氨基端的环化修饰，且修饰反应不完全，在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在，并且环化修饰后的肽段的反相色谱保留时间发生延迟。在数据库检索时添加环化修饰，可以提高蛋白质的鉴定成功率。本研究结果为大规模的蛋白质质谱数据解析提供了有价值的参考。【关键词】肽段氨基端，环化，规模化.freelassspectrometryhasbeendevelopedforthelargescaleproteinidentification.ThesuccessfulidentificationofproteininproteomicstudyisbasedonaneffectivematchofMSdatatothesequenceindatabase.Becauseofthediversityandheterogeneityofproteinmodification,theexperimentaldataobtainedbymassspectrometrydoesnotmatchthetheoreticalvaluesometimes,akesabout90percentormoreofthetandemmassspectranotbeeffectivelyidentified.Thishasbeeoneofthemostimportanttechniqueissuestoberesolvedincurrentproteomeresearch.TheNterminalcyclizationofpeptides,asoneofavarietyofmodificationintroducedinsamplepreparation,hasbeenpreliminarilystudiedinthisinalcyclizationoccurredatthemostoftheglutamine(Q)orcarbamoylmethylcysteine(CAM_C)residuesandthereactionisofteninpleteorpartial,bothtypesofpeptidescouldoftenexistinitsrespectivestateatthesametime,andthebehaviorofmodifiedpeptidesinreveredphasechromatographyisalsochanged.ThesuccessrateofproteinidentificationcouldbeobviouslyimprovedifaddingtheNterminalcyclizationmodificationinthedatabasesearching.Theseresultsassspectrometricdataanalysisofproteomicstudy.Keyinalofpeptides,cyclization,largescale,proteinidentification1引言 细胞或组织内存在的全部蛋白质的定性和定量分析是蛋白质组学研究的主要内容1。为了从细胞中鉴定目标蛋白质，候选蛋白质常用串联质谱（MS/MS）法2,3结合生物信息学的数据库检索进行分析。样品中的蛋白质通常先被胰蛋白酶消化成较小的肽段，然后经反相色谱分离进入质谱；肽段经离子化、碎裂后，产生用于鉴定的特征的MS/MS数据；通过在理论序列数据库中搜索MS/MS谱图来寻找最佳匹配的肽段，从而鉴定样本蛋白质。然而，在实际的蛋白质鉴定中，通常只有或少于10%的MS/MS谱图能够有效地鉴定出蛋白质，而大量的图谱都不能被解析4。MS/MS数据没有得到可靠的鉴定结果，除了谱图质量差，还有一个原因就是匹配不好。很多碎片信息很丰富的MS/MS谱图在检索时的得分也很低，其原因是可能此肽段在数据库中不存在、或某些蛋白质本身存在，但人工处理过程中引入的各种氨基酸残基的多种修饰影响其鉴定。蛋白质修饰的多样性和不均一性造成检索时实验值与理论值不相匹配，进而影响其质谱数据的正确解析。目前，肽段鉴定时常用的添加残基修饰有甲硫氨酸（Met）的氧化和半胱氨酸（Cys）的氨乙酰化，而对其它修饰研究很少。文献报道，以谷氨酰胺（Q）、谷氨酸（E）或氨乙酰化修饰的半胱氨酸（CAM_C）残基起始的肽段，在样品处理10或者自发11等状况下都会发生氨基端的环化修饰。这些发生了环化修饰的肽段由于质量数的偏移，在数据库检索时经常不能被正确鉴定。为了给蛋白质的鉴定分析提供更准确、完整的信息，得到更可靠的鉴定结果，本实验对蛋白质酶切肽段的端肽环化修饰现象进行了初步研究。2实验部分2.1仪器与试剂毛细管高效液相色谱电喷雾线性离子阱质谱仪（CapLCESILTQMS，ThermoFinnigan公司）；安捷伦1100毛细管色谱系统，包括自动上样器，上样泵（含十通阀）和二元洗脱泵（Agillent公司）；4800ProteomicsAnalyzer基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪（MALDITOFTOFMS，美国ABI公司）；电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂）；BP211d分析天平（瑞士Sartorius公司）。所有标准蛋白均购自Sigma公司；碘乙酰氨（IAA）和甲酸（FA）购自比利时ACROS公司；乙腈（HPLC级，美国J.T.Baker公司）；胰蛋白酶(Trypsin，测序级)和二硫苏糖醇(DTT)购自美国Promega公司；0.45μm滤膜有机相微孔过滤膜（天津津腾公司）；超纯水由MilliporeQA10型纯水系统（美国Millipore公司）制备，其它试剂均为国产分析纯。2.2实验方法2.2.1蛋白质样品的处理按照目前蛋白质组研究中经典的蛋白质变性、还原、烷基化的处理步骤处理蛋白质样品5，操作如下：牛血清白蛋白（BSA）及按照不同比例混合的10种蛋白质混合物（如表1），分别溶于含8mol/L尿素的50mmol/LNH4HCO3缓冲液（pH 8.0）中，各加入终浓度10mmol/L的DTT溶液，在37℃水浴中反应4h，再加入终浓度25mmol/L的IAA溶液在室温下置于暗处反应1h。然后稀释样品至其中尿素浓度1mol/L后，按照胰蛋白酶与蛋白质质量比1∶50加入胰蛋白酶，37℃孵育12～18h，微波加热中止酶切反应。表1不同比例的10种标准蛋白质混合物的配制（略）2.2.2RPLCLTQ反相色谱条件毛细管液相色谱仪所用毛细管色谱柱为PicoFritTMBioBasicC18反相柱(100mm×75μmi.d.,5μm,ThermoHypersil公司)。色谱洗脱采用二元泵高压混合的梯度洗脱方式。洗脱组分经过ESI离子源直接进入质谱进行分析。流动相：A为0.1%FA80%水溶液），B为0.1%FA80%A溶液。洗脱条件：2%～40%B，90min；40%～100%B，15min，然后以100%A溶液平衡色谱柱30min。流速为200nL/min；进样体积为20μL。2.2.3RPLCLTQ质谱分析条件质谱仪为电喷雾线性离子阱质谱仪（LTQMS）。雾化N2气流速12L/min；碰撞气为高纯氩气（99.999%）；喷雾电压(sprayvoltage)3.2kV;毛细管温度160℃；毛细管电压2.8kV。数据依赖采集条件：质谱分析采用一级质谱的数据依赖的二级质谱扫描模式。利用动态排除功能,.freelin。二级串联质谱母离子窗口为4Da，归一化碰撞能量为35%；质谱的一级全扫描质荷比范围是m/z400～4000。本实验所用M+H+均为单同位素峰质量数。2.2.4数据检索参数设置质谱采集的原始文件首先通过Bioascot（版本2.1）检索。设定肽段序列氨基酸可变修饰为甲硫氨酸氧化（M+15.99Da），设置半胱氨酸的氨乙酰化修饰(C+57.02Da)为固定修饰；第二次检索时增加肽段氨基末端残基可变修饰：氨基末端Q/E/CAM_C的环化（Q17.03Da，E18.01Da，CAM_C17.03Da）修饰。设定蛋白酶为胰蛋白酶，酶切方式为全酶切，最大漏切位点2个，一级母离子误差1.5Da，二级碎片离子误差0.8Da。检索蛋白质数据库为自建标准蛋白质数据库。检索肽段可靠度设置为95％。3结果与讨论3.1BSA胰蛋白酶酶切肽段混合物中的肽段环化修饰现象不考虑漏切位点时，BSA胰酶酶切肽段中500Da、并以Q/E/CAM_C残基起始的肽段分别有3、5和4个。质谱分析的结果显示，这12个肽段中的8个都发生了肽段氨基端环化修饰，鉴定结果如表2。其中，原型检索设置的修饰为固定修饰：半胱氨酸的氨乙酰化；草药可变修饰：甲硫氨酸氧化。环化检索设置的修饰为固定修饰：半胱氨酸的氨乙酰化； 可变修饰：甲硫氨酸氧化和氨基末端Q/E/CAM_C的环化。表2BSA中发生环化修饰的肽段（略）添加环化修饰为可变修饰，对数据进行数据库检索，比添加修饰前多解析了27个二级质谱图，共找到10条肽段发生了环化修饰。一些MS/MS图谱得到很好的匹配，其中7条环化修饰后的肽段最高得分都超过了原型肽段，蛋白质的得分也由8593提高到9403。而且，反应常是不完全的，出现环化肽段和原型肽段并存于样本中的现象（如图1），并且由于氨基端的成环，使肽段的疏水性增加，在反相色谱上的保留行为发生了改变，保留时间普遍延迟（见表2）。3.210种标准蛋白质混合物的环化修饰现象不考虑漏切位点时，10种标准蛋白质的胰酶酶切肽段中500Da、并以Q/E/CAM_C残基起始的肽段分别有7、19和10个，质谱鉴定到的发生环化的肽段数目分别是3、2和6个，具体的肽段如表3所示。综上发现，肽段氨基末端以谷酰胺（Q）和氨乙酰化修饰的半胱氨酸（CAM_C）起始时，40%以上的肽段都可能发生氨基末端残基的环化修饰，统计结果如图2所示。有研究表明，起始残基为Q的肽段氨基端会发生脱氨基的环化修饰反应6，形成2吡咯烷酮5羧酸残基；起始残基为E的肽段氨基端会发生脱水的环化修饰反应7，形成焦谷氨酸残基。而经过氨乙酰化修饰的半胱氨酸C8,9，在化学结构上与Q残基相似，也发生了脱氨基的环化修饰，形成了5氧硫吗啉3羧酸残基（各反应原理如图3所示），这与本实验结果相吻合。表310种标准蛋白质酶切肽段混合物的环化修饰（略）Garden等10认为，肽段氨基末端发生的环化修饰是在样品制备（酶切）、HPLC分离或随后的质谱离子化（ESI或MALDI）过程中产生的一种人工产物。但是，文献11报道了某些蛋白质和多肽的氨基端Q残基也可经历自发环化形成吡咯型谷氨酸，并且这种环化修饰与蛋白质或多肽的生物活性相关12。而Huang等13发现，环化修饰也可是一种酶促反应(谷氨酰基环化酶等)。4结论在进行质谱数据检索时添加上Q/E/CAM_C的环化修饰，可给蛋白质的鉴定分析提供更准确、完整的信息。但许多肽段的环化修饰是不完全的，在同一样本中修饰与非修饰两种状态常同时存在，并且环化后的肽段在反相色谱上的保留时间会延迟，结合此类色谱和质谱的信息，可以帮助得到更可靠的蛋白质鉴定结果。肽段环化的程度可能受操作条件的影响，并可能与蛋白质的序列有关。如文献14报道，免疫球蛋白γ抗体中氨基端谷氨酸的环化在pH 6.2环境下进行缓慢，而在溶液pH4和pH8时形成较快；Khandke等15用链状球菌PepM49蛋白酶切肽段研究发现，与NH4HCO3缓冲体系相比，谷酰胺残基起始的肽段在磷酸盐缓冲液中氨基端环化会加速。有关氨基端残基的环化修饰更详细的信息还需要更深入的研究。【