食品微生物检验 考试复习

第一章绪论一、概述1、微生物的基本特点：体积小，比表面积大；吸收多，转化快；生长旺，繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多二、食品微生物检验1、概念：运用微生物的理论与技术，研究外界环境和食品中的微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响，建立食品微生物学检验方法，确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性学科。“食品卫生”与“食品安全”：1986年，世界卫生组织在题为《食品安全在卫生和发展中的作用》的文件中，曾把“食品卫生”与“食品安全”作为同义词，定义为：“生产、加工、储存、制作食品过程中确保食品安全可靠，有益于健康并且适合人消费的种种必要条件和措施”。2、意义（一）有害微生物对人类和生产的影响：1.引起食品变质2.引起食物中毒3.导致人体患病(二)食品微生物检验的意义1、是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据。2、可以判断食品加工环境及食品卫生的情况，为卫生管理工作提供科学依据。3、可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生。4、保证产品的质量，避免不必要的损失3、研究特点1）研究对象以及研究范围广2）涉及学科多3）实用性及应用型强4）采用标准化4、研究范围1）生产环境（车间用水、空气、地面、墙壁等）；2）原辅料（食用的动、植物，添加剂等）；3）食品加工、储藏、运输、销售等环节；4）成品食品。5、研究任务1）研究各类食品中微生物种类、分布及其特性；2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量；3）研究食品中致病性、中毒性、致腐性微生物；4）研究微生物与食品保藏的关系；5）研究各类食品中微生物的检验方法及标准。6、食品微生物检验的发展过程1）致病菌检测阶段2）指示菌检测阶段（1指示菌：在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。（2特点：在环境中存在的数量多，易于检出；检测手段与方法简单；具有一定的代表性。 （3）检验目的：以指示菌在检验样品中存在与否以及数量的多少为依据，根据检出的情况，判断样品被污染的程度，间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁，对照国家标准，对检品的食用的安全性作出评价。（4）类型评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性指标：菌落总数、霉菌、酵母菌等；特指粪便污染指标：大肠菌群、肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等；其他指示菌：包括某些环境不能检出的菌类。菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，经过处理，在一定条件下培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，所得1g或1mL或1cm2检样中所含细菌菌落数量即为菌落总数，常用CFU（菌落形成单位，clonyformingunit）表示。大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。这些细菌均来自人和温血动物的肠道。3）微生态制剂检测阶段以乳酸茵、双歧杆菌为主，以调节生态平衡为目的的各种微生态制剂，检验其菌株的特性和数量。4）现代基因工程菌和尚未培养菌的检测阶段5）快速检测阶段化学比色分析法、酶联免疫法（ELISA)、免疫胶体金试纸检测法。生物芯片、传感器、色谱质谱检测仪。特点：实验准备简化、试剂少；样品前处理简单；分析方法简单、准确、快速。第一章食品微生物检验技术第一节培养基在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基。一、培养基中的主要成分及其作用（一）营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水。1、常用的N源物质：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏2、糖、醇类物质单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖　双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖多糖：淀粉、纤维素、菊糖醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油（二）水用蒸馏水，不能用自来水。（三）凝固剂琼脂、明胶、血清等。要求：清一色、杂质少。（四）抑制剂1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率。2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等。染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红。胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐。抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素。（五）指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。 二、培养基的类型由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。（一）根据培养基的物理状态来区分1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养，大型生产、科研等。2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。3、半固体培养基：观察微生物的动力，菌种鉴定等。4、脱水培养基：含有除水分外的一切成分的商品培养基，使用时加水灭菌。（二）根据培养基的用途来区分1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。2、选择培养基：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。分离培养用的培养基名称用途SS琼脂培养基沙门氏菌和志贺氏菌属分离HE琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂培养基绿脓杆菌分离鉴别XLD琼脂培养基志贺氏菌、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基霍乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离3、鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。名称用途蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（TST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化钾基础培养基沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验三、培养基制备的基本方法和注意事项1、培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间，制备的日期和制备者等。2、培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于旁侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。3、培养基各成份的混合和溶化 指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。2、培养基pH的初步调正灭菌后pH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.1～0.2；pH调整后，还应将培养基煮沸。3、培养基的过滤澄清液体培养基可用滤纸过滤法。琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。4、培养基的分装斜面：1/５管半固体培养基：1/3管高层斜面：1/4～1/3管平板：13~15mL5、培养基的灭菌（1）含糖类或明胶的培养基：113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。（2）无糖培养基：121℃灭菌15~20分钟。（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。8、培养基的质量测试（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等,均应挑出弃去。并测定其最终pH。（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好,应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。　　9、培养基的保存（1）基础培养基不能超过两周。（2）生化试验培养基不宜超过一周。（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。培养基配制——器材：培养基、玻璃器皿、天平、药匙培养基配制——仪器：灭菌锅、无菌操作台培养基配制——装水：以量桶装取适量蒸馏水于玻璃容器中；于玻璃容器上标示培养基名称。培养基配制——称药：放上秤药纸并归零；以秤药匙舀出适当量培养基培养基配制——溶解培养基：倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上注意事项——配药结束：清理配药桌面与天平；清洗称药匙，擦干放回；药品放回药品柜培养基配制——分装：调整分注器刻度；分装试管；盖上试管盖培养基配制——灭菌：放入灭菌锅灭菌注意事项：拿灭菌后物品记得带耐热手套培养基的配制–平板培养基：灭过菌的固态培养基于无菌操作台內倒制平板培养基第二节微生物检验的基本操作技术一、无菌技术（一）什么是无菌技术？指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境：无菌室、无菌柜、超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间。（2）无菌室的消毒和防污染：每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）。每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）。每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次。2、超净工作台 超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10－15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等。消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。2、进入无菌室前的准备（1）定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）用紫外线灭菌处理30~60分钟；（3）检查无菌器材是否完备；（4）洗手消毒；（5）手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放；（3）在火焰正上方操作；（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，动作应轻、准；（6）不能用嘴直接吸吹吸管；（7）带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。无菌操作——取菌技巧(从斜面取菌）1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红，后端铁棒部分过火。2.试管前端过火。3.打开试管盖。4.试管倾斜，放入接种环。无菌操作——取菌技巧(从平板取菌）1.自平板上取单一菌落(方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入；方法二：平板反面拿起)。无菌操作——取菌技巧（从液体内取菌）1.调整移液枪刻度。2.插上灭过菌的枪头(用力插紧)。3.按钮压至第一段(不可压至最底)。4.深入液面下2-4mm。5.慢慢释放按钮，即可吸取液体。无菌操作——接菌技巧1.试管前端过火。2.打开试管盖。 方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌。方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液。方法三：以移液枪吸取菌液，按钮压至最底排出菌液。无菌操作——错误示范试管直放，空气中菌体容易掉入。操作时距离火源远。移液枪倒放，菌液容易流入。注意事项——生物性废弃物：放在正确位置以便灭菌。二、微生物的接种与分离技术（一）接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法接种和分离工具：接种针；接种环；接种钩；玻璃涂棒；接种圈；接种锄；小解剖刀常用的接种方法有以下几种：1）划线接种：在固体培养基表面作来回直线的移动。2）三点接种：把少量微生物接种在平板表面上成等边三角形的三点，让他们各自独立形成菌落。3）穿刺接种：用接种针蘸取少量菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。4）浇混接种：将待接的微生物先放到培养皿中，然后倒入冷却好的培养基，迅速轻轻摇匀，待平板凝固后，置于适宜温度下培养。5）涂布接种：先倒好培养基，让其凝固后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面做左右涂布，让菌液均匀分布。6）液体接种：从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中。7）注射接种：用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内。8）活体接种：用于培养病毒或其它病原微生物，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。(二)分离纯化１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50℃左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒温箱中培养。单一细胞经多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。２、涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃涂棒把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。三、微生物的培养方法（一）根据培养时是否需要氧气分好氧培养；厌氧培养：最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。（二）根据培养基的物理状态分固体培养；液体培养第三节微生物常规鉴定技术一、形态结构 主要通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。二、培养特性：1）细菌的培养特性：固体培养基：观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性。液体培养基：表面生长情况（是否有菌膜、菌环出现）、浑浊度如何、是否有沉淀出现等。半固体培养基：观察细菌是否有运动、扩散情况。2）酵母菌的培养特性：固体培养基：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落与细菌很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养基：液体培养基也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。3）霉菌培养特性：霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在适宜条件的培养基里菌丝无限伸长，沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同的颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面的颜色常常不同。三、生理特性试验1、适应环境特性试验：各种微生物对生活的环境均有不同的适应性，对这些环境因素的适应性实验是微生物检验研究的基本内容，也常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。（1）生长温度试验：各种微生物进行正常的新陈代谢均要有一定的生长温度范围，如果环境温度超出这个范围，便会对微生物产生不利影响，引起微生物生长停滞甚至大量死亡。试验方法：将微生物分别接种于5、10、20、30、37、41、45、55℃培养箱中培养1-2d，观察不同温度下各个微生物的生长情况，确定生长温度范围和最适温度。同时还要做一个空白试验，即准备一只未接种的培养基试管在37℃下同时培养，若空白试管未见异常，则试验结果有效。（2）耐热试验：测定生物在不同温度下的抵抗能力。普通微生物的营养体在60-70℃可存活30min，在100℃时几分钟即可死亡，而细菌芽孢及真菌孢子等对热的抵抗力就很强。试验方法：将纯培养物各取0.1mL，接种于一系列肉汤培养基中，分别置于50、53、56、60、65、70、80、90℃等不同的高温水浴中，隔水加热10min或30min后立即浸入冷水中冷却，然后一起放入37℃培养箱中培养24h，取出后观察各管中微生物生长情况。以判断致死最低温度和致死时间。空白：同生长温度试验。（3）生长pH实验：环境酸碱度对微生物生长发育有很大的影响，每一种微生物都有各自的生长pH范围，可划分为最高、最适、最低生长PH。大多数细菌和放线菌的最适生长pH在7.2-7.6之间，真菌类则大约在3.0-6.5的范围内生长。试验方法：按照不同的实验菌种选择适宜的液体培养基，用酸或碱调整培养基的pH（5.4，5.6,5.8……10.0等），然后将菌种分别接种于上述培养基中于37℃培养1-2d，定时观察各个微生物的生长情况。判断微生物的最高、最适、最低生长的pH范围。（4）耐盐实验：观察渗透压对微生物生长影响。不同微生物对盐的浓度要求不同，过高的盐浓度所形成的高渗透压会对微生物造成不利影响。试验方法：将普通肉汤培养液调成不同浓度的盐溶液（0、1、2、4、6%....10%等）经过灭菌后分别接种待试菌种，然后在37℃ 培养，观察微生物生长情况。判断菌生长的氯化钠浓度范围及最适宜盐浓度。2、生化试验：指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。（一）生化试验的方法1）在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pH值变化。2）在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3）根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4）根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（二）生化试验的注意事项1）待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。2）待检菌应是纯种培养物。3）遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4）应做必要的对照试验。5）提高阳性检出率，至少挑取2~3个待检的疑似菌落分别进行试验。（三）生化试验的范围从食品质检的角度，主要是试验各种糖类能否作为碳源和能源被利用，对于氮源主要检验其对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、铵盐及硝酸盐的利用能力。（四）生化试验1）糖醇类代谢试验①糖酵解试验（糖醇类发酵试验）原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。检视培养基颜色有无变化，小倒管中有无气泡。一般常用的指示剂为：酚红、溴甲酚紫、溴百里酚蓝（红变黄）（紫红变黄）（蓝变黄）。结果观察和记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“⊕”表示不产酸不产气，阴性，以“-”表示②葡萄糖氧化发酵（O/F）试验原理：细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。　试验方法：取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4天，每天观察结果。结果观察与记录：封油管未封油管发酵型产酸（黄色）产酸（黄色）氧化型不产酸（蓝色）产酸（黄色）产碱型不产酸（蓝色）不产酸（蓝色）③乙酰甲基甲醇试验（V-P试验） 原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。试验方法——奥梅拉法：将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养48h，每1mL培养液加奥梅拉O’Meara试剂（加有0.3%肌酸或肌酸酐的40%氢氧化钠水溶液）0.1mL，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h，或在48~50℃水浴放置2h后判定结果。结果观察与记录：（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P+（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P—④甲基红试验（M.R试验）原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红呈桔黄色，为甲基红试验阴性。试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。结果观察与记录：（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。2）氮源代谢试验①靛基质（吲哚）试验原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。　试验方法：将待检菌小量接种于培养基中，于36±1℃培养24~48h时后，沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5mL覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。结果观察与记录：呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+；无红色者，为阴性反应，记—②尿素酶试验原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚酞指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。试验方法：挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇匀，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。结果观察与记录：培养基变成粉红色，为阳性，记+；培养基颜色不变，为阴性，记—③氨基酸脱羧酶试验原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸产生脱羧作用,生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性，如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。结果观察与记录：培养基变成红色，为阳性，记+；培养基变成黄色，为阴性，记—④硫化氢（H2S）试验 原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或亚铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。试验方法与记录：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。培养基底部呈黑色，为阳性，记+；培养基底部无黑色，为阴性，记-⑤苯丙氨酸脱氨酶试验原理：苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物。试验方法：加氯化铁试剂结果记录：生长于苯丙氨酸培养基上的菌苔出现绿色，记为+2）三糖铁(TSI)试验测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗糖的分解、产气和产硫化氢情况。原理：如果细菌可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。如果细菌能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于三糖铁斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。三糖铁琼脂成分：蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、葡萄糖、氯化钠、硫代硫酸钠、硫酸亚铁铵、酚红、蒸馏水。记录：斜面：黄色为阳性，记为+；红色记为-底面：黄色为阳性，记为+；红色记为-产气：产气为阳性，记为+；不产气记为-产硫化氢：培养基底部变黑为阳性，记为+；培养基底部不变黑，记为-。4）呼吸酶类试验（氧化酶试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、氰化钾试验）5）毒性酶类试验（溶血试验、链激酶试验、卵磷脂酶试验、血浆凝固酶试验）四、血清学试验定义：是将抗原和抗体在体外血清环境中特异性结合的实验。常见的类型主要有：凝集反应、沉淀反应、溶解反应、补体反应和中和反应。特点：特异性强、灵敏度高。1、抗原与抗体：（1）抗原：是一种能够刺激人体或动物机体的免疫系统发生免疫应答，产生特异性抗体，并在其体内或体外与相应的抗体发生特异性结合的物质。抗原的性质：一般为大分子胶体，相对分子量在10万以上，且分子量越高，其抗原性越强；大多数天然抗原物质都是蛋白质，但并非所有蛋白质都具有抗原性；抗原都具有高特异性，其特异性与其本身的化学结构有关；异质物质才具有抗原性，并且自身与抗原物质的亲缘关系越远，抗原性就越强。（2）抗体：是抗原刺激机体免疫系统而引起的免疫应答的产物之一，是一类免疫性球蛋白。抗体的性质：抗体是球蛋白，能与相应的抗原结合；抗体的相对分子量普遍较抗原大，在15万-100万之间；不同动物体内的球蛋白不同，因此，同一种抗原刺激不同动物所产生的抗体也会不同。2、诊断血清 （1）诊断血清：将已知的抗原注射于动物体，使其产生相应的抗体，采出动物的血液，分离出含有大量抗体的血清，称为诊断血清（或抗血清、免疫血清）。（2）诊断血清类型：抗O血清：用菌体抗原（O抗原）免疫动物后所获得的血清。抗H血清：用鞭毛抗原（H抗原）免疫动物后所获得的血清。表面抗原血清：用含有表面抗原的菌体免疫动物后所获得的血清。单因子血清：只含有一种特异性抗体的血清。复因子血清：含有两种抗体的血清称为复因子血清。多价血清：含有两种以上抗体的血清称为多价血清。（3）诊断血清的使用与保存：保存：2~10℃冰箱；无菌取用，有效期2年。3、凝集试验（1）颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。（2）凝集试验的方法：1）直接凝集法：颗粒性抗原与相应抗体直接结合。　2）间接凝集法：可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应的抗体（抗原）作用。直接凝集试验：玻片凝集法原理：用已知抗体作为诊断血清，来检测未知抗原,以鉴定相应的抗原。方法步骤：①于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作为阴性对照。②用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。③轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，观察结果。（凝集者为+）第三章）第三章食品微生物的基本程序一、食品微生物检验的一般一般步骤菌落总数样品保存样品处理结果报告大肠菌群样品采集分离培养染色镜检选择参检验前致病菌纯生化验验考菌群的准备化血清学试验增菌分离培养动物试验二、检验前的准备1、准备好所需的各种仪器。2、按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。3、准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择培养基。4、做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min。5、工作衣、鞋、帽等灭菌后备用。6、工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。 三、样品的采集（一）采样的步骤采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明（二）采样的原则（要求）1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、在保存和运送过程中保证样品中微生物的状态不发生变化.5、采样标签应完整、清楚。（三）食品微生物检验的采样方案ICMSF（国际食品微生物规范委员会）取样方案；美国FDA的取样方案；世界粮农组织（FAO）取样方案；我国的食品取样方案。每批货物的抽样数量不得少于5件，对于需要检验沙门氏菌的，不少于8件。（四）食品微生物检验采样方法1、液体样品采样方法充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取，注入无菌盛样容器。2、半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。3、固体样品采样方法（1）大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；（2）小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。（3）若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。4、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。5、生产工序监测采样1）车间用水：从车间各龙头采样；2）车间台面、用具及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。3）车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。（五）采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况等。四、样品的送检要求1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。五、样品的处理方法（一）液体样品的处理1.瓶装液体样品的处理 用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。2.盒装或软塑料包装样品的处理将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理1、捣碎均质法均质就是指物料的料液在挤压、强冲击与失压膨胀的三重作用下使物料细化，从而使物料能更均匀的相互混合.将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。2、剪碎振摇法将中样剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3、研磨法将中样剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4、整粒振摇法直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。5、胃蠕动均质法将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中，开机（均质器）均质。（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。六、样品的检验（一）收样：1、收到样品后逐一核对验收，登记编号；如2004年收到的50号样品，编号可写成：20040050。2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。（二）检验1、选择检验方法：国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等。2、检验要求（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写“检测报告底稿”。（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。3、样品的保留（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品； （3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理；（4）微生物检验不进行复检。七、检验结果的报告1、经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份。2、将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。3、收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。4、在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。第四章食品微生物检验指标常用的微生物检验指标为三项，即细菌总数（主要是菌落总数）、大肠菌群最近似数和致病菌的检测。第一节食品中菌落总数的测定一、菌落总数菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是数以万计相同的细菌集合而成。细菌数量的表示方法：菌落总数、细菌总数菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，经过处理，在一定条件下培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，所得1g或1mL或1cm2检样中所含细菌菌落数量，常用CFU（菌落形成单位，clonyformingunit）表示。按照国家标准方法规定，即在需氧条件下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板细菌菌落上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此，菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分细菌的种类。细菌总数：指在一定数量和面积的食品样品，经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数，其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。二、菌落总数的卫生学意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量食品中细菌数量越多，说明食品被污染的程度越重、越不新鲜、对人体健康威胁越大。在我国的食品卫生标准中，针对各类不同的食品分别制定出不允许超过的数量标准，借以控制食品污染程度。2、预测食品存用的期限长短食品中细菌数量越少，食品存放的时间就越长。如菌落总数为105cfu/cm2的牛肉在0℃时可存放7天，而菌落数102cfu/cm2时同样条件下可存放18天。三、菌落总数测定的方法平板倾注法：平板表面涂布法；平板表面点滴法四、平板倾注法测定菌落总数1、检验步骤(程序)：检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果1）检样稀释与培养以无菌操作，将检样25g剪碎后，放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，充分振摇，制成1：10的均匀稀释液。固体样品加入稀释液后，最好用灭菌的均质器以8000-10000r/min的速度处理1min。 用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，振摇，混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1mL灭菌吸管。根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2-3个适宜的稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基注入平皿12-20mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入1mL不含样品的稀释液中作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平皿，置于（36±1）℃恒温培养箱内培养（48±2）h。培养条件：普通食品：37℃，48h清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37℃，24h水产品：30℃，48h平板菌落计数法测定食品中的菌落总数，一般采用中温培养，是因为这些食品卫生的要求是严格防止消化道传染病原菌和食物中毒病原菌的污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因而测定细菌数时采用中温培养是比较合理的。2）菌落计数和报告到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板的平均菌落数。计算出原始样品中每g（mL）中的菌落数，进行报告。平板菌落的选择（1）选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定的标准。一个稀释度使用两个平皿，应选择两个平板的平均数。（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。稀释度的选择（1）选取菌落数在30～300之间的平板，若有二个稀释度均在30～300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则报告其中稀释度较低的平皿菌落数。（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告。（4）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。菌落数的报告1）菌落数在1～100时，按实有数字报告。2）如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为缩短零的个数，以10的指数表示。3）固体检样以克（g)为单位报告，4）液体检样以毫升（mL）为单位报告，5）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。2、检验注意事项1）对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板； 2）吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3）进行稀释时，吸管口不得与稀释液接触;4）为防止细菌增值及形成片状菌落，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。5）稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。第二节食品中大肠菌群的检验一、大肠菌群的定义与组成1、大肠菌群的定义指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。2、大肠菌群的组成埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和肠杆菌等。二、大肠菌群的测定意义粪便污染的指示菌：大肠菌群或大肠杆菌。1、以大肠菌群作为粪便污染指示菌原因1）在粪便中数量极高；2）在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3）检测方法简便容易。2、大肠菌群的测定意义（1）判断食品是否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。三、大肠菌群的生物学特性形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽孢杆菌。发酵乳糖产酸产气。培养特性：1、在伊红美兰(ＥＭＢ)琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽。2、在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。四、大肠菌群数量的表示方法以每100g或100mL检样中大肠菌群最近似数（MPN)来表示。MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。五、大肠菌群检验方法及操作方法1、检验方法：国家标准：三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)我国统一采用一个样品，三个稀释度各接种3个管，乳糖发酵、分离培养、复发酵试验，然后根据大肠菌群MPN检索表报告结果。2、培养基与试剂75%乙醇、生理盐水、乳糖-胆盐发酵管、伊红美兰（EMB)培养基、乳糖发酵管、革兰氏染色液等。3、检验程序（作业本上）4、操作方法1）采样及稀释 以无菌操作，将检样25g（mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，充分振摇，制成1：10的均匀稀释液。固体样品加入稀释液后，最好用灭菌的均质器以8000-10000r/min的速度处理1min。用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，振摇，混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1mL灭菌吸管。根据食品卫生要求或对样品污染情况的估计，选择3个相邻的稀释度，每个稀释度接种管。2）乳糖初发酵实验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，每个稀释度接种3管，置于37℃培养24h。若所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告大肠菌群阴性；如有产气者，则接下试验。3）分离培养将产气的发酵管接种于伊红美兰平板上，置于37℃培养18-24h，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4）乳糖复发酵试验（证实试验）挑取可疑菌落进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于37℃培养24h，观察产气情况。凡发酵乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。5）报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL大肠菌群的MPN数。5、检验注意事项1）对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。2）挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。3）胆盐可抑制样品中的一些杂菌，有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也有抑制作用。不可用其他胆盐代替指定的胆盐。六、大肠菌群快速检验（一）TTC显色法使用含有TTC(氯化三苯四氮唑)的乳糖发酵培养基，接种方法与常规法相同。接种后于35℃～37℃培养18h～24h，观察TTC乳糖培养基的显色和产气现象来判断大肠菌群，然后根据阳性管数，查大肠菌群MPN检索表，报告大肠菌群数。（二）疏水网膜法以疏水物质在5cm2、孔径为0.45µm的滤膜上，横竖各刻印40条线，将滤膜分为1600个小格，以疏水线作为栅栏，防止菌落扩散；样品稀释液首先通过5µm的前滤器过滤，再通过0.45µm的滤膜过滤；将滤膜置于选择培养基上培养24h～48h，阳性菌落即可通过显色而进行鉴定，大肠菌群呈蓝色；根据阳性菌落数查查MPN表即可得出单位样品中大肠菌群的MPN。（三）DC（去氧胆酸钠）半固体试管法（1）选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取1mL放入灭菌试管中。（2）将溶化并冷至50℃左右的DC半固体培养基加入上述试管中，每管3mL。立即混合，凝固后于37℃培养18－24小时。(3)判定标准和记录：a培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。记录为++；b培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为+；c培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为±； d培养基为绿色，记录为—。判定为a、d反应结果；记录阳性管数，查MPN表并报告之。若为b、c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查MPN表，并报告之。（四）食品饮料大肠菌群快速检验（纸片法）纸片经含有溴甲酚紫和TTC成分的培养基浸渍。使用方法：1.样品稀释同国标法。2.接种：饮料和饮用水采用原液、1:10、1:100三个稀释度，固体食品采用1:1、1:10和1:100三个稀释度。用1毫升灭菌吸管吸取1毫升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。3.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36℃下培养15－24h观察结果。4.结果判定:1）纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性。2）纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性。3）纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围没有黄圈者阴性。4）酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性。5）记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。餐具大肠菌群快速检验(纸片法)使用方法：1、采样6—10份1）碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。2）筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。2、将已采样的纸样置于37°C培养15小时纸片在黄色背景上出现红色斑点为大肠菌群阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。第三节致病性微生物的检验一、食品中常见的致病性微生物1、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：沙门氏菌、葡萄球菌、副溶血性弧菌，溶血性链球菌、口蹄疫病毒等。2、能产生毒素并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌等都会产生毒素。二、致病性微生物的检验——按照国家统一的方法进行检验。基本程序：检样→处理→增菌培养→分离培养→生化试验→血清学鉴定→报告第四节其他食品微生物检验指标一、酵母菌和霉菌酵母菌、霉菌在自然界广泛存在。可以通过生产的各个环节污染食品。酵母菌有：假丝酵母属、圆酵母属、酵母属、隐球酵母属，霉菌有：青霉属、芽枝霉属、念珠霉属、毛霉属等。二、霉菌和酵母菌的计数检样→处理→稀释→平板分离培养→菌落计数→报告（一）样品稀释1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。 2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。（二）培养倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。（三）计数选取菌落数10～15之间的平板进行计数（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定）三、常见产毒霉菌的鉴定霉菌中有些属可产毒素，主要是青霉属、曲霉属和镰刀菌属等。其分离鉴定对食品的卫生学评定有一定意义。检验程序：菌落的观察→斜面观察→制片→镜检附培养基配方：伊红美兰琼脂培养基：蛋白胨20g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂17g，2%伊红Y溶液20mL，0.65%美兰溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH7.1。麦康凯培养基：蛋白胨20.0g；乳糖10.0g；牛胆盐5.0g；氯化钠5.0g；中性红0.03g 琼脂14.0g；pH值7.1±0.2乳糖胆盐发酵管：蛋白胨20.0g；乳糖10.0g；牛（或猪、羊胆盐）5.0g；氯化钠5.0g溴甲酚紫0.4g；琼脂14.0g；PH值7.4；蒸馏水1000mL第五章食物中毒性微生物的检验第一节食物中毒概述1、食物中毒的定义指摄入了含有生物性、化学性有毒、有害物质的食品或者把有毒、有害物质当作食品摄入后出现的非传染性(不属于传染病)的急性、亚急性疾病。食物中毒是一种食源性疾病。暴饮暴食所致急性胃肠炎、食源性肠道传染病和寄生虫病、食物过敏、有毒食物的慢性损害和寄生虫病不属于食物中毒。2、食物中毒的特点（1）潜伏期短，多为集体暴发；（2）临床表现相似，多以胃肠道症状为主；（3）发病与某种食物有关，不食者不发病；（4）一般无传染性。（5）发病季节性强。3、食物中毒的分类（1）细菌性食物中毒（2）真菌性食物中毒（3）有毒动植物性食物中毒（4）化学性食物中毒4、细菌性食物中毒1)细菌性食物中毒的定义－指因摄入细菌或细菌毒素的食品引起的食物中毒。－细菌性食物中毒在国内外都是最常见的一类食物中毒。2)流行病学特点－发病率及病死率。 －发病季节性明显。全年皆可发生，但以5-10月较多。－引起细菌性食物中毒的主要食品。主要食品：动物性食品，如肉、鱼、奶和蛋。其次：植物性食品，如剩饭、米糕、面类、发酵食品等。3)细菌性食物中毒发生的原因及条件食物被污染：在屠宰或收割、运输、贮藏、销售过程中受到致病菌的污染；发生细菌繁殖：被致病菌污染的食物在较高的温度下存放，食品水分，pH及营养条件使致病菌大量生长繁殖或产生毒素；食品在食用前未被彻底加热：污染食品未烧熟煮透或煮熟的食物受到生熟交叉污染或食品从业人员带菌者的污染；4)细菌性食物中毒的种类－感染型食物中毒：进食大量活的细菌的食物，引起人体消化道的感染而造成的中毒。－毒素型食物中毒：细菌在食物中繁殖产生毒素而引起的食物中毒。－混合型食物中毒：细菌对肠道的侵入及其产生的肠毒素的协同作用而引起的食物中毒。既有感染型又有毒素型。5.预防原则(1)加强食品卫生的监督与管理，防止食品在加工、运输、销售、贮存过程中被污染；(2)低温保存食品，控制细菌繁殖和毒素形成；(3)食品加热充分，彻底杀灭病原菌和破坏毒素；(4)加强对食品加工从业人员的管理和卫生培训，进行就业前和定期体检。第二节金黄色葡萄球菌及其检验葡萄球菌在自然界中广泛存在于空气、土壤、水及物品上，特别是人和家畜的体表及外界相通的腔道检出率都相当高。葡萄球菌常引起人及动物组织器官脓肿、创伤化脓及败血症、食物中毒。一、生物学特性（一）形态与染色革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄状。无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。致病性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）菌体较小、约0.5~1um.,普通0.4~1.2um。（二）葡萄球菌的分类金黄色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；腐生葡萄球菌（三）金黄色葡萄球菌培养特性1、需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、pH7.4。2、对营养要求不高，在普通培养基中生长良好，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛。3、耐盐性强，在含10~15%培养基中能生长。4、在肉汤中是混浊生长，时间过长，有少量沉淀。5、在普通培养基上生长，可形成圆形，凸起，表面光滑，边缘整齐，不透明，直径1～2mm的菌落，能产生黄色色素。（四）金黄色葡萄球菌生化特性可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。在厌氧条件下分解甘露醇产酸。甲基红阳性、V-P弱阳性，多数菌株分解尿素产氨，还原硝酸盐，不产吲哚。（五）抵抗力1）在无芽孢的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。2）湿热80℃30min才能将其杀死。3）5％石炭酸，0.1％升汞中10～15min死亡。耐盐性强。龙胆紫液可抑制其生长。 4）对磺胺类药物敏感性较低。对红霉素、链霉素、氯霉素及四环素较敏感。5）肠毒素的耐热性强。带有毒素的食物煮沸120min方能破坏其毒素。低温下2个月以上方失去毒力。（六）金黄色葡萄球菌能产生的毒素和酶1、溶血毒素：使红细胞溶解，培养时出现溶血环。2、肠毒素：可溶性蛋白。与食物中毒关系密切，耐热性强。100℃煮沸30min不破坏，不受胰蛋白酶的影响，使得人、猫、猴引起急性肠胃炎症状。3、血浆凝固酶：区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志。使血浆中的纤维蛋白凝固在菌体表面。4、杀白细胞素（杀白血球毒素）：破坏白细胞和巨噬细胞，使其失去活性，膨胀破裂。5、溶纤维蛋白酶6、DNA酶：与侵袭力有关。7、透明质酸酶二、金黄色葡萄球菌食物中毒由肠毒素引起。通常是通过患病的动物产品以及患化脓创的食品加工人员及环境因素引起食品污染，条件适宜，就有毒素产生。毒素进入人体后，潜伏期为1-5小时,最短15分钟，有发病快消失快的特点。症状：先唾液分泌亢进，恶心、反复呕吐、腹痛、水样腹泻等，体温不高。病程1天，少死亡，预后良好。三、金黄色葡萄球菌的检验方法：增菌培养法、直接计数法（一）增菌培养法的检验步骤（程序）检样→稀释→7.5%NaCl肉汤增菌培养→血平板、Baird—Parker平板分离→革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验→报告结果（二）检验操作要点1、增菌：7.5%NaCl肉汤，37℃24h，呈均匀浑浊生长。2、平板分离：（1）血平板,37℃24~48h菌落成金黄色，有时为白色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈。（菌体产生溶血毒素：使红细胞溶解）（2）Baird—Parker平板，37℃，24h：主要成分及作用：氯化锂、甘氨酸：抑制非致病性葡萄球的生长；丙酮酸钠：促进葡萄球菌生长；亚碲酸钾：抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色；卵黄：含蛋白质、卵磷脂、脂肪。菌体含卵磷脂酶，可分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱。在B-P平板上的菌落特征：圆形，光滑凸起、湿润、菌落直径2-3mm，呈灰色至黑色，边缘色淡周围为浑浊带，在其外层有一透明带。3、镜检与血浆凝固酶试验1）从B-P平板上挑取金黄色葡萄球菌的菌落进行革兰氏染色镜检。2）如发现葡萄球菌,再做血浆凝固酶试验。3）血浆凝固酶试验：把兔血浆滴加于载玻片的一端，然后挑取菌落与血浆充分混匀、在载玻片另一端以生理盐水代替血浆做阴性对照。混合后立即观察，若出现凝块即为阳性。（二）直接计数法1）采用Baird—Parker平板，1ml样品稀释液分成0.3ml、0.3ml、0.4ml，接入三个平板，涂布，倒置培养。 2）平板上随机挑取五个可疑菌落，做血平板试验、镜检试验，血浆凝固酶试验。3）计算出平板上金黄色葡萄球菌的比例数，计算出每g（ml）样品中的菌数。第三节沙门氏菌及其检验一、概况1、定义：沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，且在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属。2、分类沙门氏菌分为六个亚属，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ亚属。至今已发现2300多个血清型。根据其致病范围，可将其分为三大类群。第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌，乙型副伤寒伤门氏菌。第二类群：对动物有致病性，能引起人类食物中毒，称之为食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等。第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌，但近年也有感染人的报道。3、沙门氏菌食物中毒1）沙门氏菌通过动物（或人）患病、带菌直接污染食品或通过外源性途径污染食品，主要以肉、蛋、乳和鱼类食品等多见。2）中毒症状主要为急性胃肠炎。潜伏期为6-12小时，最长可达24小时，病人临床表现为恶心、头痛、出冷汗、面色苍白，继而出现呕吐、腹泻、发热，体温高达38℃-40℃，大便水样或带有脓血、粘液，中毒严重者出现寒战、惊厥、抽搐和昏迷等，此菌中毒死亡率较低。二、生物学特性1、形态与染色：革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽孢，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。2、培养特性：1）需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，pH7.2~7.4。2）对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成中等大小，直径2-3mm，圆形或卵形。表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落。在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。3、生化特性1）发酵葡萄糖，甘露醇，山梨醇产酸产气（鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）。2）不发酵乳糖，蔗糖，侧金盏花醇。3）V—P试验（-），多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），苯丙氨酸脱氨酶试验（-）。4、抵抗力对热、消毒药及外界环境的抵抗力不强，不耐热，60℃，20－30min即被杀死。冷冻对于沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温环境中仍可存活10个月左右。5、抗原结构与分类1）O抗原：也称菌体抗原，细胞壁最外层的多糖-类脂-蛋白质复合物。耐热，100℃2.5h不被破坏。可将菌体进行分群或组。（A、B、…Z；O1、O2、…)，引起人类疾病的主要在A-F群，且此几个群包含了95%以上的沙门氏菌。2）H抗原：也称鞭毛抗原，鞭毛蛋白。不耐热，60℃15min可破坏。每群（组）沙门氏菌根据H抗原进行分型或种。（分为两相；第一相（特异相）（a、b、…z，z1,z2,…z55），第二相（非特异相）（1、2、…） 3）Vi抗原：也称表面抗原（荚膜抗原），糖脂，具有阻抑O抗原发生凝集的现象，极少数菌含有。不耐热，60℃30min或100℃5min即可破坏。6、致病性沙门氏菌经口进入人体以后，在肠道内大量繁殖，经淋巴系统进入血液。随后，沙门氏菌在肠道和血液中受到机体的抵抗而被裂解、破坏，释放大量内毒素，使人体中毒，出现中毒症状。三、微生物检验（一）基本程序检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化试验初步鉴定→血清学反应最后鉴定→报告1、前增菌目的：冻肉、蛋品，乳品及其它加工食品，菌体受损处于濒死状态。首先需要进行前增菌。即用无选择性的培养基使处于濒死状态的菌恢复活力。方法：食品制成1：10稀释液，用不加任何抑菌剂的培养基：缓冲蛋白陈水(BP)进行增菌。时间一般为4h。干蛋品增菌时间：18-24h。未经过加工的食品，检验沙门氏菌不需前增菌，直接进行选择性增菌即可。2、选择性增菌目的：使沙门氏菌优势繁殖，其他细菌受到抑制。方法：直接进行选择性增菌的食品应制成1：1稀释液以提高检出率，因为食品中的沙门氏茵数量较少。常用培养基：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）；四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、氯化镁孔雀绿增菌液（MM），此培养基中都含有抑制剂。培养基的选择：SC+TTB或SC+MM增菌时间：18-24h。3、平板分离目的：在培养基中加入指示系统，主要使沙门氏茵和埃希氏菌的菌落特征分开。分离培养基：（1）亚硫酸铋琼脂（BS）（含硫化氢指示系统）。（2）DHL、HE、WS、SS琼脂（含乳糖指示系统、硫化氢指示系统）。方法：取一环增菌液分别划线接种于：亚硫酸铋琼脂平板(BS)和DHL琼脂平板(或HE、SS、WS琼脂平板)各一个，于36±1℃分别培养18—24小时(DHL、HE、SS)或40—48小时(BS)。两种指示系统：1）乳糖指示系统：含乳糖和酸碱指示剂，分离沙门氏菌亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和埃希氏菌。Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ亚属：乳糖试验阴性；埃希氏菌阳性，使培养基中指示剂（如：中性红、溴麝香草酚蓝）颜色变化，通过菌落颜色变化可将其分开。2）硫化氢指示系统：含二价铁盐和含硫氨基酸，分离Ⅲ亚属和埃希氏菌。Ⅲ亚属：乳糖试验阳性，其硫化氢试验阳性，埃希氏菌阴性，通过菌落颜色区分，Ⅲ亚属菌落为黑色，或中心为黑色。表2沙门氏菌各属在选择性培养基上的菌落特征4、生化试验鉴定到属目的：经选择性培养，只能说明可能是沙门氏菌，因为肠杆菌科中的某些菌属和沙门氏菌菌落特征相似，埃希氏属中极少部分菌株也不发酵乳糖，故需进一步鉴定。方法：1）典型沙门氏菌的反应：（1）初步生化试验：三糖铁试验（表3）； （2）进一步生化试验：靛基质、pH7.2尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶试验。若反应结果如表4-A1：可判断为沙门氏菌属。2）非典型反应：若以上五项生化试验的结果如表4-A2、B1，补做其他生化试验(如：甘露醇、山梨醇、ONPG试验等），以判定结果。（只有斜面产酸、同时硫化氢阴性的菌株可排除是沙门氏菌）5、血清学分型试验1）目的：确定菌型。市售沙门氏血清有11种因子血清、30种因子血清、57种因子血清和163种因子血清，能分别鉴定个别常见、最常见、常见、所有的沙门氏菌的菌型。2）鉴定原则：先用多价血清鉴定，再用单因子鉴定；先用常见菌型的血清鉴定，后用不常见菌型的血清鉴定。3）方法：采用玻片凝集试验。对于沙门氏菌，先用A-F群的血清鉴定，后用A-F群外的血清鉴定，以确定O群；确定O群后，再用H因子血清确定菌型。根据O因子血清和H因子血清鉴定的结果确定O抗原和H抗原，最后查沙门氏菌抗原表，确定菌型。6、检验结果的报告1）凡血清学鉴定与生化反应均符合者，报告发现沙门氏菌。经检验，×××食品发现有沙门氏菌。2）凡血清学鉴定与生化反应均不符合者，报告未发现沙门氏菌。第四节肉毒梭菌及其检验一、生物学特性1、形态与染色特征：革兰氏阳性短粗杆菌，芽孢呈椭圆型，粗于菌体，位于次极端，使细菌呈汤匙状或网球拍状。有周身鞭毛，无荚膜。2、培养特征1）严格厌氧，可在普通琼脂平板和血平板上生长。2）普通琼脂上形成灰白色，半透明、边缘不整齐，呈绒毛网状、向外扩散的菌落。3）血液琼脂：菌落周围有溶血区。4）肉渣肉汤：呈均匀浑浊生长，产生大量气体。5）发育最适温度为28～37℃，pH为6.8—7.6，产毒的最适pH为7.8—8.2。3、生化特性分解葡萄糖、麦芽糖、果糖，产酸产气。液化明胶，缓慢液化凝固血清，产生H2S（+），不能还原硝酸盐。4、抵抗力1）肉毒梭菌芽孢体抵抗力很强，耐煮沸1-6小时，若藏深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽孢。2）肉毒毒素80℃30分钟或100℃10分钟才能完全破坏。对酸的抵抗力比较强，可在胃液24小时不被破坏，可被胃吸收。5、菌型与毒素根据所产生肉毒毒素的抗原性不同，肉毒梭菌可分为7个型（A、B、C、D、E、F、G），引起人类疾病的以A、B型最为常见。肉毒毒素的毒性比氰化钾强1万倍，是已知最剧烈的毒素，对人的致死量为0.1～1.0μg。二、肉毒梭菌食物中毒肉毒梭菌常出现在未经妥善消毒的肉食罐头或放置时间过长的肉制品，所产的肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，毒素能阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。 在临床上表现以中枢神经系统中毒症状为主。潜伏期长短不一，短者2小时，长者可达数天，一般为12～24小时。早期为瞳孔放大、明显无力、虚弱，晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难。体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为2～3天，也有长达2~3星期之久的。肉毒中毒死亡率较高，据报道可达30％-50％。三、肉毒梭菌检验肉毒毒素的检出被看做是肉毒中毒实验室诊断的根本方法。检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒培养，同时进行毒素检测试验。毒素检测试验结果证明检样中有无肉毒毒素及有何型肉毒毒素存在。1、样品采集食品：按常规；人体：呕吐物、血、胃液。2、样品处理液体：直接接种；固体，半固体：加入等量明胶磷酸盐缓冲液研碎后接种（肉毒素在偏酸的明胶溶液中较稳定）3、增菌培养：接种于庖肉培养基中，30℃厌氧培养5d，若无长，再培养10d，到期无生长，报告“未发现肉毒梭菌”，有生长，取培养液离心，上清液进行毒素检测，沉淀用于分离培养。4、毒素检测1）制备注射液→腹腔注射→检出试验→证实试验2）取离心上清液和胰酶处理液分别注射小白鼠2只，每只0．5mL，观察4天。对照：注射经灭菌的明胶磷酸盐缓冲液注射液0．5mL。如有肉毒毒素存在，小白鼠一般注射后24h内发病、死亡。最快从10min开始。主要症状为竖毛，四肢麻痹，全身瘫痪，呼吸困难，呈现峰腰，最终死于呼吸麻痹。凡能致小鼠发病或死亡者，取上清液3份作证实试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒素诊断血清。混匀，37℃作用30min；l份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10分钟；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可。3份混合液备注小鼠2只，每只0．5mL。观察4天，若含抗血清和加热处理的注射液不致小鼠死亡，未经处理的注射液致小鼠死亡，则可判定食品中有肉毒毒素的存在，必要时进行毒力测定和定型试验。5、分离培养（1）分离培养：选取经毒素检测证实含有肉毒毒素的增菌培养物的沉淀物，加无菌生理盐水稀释至原体积，取菌液划线接种于卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，G型除外。（2）产毒培养：挑取可疑菌落接种于庖肉培养基，30℃培养5d。（3）培养检查：取庖肉培养液接种两个卵黄琼脂平板，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落特征。肉毒梭菌只在厌氧条件下才能生长，并具上述菌落特征。革兰氏染色镜检。6、结果：报告一：检样中含有某型肉毒素。报告二：检样中含有某型肉毒梭菌。报告三：由检样分离的菌株为某型肉毒梭菌。第五节溶血性链球菌及其检验一、生物学特性（一）形态与染色：1）呈球形或卵圆形，直径0.5um-1um ，链状排列（长短不一）。2）革兰氏染色阳性，衰老培养物常成阴性。3）无芽孢、无鞭毛、在血清肉汤中形成荚膜。（二）链球菌分类1、按溶血能力分类：（1）甲型（α）溶血性链球菌（2）乙型（β）溶血性链球菌（3）丙型（γ）溶血性链球菌（4）亚甲型溶血性链球菌与人类疾病有关的大多属于乙型溶血性链球菌。2、按血清学分类1）根据族特异性抗原的不同，将乙型分族：用英文字母区分，共分18族：ABCDEFGHKLMNOPQRST2）根据表面抗原，即型特异性抗原的不同分型：用阿拉伯数字表示，如：A族由于M抗原不同分60多个型。3）（三）培养特性1）多数为需氧或兼性厌氧，少数为微需氧或专性厌氧。2）对营养要求高，普通培养基不能良好生长，需加血清液、腹水等。3）最适温度37℃pH7.4~7.6。4）在血清肉汤培养基中，溶血菌株，形成长链，呈絮状或颗粒状沉淀生长；不溶血性菌株，形成的菌链较短，均匀浑浊生长；半溶血性菌株的生长情况介于两者之间。5）在血平板上，形成灰白色，半透明、表面光滑、圆形突起的细小菌落，直径0.5—0.75mm，针尖大小，菌落周围出现溶血环。(四)生化特性均分糖葡萄糖产酸。对乳糖、甘露醇、水杨苷等的分解因菌株而异。能使牛奶产酸而不凝固，不液化明胶、不分解菊糖。A族菌对杆菌肽敏感。（五）溶血性链球菌可产生的毒素和酶1、溶血素；2、红疹毒素（致热外毒素）；3、透明质酸酶；4、链激酶；5、杀白细胞素；6、链道酶（脱氧核糖核酸酶）、核糖核酸酶、蛋白酶、致病毒素等。（六）抵抗力抵抗力一般不强，D族除外，60℃30min即被杀死，对常用消毒剂敏感。乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。(七)致病性溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。三、检验程序 第六节副溶血性弧菌及其检验一、概况：分布极广的海洋细菌，食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起食物中毒。在非沿海地区，食用受此茵污染的盐渍食品亦常有中毒发生。二、生物学特性（一）形态与染色：革兰氏阴性无芽孢多形态杆菌，单端鞭毛、两端浓染。杆状、棒状、弧状，甚至球状、丝状等。（二）培养特性1）需氧或兼性厌氧。在2～３%NaCl培养基中生长最好，无盐或食盐>11%不能生长。最适温度37℃，pH7.4—8.0。2）固体培养基(SS琼脂)上菌落光滑湿润，无色透明，具辛辣刺鼻的特殊气味，菌落完整，较扁平，如蜡滴，常与培养基紧粘而不易刮离。3）在氯化钠血琼脂上可见溶血环。4）在氯化钠蔗糖琼脂上菌落呈绿色。三）生化特性1）分解Glu产酸不产气，不分解乳糖、蔗糖。2）H2S（－）、V-P（－）、靛基质（－）、精氨酸（－）3）甲基红（＋）、赖氨酸（＋）、溶血＋/-（四）抵抗力：本菌嗜盐畏酸，在2%醋酸中或50%的食醋中1min即可死亡。不耐热，56℃、5min即可杀死；90℃、1min灭活。对低温及高浓度氯代钠抵抗力甚强。（五）致病性：该菌株可产生一种耐热性溶血素，溶解人红细胞，引起人的急性胃肠炎。二、食物中毒症状潜伏期1-26h不等，主要症状有恶心、呕吐、上腹部阵发性剧烈腹痛、频繁腹泻、水样或带粘液便，无里急后重，每日5～6次，体温39℃。重症病人可有脱水、血压下降、意识不清等。病程2～4天，一般预后良好，无后遗症，少数病人因休克、昏迷而死亡。三、检验程序嗜盐性试验：将可疑培养物接种于不同盐浓度（0、3、7、9、11%）的氯化钠胨水中，37℃培养24h，观察生长情况。在盐含量为3～7%生长良好；在0、11%不生长者进行下一步的生化试验。第六章食物传播的病原微生物的检验 动物源性食品在加工、运输、储藏过程中，动物携带的病原微生物会传染给人类，从而引发感染，称食物感染。又称为肉源性食品感染，其中，人畜共患病原微生物在食物感染中占重要比重。人、畜共患病是指脊椎动物与人类之间传播的感染疾病，即由共同病原引起、在流行病学上相互关联的人和脊椎动物的疾病。如：鼠疫、炭疽、霍乱等，主要传染源是鼠类、禽畜及其肉、蛋、乳产品等。内容提要炭疽杆菌及其检验、布氏杆菌及其检验、禽流感病毒及其检验、朊病毒及其检验第一节炭疽杆菌及其检验炭疽(Anthrax)：由炭疽杆菌所引起的人畜共患的急性、热性、败血性传染病。临床表现:皮肤坏死溃疡、焦痂、周围组织广泛水肿及毒血症症状，偶尔引致肺、肠和脑膜的急性感染，可伴发败血症。一、生物学特性（一）形态特征*两端平直的革兰阳性大杆菌。*在体内细菌呈单个、成双或短链排列。有荚膜，不产生芽孢。*在体外细菌呈竹节状长链排列。无荚膜，产生芽孢。无鞭毛。（二）培养特性营养要求不高，在普通平板上生长良好，长成灰白色、表面粗糙的菌落，低倍镜下可见菌落边缘呈卷发状。在血琼脂平板上的形态为：灰白色、半透明、中等大小，常不规则，玻璃样，周围无溶血环。（三）抵抗力*炭疽杆菌对外界理化因素的抵抗力不强，但芽孢抵抗力很强，在干燥状态下可存活20~30年。*直接日光暴晒100h，煮沸40min，干热150℃60min灭活，鬃毛上芽孢12l℃高压需15min。*现场消毒常用20％漂白粉，2％～4％甲醛，0.5％过氧乙酸。（四）血清学特征荚膜抗原：多肽，抑制调理作用，与其侵袭力有关，抗吞噬。菌体抗原：无毒性，有种特异性。保护性抗原：免疫原性。芽孢抗原：免疫原性及血清学诊断价值。（五）致病性传染源：患病的牛、羊、骆驼等食草动物。传染途径：1、经皮肤粘膜：伤口直接接触病菌，若病菌毒力强可直接侵袭完整皮肤。2、经呼吸道：吸入带炭疽芽孢的尘埃、飞沫等。3、经消化道：摄入被污染的食物或饮用水等。进食染菌肉类。致病物质荚膜：抗吞噬作用，利于细菌繁殖;炭疽毒素：很强的外毒素，损伤微血管内皮细胞，感染性休克，死亡; 由Ⅰ因子：水肿因子（EF）、Ⅱ因子：保护性抗原(PA)、Ⅲ因子：致死因子(LF)组成的复合多聚体。特点：单独注入均无毒性，保护性抗原+水肿因子或致死因子分别引起水肿、坏死或死亡。生物导弹技术：炭疽毒素+单克隆抗肿瘤抗体→肿瘤致病机制各种途径*炭疽杆菌芽孢体内繁殖，产生外毒素局部组织出血、坏死、水肿*荚膜抵抗吞噬细胞的吞噬作用细菌扩散邻近淋巴结炎、败血症各组织器官炎症:血源性肺炎、脑膜炎等。损伤微血管、内皮细胞*炭疽毒素释放组织凝血活酶弥漫性血管内凝血（DIC）微循环障碍、感染性休克所致疾病皮肤炭疽(占90%):皮肤出现红斑、丘疹、水疱，周围组织肿胀及浸润，继而中央坏死形成溃疡性黑色焦痂，焦痂周围皮肤发红，肿胀，疼痛不显著。该部位附近的淋巴结肿大且常化脓，伴有发热、头痛、关节痛等。肺炭疽(2%-3%）高热，呼吸困难，可有胸痛及咳嗽，咳粘液血痰。肺部本症常只有散在的细湿罗音。X射线的主要表现为纵膈影增宽。常见胸腔积液。  肠炭疽(3%-6%)：急性起病，发热，腹胀，剧烈疼痛，腹泻，通常为血样便或血水样便。可有恶心、呕吐，呕吐物中含血丝及胆汁。可累及消化道以外系统。脑膜炎型炭疽：可继发于各型，也可能直接发生。剧烈头痛，呕吐，继而出现谵妄、昏迷、呼吸衰竭，脑脊液多为血性。炭疽败血症严重的全身中毒症状，高热、寒战，感染性休克与弥漫性血管内凝血表现，皮肤出现出血点或大片淤斑，腔道中出现活动性出血，迅速出现呼吸与循环衰竭。在循环血液中可检出大量炭疽芽孢杆菌。三、炭疽杆菌的检验１、采样采集皮肤溃疡的渗出物、排泄物、血、胸腹水及脑脊液等标本。采取标本时必须遵循的两条原则:1)尽可能在抗生素治疗开始前采取标本。2)除必要时并在具备操作病毒细菌条件的实验室内，不得用解剖的方式获取标本。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。2、显微镜检查1）复合负染法将标本或悬液滴在载玻片上，立即加等量的炭素墨水，混匀推片。待干燥后滴加95%乙醇数滴，干燥后再以1%结晶紫液染1min，用水冲洗，干后用油镜检查。如果发现在细菌与炭素颗粒之间存在明显的、连续的间隔带，即说明细菌的周围存在荚膜。适用于液体标本（如血液、脑脊液）、悬液标本（如粪便或混有血液的土壤）。 2）荚膜染色法将标本涂片或印片干燥，妥善包装后带入实验室，按常规方法固定：以美蓝染液染色3-5min，水洗、干后镜检。菌呈蓝色、荚膜呈红色。组织印片标本，或制片后无法立即进行显微镜检查，或进行大面积普查时，推荐使用荚膜染色法。3）显微镜检查结果判定来自病人、病畜或尸体的标本中如发现由较宽的荚膜环绕的、两端平齐的粗大杆菌，特别是镜下发现大量、纯一通常呈竹节状的该种细菌，而且没有明显的其他细菌污染时，炭疽的诊断便可确立。3、细菌分离培养炭疽芽孢杆菌的分离培养应同时用两种培养基进行：常规的血琼脂平板和选择性平板。1）标本处理在正常情况下应当无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布上述两种平板；组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以白金耳涂开。污染、陈旧的标本，首先制成悬液。适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，3000r/min离心30min，取富集的沉淀物。将所得的悬液67℃加热15min，冷却后涂布上述两种平板。2）挑选可疑菌落上述平板在37℃孵育过夜或24h后，检查是否长出可疑的炭疽芽孢杆菌菌落。炭疽芽孢杆菌在选择平板上菌落较血琼脂平板上的小，具有类似特征，菌落呈蓝绿色。遇菌落形态与以上描述完全一致但呈黄色的菌落，也应进行接下来的鉴定步骤。4、炭疽芽孢杆菌鉴定将上述可疑菌落挑出，划线接种于普通营养琼脂平板上，在划线区内分别贴上浸有诊断用炭疽芽孢杆菌噬菌体和青霉素的纸片。37℃孵育过夜或24h后，在两种纸片的周围均出现明显的抑菌环，便可判定为炭疽芽孢杆菌。血清学检验方法——环状沉淀反应（Ascoli氏沉淀试验）取病死动物组织数克，剪碎或捣烂，加5-10倍生理盐水，煮沸5-10min，冷却过滤或离心沉淀，用毛细管吸取上清液，缓慢加入装有炭疽素血清的小玻璃试管中，出现整齐的两层液面，在两层液面接触处出现白色的沉淀环为阳性（最好在10-15min内观察）。此法简便快速，检出率较高。四、治疗青霉素首选、四环素或氯霉素第二节布氏杆菌及其检验一、概况布氏杆菌又名布鲁菌，是多种动物和人布氏杆菌病的病原，主要侵害生殖器官和关节，主要特征是：生殖器官、胎膜以及多种器官组织发炎、坏死和肉芽肿的形成，引起流产、不孕、关节炎症等病症。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊（Br.melitensis）、牛(Br.Bovis)、猪(Br.suis)三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。二、生物学特性1、形态学特征本菌呈球杆状或短杆状细小的G-菌，新分离者趋向球形。多单生，很少成双、短链或小堆状，不形成芽孢和荚膜，无鞭毛。2、培养特性 专性需氧，牛布氏杆菌在初代分离培养时尚需5-10%CO2，最适生长温度37℃，最适pH6.6-7.4。营养要求高，生长时需硫胺素、烟草酸和生物素等；普通琼脂上生长贫瘠，加上一些营养如马血清、血液、葡萄糖、甘油等，都可促进本菌生长。实验室常用肝汤琼脂、马铃薯浸汁琼脂、胰蛋白胨琼脂培养该菌。肝汤琼脂、胰蛋白胨琼脂菌落特征：细小、柔软、湿润、圆形隆起、透明闪光的露滴状菌落，菌落大小不等，小的0.05-0.1mm，大的0.5-1.0mm。血琼脂：灰白、隆起细小圆形菌落，无溶血性。布氏杆菌菌落易发生光滑型(S)粗糙型(R)变异。3、抗原性1）A抗原和M抗原是细胞壁表面的脂多糖蛋白复合物。光滑型布氏杆菌具有两种表面抗原，分别能与相应的抗血清表现凝集反应。2）R抗原细胞壁中的脂多糖复合物。是大多数非光滑型布氏杆菌的共同抗原决定簇，其抗血清可与绵羊种和犬种布氏杆菌凝集。（绵羊种和犬种布氏杆菌是天然的R型种）。4、抵抗力对外界的抵抗力较强，在污染的土壤和水中可存活1-4个月，皮毛2-4月，乳、肉中约2个月，粪便中120d，流产胎儿中至少75d。对湿热的抵抗力不强，60℃加热30min或70℃加热5min杀死，煮沸立即死亡。对消毒剂的抵抗力也不强。5、致病性传播途径：皮肤粘膜侵入、消化道食入，吸入污染的尘埃。进入机体后，可被吞噬细胞吞噬成为胞内寄生菌，并在淋巴结生长繁殖。潜伏期2周-7个月，一旦侵入血流，则出现菌血症，由于内毒素的作用，致使机体发热、无力等中毒症状，之后细菌定位于网状内皮系统、乳腺等生殖器官，妊娠中期，在胎盘绒毛膜大量繁殖，导致坏死性胎盘炎，致使孕畜流产。本菌多为细胞内寄生，治疗难于彻底，易转为慢性及反复发作。三、布氏杆菌的检验布氏杆菌的检验主要依靠血清学检查及变态反应检查，细菌学检查仅用于发生流产的动物和其他特殊情况。（一）细菌学诊断直接涂片、柯氏与革兰氏染色、显微镜检病料直接涂片、柯氏与革兰氏染色、显微镜检分离培养含菌量少的病料用肝汤或胰蛋白胨增菌肝汤或胰蛋白胨琼脂或血平板直接划线纯培养生化试验血清学试验阳性者鉴定种及生物型动物试验，豚鼠最易感，小鼠和家兔有抵抗力。 （二）血清学检查动物在感染布氏杆菌7-15d可出现抗体，检测血清中的抗体是布氏杆菌病诊断的主要手段。有多种检查方法，如：凝集试验、酶联免疫吸附检测(ELISA)，后者检测的特异性好、灵敏度高。ELISA原理抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，其能保持其免疫学和酶学活性；酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。（三）PCR检测此法敏感、特异、快速，实时荧光定量PCR已用于布氏杆菌特异性基因的检测，即在PCR反应体系中加荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个过程。通过标准曲线可进行定量。第三节禽流感病毒及其检验禽流感：禽流感是禽流行性感冒的简称，这是一种由禽流感病毒引起的家禽和野禽的一种从呼吸病到严重性败血症等多种症状的综合病症，被国际兽医局定为A类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。也可传染给人。禽流感的流行病学主要特点为：突然暴发，发病率高，病死率高，季节性不强，来源常不明。一、生物学特性（一）形态与结构正粘病毒科的甲型（A）流感病毒，呈球形，直径80～120nm，有囊膜。基因组为单股负链RNA，含8个基因片断。基因易发生变异。病毒表面含血凝素（红血球凝集素）(HA蛋白)和神经氨酸酶(N蛋白)，都为糖蛋白。（二）分类依其H、N蛋白抗原性的不同，目前可分为15个H亚型(H1～H15)和9个N亚型(Nl～N9)。感染人的主要是H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重。原本低致病性的禽流感病毒株，经6-9个月禽间流行可编译为高致病性毒株。（三）培养特性能在鸡胚、鸡胚成纤维细胞中生长，大多不致死鸡胚，凝集多种动物的红细胞。（四）抵抗力病毒对紫外线敏感，在阳光直射下40~48h灭活；加热55℃1h、60℃10min、100℃1min可被灭活；对大多数防腐消毒药敏感；病毒在干燥尘埃中可存活2周，在4℃可保存数周，在冷冻的禽肉和骨髓中可存活10个月之久。（五）致病性1、传染源：主要为鸡、鸭等家禽，特别是鸡。2、传染途径：消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等途径传播。主要为接触传播，即通过密切接触H5N1感染的家禽或其粪便，以及直接接触H5N1而传染。 扩散主要是通过粪便中大量的病毒粒子污染空气而传播。人员和车辆往来是传播本病的重要因素。3、病禽症状病鸡死亡之前常表现出无毛处皮肤发绀、极度消瘦、下痢、身体蜷缩、共济失调、惊厥等中枢神经系统和全身中毒症状。病鸡精神沉郁，肿头，眼睑周围浮肿，肉冠和肉垂肿胀、出血甚至坏死，鸡冠发紫，病鸡腿部肌肉出血，有出血点或出血斑。4、人临床症状：潜伏期1-7天，主要表现为发热、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，部分患者可有消化道症状。体温持续在39℃以上。少数患者发展为肺出血、胸腔积液、肾衰竭、败血症休克等多种并发症而死亡。二、禽流感病毒的检验1、样品来源：泄殖腔和器官拭子是通常的样品来源。2、直接检测病毒抗原1）抗原捕捉ELISA：由于IgM抗体出现在感染早期，故检测出IgM，作为某疾病的早期诊断。用抗IgM抗体包被固相载体，吸附待检血清中的IgM，洗涤除去血清中的IgG及其他成分，再特异性抗原与IgM结合，再加入酶标记抗体和底物显色进行测定，特异性好。2）荧光抗体法：以荧光物标记抗体进行抗原定位的技术。特点：速度快、操作简单、敏感性高。3、直接检测病毒基因RT-PCR(逆转录PCR)：先以病毒RNA为模板，逆转录出DNA，再进行扩增。第四节朊病毒及其检验朊病毒(prion)朊病毒/传染性蛋白粒子/朊粒/朊毒体：是一种不同于细菌、病毒或类病毒的在分类上尚示定论的病原因子，其本质为由正常宿主细胞基因编码的、构象异常的蛋白质，称为朊蛋白(prionprotein,PrP)，目前尚未检出任何核酸成分，是人和动物的传染性海绵状脑病（TSEs)的病原体。一、生物学特性（一）形态与结构prion是一种不含核酸和脂类的疏水性糖蛋白，分子量为27～30×103，因此又称为PrP27～30。大小30-50nm，电镜下看不到病毒粒子，负染后看到聚集而成的棒状体，大小10-250nm×100-200nm。其能在宿主细胞内复制，无免疫性，不诱发抗体。两种不同的分子构型：细胞朊病毒蛋白(cellularPrP,PrPC)：具有42%的α-螺旋，3%的β折叠。存在于正常组织及感染动物的组织中，是正常基因的产物，通常情况下是无害的。对蛋白酶K敏感。羊痒疫朊病毒蛋白(scrapieprionprotein,PrPSC)：α-螺旋占30%，β折叠高达43%，仅存在于感染动物的组织中，与致病和传染有关。对蛋白酶K有抗性。（二）抵抗力朊病毒颗粒对一些理化因子的抵抗力之强，大大高于已知各类微生物和寄生虫。（三）致病性1、传染源：感染朊毒体的人和动物。 2、传染途径：消化道传播。医源性传播：脑外科手术、器官移植等。遗传。3、导致疾病疯牛病：牛海绵状脑病。病牛临床表现为步态不稳、共济失调、搔痒、烦躁不安等神经症状。绵羊痒病：它是羊的一种慢性致死性疾病，病羊具有中枢神经系统变性、剧痒、共济失调、高死亡率等特点。克-雅氏病：人的一种中枢神经系统变性疾病。其临床症状和病理组织学变化与疯牛病、绵羊痒病十分相似。共同特征：潜伏期长（可达数年至数十年），一旦发病即呈慢性进行性发展，最终死亡。4、发病机理PrPC转变为PrPSC是疾病发生的基本条件，PrPSC在中枢神经系统细胞内聚集，导致神经元的破坏。脑组织病理学特点：中枢神经细胞空泡化、弥漫性神经细胞缺失、胶质细胞增生、淀粉样斑块形成、脑组织海绵状改变；PrPSc聚集。二、朊病毒的检验1、免疫组化技术是目前确认TSEs的有效手段。取可疑患者的脑组织或非神经组织切片，经脱水性或水解性高压消毒、甲酸和硫氰酸胍处理，使其感染性消失并破坏PrPC后，再用单克隆抗体检测对上述处理有抗性的PrPSC。2、免疫印迹技术组织印迹法检测PrPSC是一种简单而敏感的诊断方法。首先将待测的样品印迹在固相载体——硝酸纤维素膜上，用病毒的家兔特异性抗体（IgG）与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与酶标记的羊抗兔第二抗体进行反应，最后用酶的反应底物进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。3、基因分析从病人外周血白细胞中提取DNA，对20号染色体prion基因进行分子遗传学分析。第七章各类食品卫生微生物检验第一节肉与肉制品中的微生物及其检验一、概况广义上的肉是指适合人类作为食品的动物机体的所有构成部分。在商品学上，肉则专指去皮(毛)、头、蹄、尾和内脏的动物胴体或自条肉。肉制品：是指用畜禽肉为主要原料，经调味制作的熟肉制成品或半成品，如香肠、火腿、培根、酱卤肉、烧烤肉等。二、肉与肉制品中常见的微生物（一）肉与肉制品中微生物的来源内源性来源：微生物来源于动物体内。动物宰杀后，肠道、呼吸道或其他部位的微生物，可进入肌肉和内脏，使之污染。动物防卫机能减弱，在生活期间其肌肉和内脏侵入微生物。外源性污染：主要的污染来源。动物在屠宰和加工过程中，由于环境卫生条件、用具、工人的个人卫生、用水、运输过程等不洁造成污染。 （二）肉与肉制品中常见的微生物类群1、致腐微生物：在自然界里广泛存在的一类营死物寄生的，能产生蛋白分解酶，使动植物组织发生腐败分解的微生物。肉的腐败过程使蛋白质分解成蛋白胨、多肽、氨基酸，进一步再分解成氨、硫化氢、酚、吲哚、粪臭素、胺及二氧化碳等，这些腐败产物具有浓厚的臭味，肉的表面产生明显的发粘。（1）细菌：造成肉腐败的主要微生物。革兰氏阳性、产芽孢需氧菌：如蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌等；革兰氏阴性、无芽孢细菌：如阴沟产气杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、绿脓假单胞杆菌、荧光假单胞菌等；革兰氏阳性球菌：如金黄八联球菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌等；厌氧性细菌：如腐败梭状芽孢杆菌、溶组织梭状芽孢杆菌等。耐盐或嗜盐的菌类：存在于腌腊制品中，弧菌、微球菌等。(2)真菌：在鲜肉变质中起一定作用。交链霉、青霉、根霉、分枝孢霉、毛霉，毛霉及青霉为最多。2、致病微生物（1）人畜共患病的病原微生物：细菌：炭疽杆菌、布氏杆菌、李氏杆菌、鼻疽杆菌、结核分枝杆菌、猪丹毒杆菌等。病毒：口蹄疫病毒、狂犬病病毒、水泡性口炎病毒等。（2）只感染畜禽的病原微生物多杀性巴氏杆菌、坏死杆菌、猪瘟病毒、兔病毒性出血症病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒等。3、中毒性微生物细菌：沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌、变形杆菌、肉毒梭菌、链球菌等。霉菌：麦角菌、赤霉、黄曲霉、黄绿青霉、毛青霉，冰岛青霉等。三、肉与肉制品中微生物的检验方法(一）样品的采集(1)生肉及脏器检样屠宰场宰后的畜肉：于开腔后，用无菌刀采取两腿内侧肌肉各50g(或劈半后采取两侧背部最长肌肉各50g)；冷藏或销售的生肉：无菌刀取腿内或其他部位的肌肉100g检样采取后放入无菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h。(2)禽类(包括家禽和野禽)鲜、冻家禽采取整只，放无菌容器内。带毛野禽可放清洁容器内，立即送检。(3)各类熟肉制品一般采取200g，熟禽采取整只，均放入无菌容器内，立即送检。(4)腊肠、香肠等生灌肠腊肠、香肠等生灌肠采取整根、整只，小型的可采数根、数只，其总量不少于250g。（二）样品的处理1、检验肉和肉制品内细菌含量从而判断其新鲜度。(1)生肉及脏器检样的处理先将检样进行表面消毒(在沸水内烫3—5s，或灼烧消毒)，再用无菌剪子取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀后即为1:10稀释液。(2)鲜、冻家禽检样的处理 先将检样进行表面消毒，用灭菌剪子或刀去皮后，剪取肌肉25g(一般可从胸部或腿部剪取)。其他处理同生肉。带毛家禽去毛后，同家禽检样处理。(3)各类熟肉制品检样的处理直接切取或称取25g，其他处理同生肉。(4)腊肠、香肠等生灌肠检样处理先对生灌肠表面进行消毒，用灭菌剪子剪取内容物25g，他处理同生肉。2、检验肉及肉制品受外界环境污染的程度或是否带有某种致病菌棉拭采样法和检样处理一般可用板孔5cm2金属制作规板压在受检样品上，将灭菌棉拭稍蘸湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，然后将规板板孔移压另一点，用另一棉拭揩抹，如此共移压揩抹10次，总面积50cm2，共用10支棉拭。每支棉拭在揩抹完毕后应立即剪断或烧断后投入盛有50mL灭菌水的三角瓶或大试管中，立即送检。检验时先充分振摇吸取瓶、管中的液体，作为原液，再按要求做10倍递增稀释。检查是否带有致病菌，在可疑部位用棉拭揩抹即可。（三）微生物检验按照国标检验菌落总数、大肠菌群和有关致病菌。第二节乳与乳制品中的微生物及其检验一、乳与乳制品中常见的微生物（一）乳与乳制品中微生物的来源1、内源性来源：乳房内有乳房细菌存在，导致乳汁中有微生物。2、外源性污染：乳畜的体表、挤乳者的手和工具、容器以及卫生管理相关的饲养条件（空气、水源等），都能引起微生物污染。(二）乳与乳制品中的微生物的类型能使乳汁发酵产酸的细菌：乳酸杆菌类、链球菌类。能发酵乳糖产乳酸，不破坏蛋白成分，常产生芳香物质。使鲜乳发酵产酸产气的细菌：分解碳水化合物，生成乳酸、醋酸、丙酸、乙醇及CO2和氢气等，使牛乳凝固，产生多孔气泡，并产生异味和臭味。pH低时被抑制。如肠细菌、丁酸菌类、丙酸细菌。分解鲜乳中蛋白质的细菌：腐败菌：枯草杆菌、液化链球菌、丁酸梭菌、变形杆菌等。分泌凝乳酶，将酪蛋白变为副酪蛋白而凝固，后又分解，使蛋白水解胨化，变为蛋白胨，变为AA、氨和不快气味的物质；产脂肪酶，分解脂肪，产生败坏的异常气味。使鲜乳呈碱性的细菌：粪产碱菌、黏乳产碱菌。分解柠檬酸盐变为碳酸盐，使鲜乳呈碱性反应。引起鲜乳变色的细菌：深蓝色假单胞菌、黄假单胞菌。嗜热菌和嗜冷菌：嗜热链球菌、嗜热乳酸杆菌、产气嗜热杆菌；荧光假单孢杆菌、黄杆菌、产碱杆菌等。酵母菌和霉菌：最常见的有胞壁酵母、洪氏球拟酵母、球拟酵母、乳酪粉孢霉、黑念珠霉、蜡叶芽枝霉、乳酪青霉、灰绿曲霉、黑曲霉、灰绿青霉等。病原微生物：沙门氏菌、结核分枝杆菌、布氏杆菌、溶血性大肠杆菌、炭疽杆菌、葡萄球菌、产毒霉菌等。三、乳与乳制品中微生物的检验方法(一）样品的采集 1、散装或大型包装的乳品用灭菌刀、勺取样，采样时应注意取样部位、取样量等的代表性：每件样品数量不少于200g，放入灭菌容器内及时送检。鲜乳一般不应超过4h，在气温较高或路途较远的情况下应进行冷藏，不得使用任何防腐剂。2、小型包装的乳品应采取整件包装，注意包装完整。各种小型包装的乳品与乳制品的取量为：生奶1瓶或1包；消毒奶1瓶或1包；奶粉1瓶或1包；奶油1块(113g)；酸奶1瓶或1包；炼乳1瓶或1罐；奶酪(干酪)1个。（二）样品的处理1、鲜奶、酸奶用无菌操作去掉鲜奶、酸奶瓶口的纸罩纸盖，经火焰消毒后，以无菌操作吸取检样25mL，放入装有225ml灭菌生理盐水的三角瓶内，振摇均匀：若酸乳有水分析出于表层．应先去除水分后再做稀释处理。2、炼乳将炼乳瓶或罐先用温水洗净表面，再用点燃酒精棉球消毒炼乳瓶或罐的上表面，然后用灭菌的开罐器打开炼乳罐，下同（1）。3、奶油用无菌操作打开奶油的包装，取适量检样置于灭菌三角瓶内，在45℃水浴或恒温箱中加温，溶解后立即将烧瓶取出，用灭菌吸管吸取奶油25mL放入另一含225mL灭菌生理盐水或灭菌奶油稀释液的烧瓶内(瓶装稀释液应预置于45℃水浴中保温，做10倍递增稀释时所用的稀释液相同)，振摇均匀，从检样溶化到接种完毕的时间不应超过30min。4、奶粉罐装奶粉的开罐取样法同炼乳处理，袋装奶粉应用蘸有75%酒精的棉球涂擦消毒袋口，按无菌操作开封取样，称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌三角瓶内，将225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入(先用少量生理盐水将奶粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结块)，振摇使其充分溶解和混匀。5、奶酪先用灭菌刀削去部分表面封蜡，用点燃的酒精棉球消毒表面，然后用灭菌刀切开奶酪；以无菌操作切取表层和深层检样各少许，置于灭菌乳钵内切碎，加入少量生理盐水研成糊状。（三）微生物检验按照国标检验菌落总数、大肠菌群和有关致病菌。第三节蛋与蛋制品中的微生物及其检验一、概况蛋制品包括以鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋或其他禽蛋为原料加工而制成的蛋制品。分为4种：再制蛋类、干蛋类、冰蛋类和其他类。鲜蛋应是无菌的，原因：1、鲜蛋有一层完整的蛋壳包裹;2、禽蛋中蛋白质具有强碱性，pH8.0—9.6之间；3、鲜蛋内还含有一定的抗菌物质——溶菌酶。但由于各种原因有微生物存在。因此需进行检验。二、蛋与蛋制品中常见的微生物（一）蛋与蛋制品中微生物的来源1、母禽体内卵巢、输卵管：病原微生物在蛋的形成过程中进入蛋黄或蛋白。 排泄腔：蛋从排泄腔排出体外时，蛋内遇冷收缩，附在蛋壳的微生物可穿过蛋壳进入蛋内。2、外界环境蛋壳上有许多气孔。在收购、运输和贮存的过程中，外界的微生物可以粘附到蛋壳的表面。合适条件下，微生物可逐渐从蛋壳侵入内部。且蛋白内的溶菌酶随储存时间延长失去活性。(二）蛋与蛋制品中的微生物的类型细菌：如枯草杆菌、变形杆菌、产碱杆菌、荧光杆菌等；霉菌：如芽枝孢霉、分枝孢霉、毛霉、根霉、葡萄孢霉、交链孢霉和青霉等。病原微生物：沙门氏菌：通常不改变蛋白、蛋黄的外观和气味，常引起食物中毒；雏鸡白痢杆菌。三、蛋与蛋制品中微生物的检验方法(一）样品的采集1、鲜蛋用流水冲洗鲜蛋外壳，再用75％酒精棉球涂擦消毒后封入灭菌袋内，送检。2、全蛋粉，巴氏消毒全蛋粉，蛋黄粉，蛋白片将包装铁箱上开口处用75％酒精棉球消毒，然后将盖开启，用灭菌的金属制双层旋转式套管采样器斜角插入箱底，使套管旋转收取检样，再将采样器提出箱外，用灭菌小匙自上、中、下部收取检样，装入灭菌广口瓶中，每个检样质量不少于100g。3、冰全蛋、巴氏消毒冰全蛋、冰蛋黄、冰蛋白先将包装铁听开口处用75％酒精棉球消毒，然后将盖开启，用灭菌电钻由顶到底斜角钻入，徐徐钻取检样。然后抽出电钻，从中取出检样25g装入灭菌广口瓶中。（二）样品的处理1、鲜蛋外壳用灭菌生理盐水浸湿的棉拭充分擦拭蛋壳，然后棉拭直接放入培养基内增菌培养，也可将整只鲜蛋放入灭菌小烧杯或平皿中，按检样要求加入定量灭菌生理盐水或液体培养基，用灭菌棉拭将蛋壳表面充分擦洗后，以擦洗液作为检样检验。2、鲜蛋蛋液将鲜蛋在流水下洗净，待干后再用酒精棉球消毒蛋壳，然后根据检验要求，打开蛋壳取出蛋白、蛋黄或全蛋液，放入带有玻璃珠的灭菌瓶内，充分摇匀待检。3、全蛋粉、巴氏消毒全蛋粉、蛋白片、蛋黄粉将检样放入带有玻璃珠的灭菌瓶内，按比率加入灭菌生理盐水充分摇匀待检。4、冰全蛋、巴氏消毒冰全蛋、冰蛋白、冰蛋黄将装有冰蛋检样的瓶子浸泡于流动冷水中，待检样融化后取出，放入带有玻璃珠的灭菌瓶中充分摇匀待检。5、各种蛋制品沙门氏菌增菌培养以无菌操作称取检样，接种于亚硒酸盐煌绿或煌绿肉汤等增菌培养基中(此培养基预先置于有适量玻璃珠的灭菌瓶内)，盖紧瓶盖，充分摇匀，然后放入(36±1)℃恒温箱中培养(20±2)h。（三）微生物检验按照国标检验菌落总数、大肠菌群和有关致病菌。第四节水产品中的微生物及其检验一、概况定义：水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物及其加工产品的统称。种类：鲜活水产品（鱼、虾、蟹、贝、头足类）、冷冻水产品、腌渍水产品、干熏水产品、熟食水产品。二、水产品中常见的微生物 （一）水产品中微生物的来源水生动物的体表。水生动物的肠道。加工、运输时，由于环境卫生条件、用具、工人的个人卫生、用水、运输过程等不洁造成污染。（二）水产品中的微生物的类型1、致腐微生物1）鲜活水产品：假单孢菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、产碱杆菌、气单孢杆菌和短杆菌属、弧菌属等。腐败特征：以鱼为例，浑浊、无光泽，表面组织变得疏松，鱼鳞脱落，鱼体组织溃烂，进而产生吲哚、粪臭素、硫醇、氨气、硫化氢。鱼体发臭。2）腌渍水产品：嗜盐细菌：副溶血性弧菌、玫瑰微球菌、盐地赛氏杆菌、盐制品假单孢菌、红皮假单孢菌、盐杆菌属；酵母菌、乳酸菌、霉菌。腐败特征：鱼体变味、体表层大面积变红，附有褐色斑点。3）冷冻水产品：假单孢菌、无色杆菌;摩尔杆菌、弧菌;小球菌、葡萄球菌、黄色杆菌等4）干熏水产品：主要是霉菌。腐败特征：变软、变黏，肉眼可见各种颜色的霉菌菌丝体，伴有不愉快的臭气和味道，赤变。5）熟食水产品：球菌：链球菌、微球菌等；杆菌：黄杆菌、无色杆菌、芽孢杆菌、气杆菌、多黏芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等；霉菌：青霉、曲霉、毛霉。腐败特征：表面有透明、粘稠水滴样物质或产生不透明的干酪样物质，有酸臭味。2、致病微生物细菌、真菌和病毒。如沙门氏菌、葡萄球菌、副溶血性弧菌、致病性大肠杆菌、志贺氏菌、肉毒梭菌等；甲型、戊型病毒性肝炎病毒、轮状病毒等。症状：腹泻、恶心、呕吐等，重者，全身麻痹、呼吸困难，死亡。三、水产品中微生物的检验方法(一）样品的采集一般都采取完整的个体。鱼类和体形较大的贝甲类：以个体为一件样品，单独采取；一批水产品：采取多个个体；小型鱼类和对虾、小蟹：混合采取检样，一般可采500-1000g。鱼糜制品(如灌肠、鱼九等)和熟制品：采取250g，放灭菌容器内。所采样品应在8h内送检，加冰保藏。（二）样品的处理1、检验水产品肌肉内细菌含量从而判断其新鲜度（1）鱼类采样部位：背肌。步骤：用流水将鱼体体表冲净，去鳞，用75％酒精的棉球擦净鱼背，待干后用灭菌刀在鱼背部沿脊椎切开5cm，再沿直于脊椎的方向切开两端，后用无菌剪子剪取25g鱼肉，放入灭菌乳钵内，用灭菌剪子剪碎，加灭菌玻璃砂研磨，检样磨碎后加225mL灭菌生理盐水，混匀成稀释液。（2）虾类部位：腹节内的肌肉。 步骤：将虾体在流水下冲净，摘去头胸节，用灭菌剪子剪除腹节与头胸节连接处的肌肉，然后挤出腹节内的肌肉，以后操作同鱼类检样处理。（3）蟹类部位：胸部肌肉。步骤：将蟹体在流水下冲洗，剥去壳盖和腹脐，去除腮条。再置流水下冲净。用75％酒精棉球擦拭前后外壁。置灭菌搪瓷盘上待干。然后用灭菌剪子剪开，成左右两片，用双手将一片蟹体的胸部肌肉挤出，以后操作同鱼类检样处理。（4）贝壳类部位：贝壳内容物。步骤：先用流水刷洗贝壳，刷净后放在铺有灭菌毛巾的清洁的搪瓷盘或工作台上，用75％酒精棉球擦拭消毒后，用灭菌小钝刀从贝壳的张口处缝隙中徐徐切入，撬开壳盖，再用灭菌镊子取出整个内容物，以下操作同鱼类检验处理。1、检验水产品是否污染某种致病菌鱼类:肠管和鳃；虾类:头胸节内的内脏和腹节外沿处的肠管;蟹类:胃和鳃条；贝类中的螺类:腹足肌肉以下的部分;贝类中的双壳类:覆盖在斧足肌肉外层的内脏和瓣鳃。第五节清凉饮料中的微生物及其检验一、概况定义：清凉饮料是利用天然或食品化工原料调制而成的饮料，可直接食用。种类：冰棍、冰淇淋、汽水、果汁、食用冰块、散装饮料、固体饮料等。目前也在这类饮料中添加动物性食品原料。如雪糕中添加牛奶。二、清凉饮料中常见的微生物（一）清凉饮料中微生物的来源原料污染，如：果汁的原料水果中常带微生物，故果汁不可避免地被微生物污染。清凉饮料在加工、运输、贮藏过程中，容易造成微生物污染，引起食品腐败变质，甚至导致发生食物中毒。二）清凉饮料中的微生物类型1、酵母菌假丝酵母菌属、圆酵母属、隐球酵母属、红酵母属、葡萄酒酵母属、啤酒酵母属、汉逊氏酵母属。耐高渗透压：如鲁氏酵母、蜂蜜酵母。2、霉菌引起果汁变质产生难闻气味。青霉属最为常见，如：扩展青霉、皮壳青霉；其次为曲霉：烟曲霉、构雀曲霉。霉菌对二氧化碳敏感，果汁中充入CO2可防霉。3、细菌果汁：乳酸菌（巴氏乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、嗜热链球菌等）、琥珀酸杆菌、肠道杆菌等。致病菌：沙门氏菌、痢疾杆菌、葡萄球菌、肉毒杆菌等。活性乳酸菌饮料：乳酸菌。冷冻饮品：鲜冻初期：黄杆菌属、假单孢菌属、嗜冷微球菌等。中末期：肠杆菌、球菌。致病菌：单核细胞增生李斯特菌。三、清凉饮料中微生物的检验方法（一）样品的采集碳酸饮料、瓶(桶)装饮用水、果汁饮料、含乳饮料、固体饮料等：采取原瓶(罐)、袋和盆装样品；散装者应用无菌操作采取500mL，放入灭菌磨口瓶中。冰淇淋、冰棍：采取样品时应采取原包装样品；散装者用无菌操作取样，放入灭菌磨口瓶中，再放入冷藏或隔热容器中。 食用冰块：取冷冻冰块放入灭菌容器中。所有的样品采取后，应立即送检，最多不超过3h。（二）检样的处理瓶(罐)装饮料用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好。塑料瓶口可用75％酒精棉球擦拭灭菌，用灭菌开瓶器将盖启开，含有二氧化碳的饮料可倒入另一灭菌容器内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡。待气体全部逸出后，进行检验。冰棍用灭菌镊子除去包装纸，将冰棍部分放入灭菌磨口瓶内，木棒留在瓶外，盖上瓶盖，用力抽出木棒，或用灭菌剪子剪掉木棒，置45℃水浴30min，溶化后立即进行检验。冰淇淋放在灭菌容器内，待其溶化立即进行检验。乳酸菌的检验乳酸菌：能发酵乳糖产生乳酸、需氧和兼性厌氧的革兰氏阳性无芽孢杆菌。通过检测乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和检测质量的依据。基本程序：酸奶稀释制平板（MRS或改良CHALMERS培养基）培养检查计数必要时镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。第六节调味品中的微生物及其检验一、概况调味品包括酱油、酱类和醋等，是以豆类、谷类为原料发酵而成的食品。二、调味品中常见的微生物（一）调味品中微生物的来源原料污染一部分来自调料植物自身，一部分来自土壤、灰尘、鼠、鸟、昆虫、水等。加工制作、运输、储藏过程中受到微生物的污染。二）调味品中的微生物类型1、细菌市售调料的细菌数都较高，多数耐干燥。种类：肠道细菌（如大肠杆菌、副溶血性弧菌）、球菌（如金黄色葡萄球菌）及需氧和厌氧的芽孢杆菌（蜡样芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌）。数量：黑胡椒、辣椒、姜等：105-109个/g之间；多数调料含芽孢数：102-106个/g之间，厌氧菌的芽孢较少，每克不超过百个。2、霉菌多数在收获后污染。种类：灰绿曲霉、局限曲霉、赭曲霉、黄曲霉、青霉、穗霉等。数量：102-106个/g之间三、调味中微生物的检验方法(一）样品的采集酱油和食醋装瓶者采取原包装（不少于250mL），散装样品可用灭菌吸管采取。酱类用灭菌勺子采取，放入灭菌磨口瓶内送检。（二）样品的处理瓶装样品用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，开瓶器启开后进行检验。酱类用无菌操作称取25g，故入灭菌容器内，加入灭菌蒸馏水225mL，制成混悬液。食醋用200-300g/L灭菌碳酸钠溶液调pH到中性。