南京板鸭中产生物胺

南京盐水鸭中腐败菌产生物胺（腐胺）能力的研究进展导师：徐为民专业：食品科学姓名：徐君明摘要：生物胺是一类主要由氨基酸脱羧形成的具有生物活性的小分子含氮化合物。生物胺与人体的健康有着密切的关系。影响生物胺产生的因素有很多。生物胺的检测方法也有很多种。本文重点论述了南京盐水鸭中腐胺产生的路径，及其利用PCR技术鉴定腐胺生物合成的基因。关键词：腐胺产生的途径基因鉴定盐水鸭是江苏的著名特产，由于鸭肉的特性决定其熟化和杀菌温度不能超过90℃，这样，成品盐水鸭中必然残存着大量的微生物，导致其在贮藏过程中很快腐败。微生物致腐的一个主要原因就是微生物会产生脱羧酶，然后脱羧酶使鸭肉内游离的氨基酸发生反应生产生物胺，产生难闻的胺味，不仅会使其感官品质发生不良的变化，同时也产生了食用安全隐患。目前食品中生物胺类物质的研究大部分集中在发酵类肉及水产品制品中，而有关禽肉制品中生物胺的研究报道较少，对鸭肉中生物胺的研究还尚未见报道。生物胺(biogenicamines，BAs)是一类主要由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的具有生物活性的小分子含氮化合物。生物胺根据其结构可分为三类：脂肪族（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等）；芳香族（酪胺、苯乙胺等）；杂环族（组胺、色胺等）。腐胺、精胺、亚精胺和尸胺等是生物活性细胞必不可少的组成部分，在调节核酸与蛋白质的合成及生物膜稳定性方面起着重要作用。1生物胺与人体健康当人体中生物胺含量较少时，对人体的健康有重要的生理功能。如促进生长。增强代谢活力。加强肠道免疫系统，并在神经系统中发挥活性。控制血压，对血管和肌肉有舒张或收缩作用（儿茶胺）。能抑制癫痫的发作，对精神活动和大脑皮层有重要的调节作用。对心脏有不同程度的正性肌力和正性频率作用。促进DNA、RNA和蛋白质的合成。加速生物的生长发育，在清除自由基方面也有一定的作用，也就是说具有一定的抗氧化的作用（酪胺） 但是，生物胺在人体内积累到较高数量时，就会产生毒害：引起外部血管膨胀高血压和头痛。肠道平滑肌的收缩。腹部痉挛、腹泻和呕吐等过敏性反应。有关专家研究证明，生物胺是具有致癌性的。生物胺是生成致癌性物质亚硝胺类物质的前体，腐胺和尸胺不仅能加强组胺的毒性，而且还会与亚硝酸盐反应生成杂环类致癌物质亚硝胺。其中组胺和酪胺对人类健康的影响最大，通常把这两项作为检测指标。但在人体中以酪胺和腐胺的含量最高。2生物胺（腐胺）形成的机理盐水鸭中的生物胺主要由微生物产生的脱羧酶催化氨基酸脱羧而产生。它的产生需要3个条件：（1）能分泌氨基酸脱羧酶的微生物的存在（2）生物胺前体物质(氨基酸)的存在（3）以及适宜这些微生物生长和分泌氨基酸脱羧酶的环境条件。也就是说，盐水鸭中生物胺的产生主要是由微生物在发酵过程中或成熟储藏过程中产生的蛋白酶作用于蛋白质生成游离的氨基酸，而后经过微生物分泌的氨基酸脱羧酶对氨基酸脱羧而形成相应的生物胺。氨基酸的脱羧基过程如下：RCHNH2COOH（氨基酸）→RCH2NH2（胺）+CO2。3产生物胺（腐胺）的微生物原料肉中微生物的种类和数量是影响肉制品中生物胺含量的重要因素。一般认为健康动物内部组织是无菌的，但也有些微生物会越过屏障到达内部组织，牲畜宰后丧失先天防卫能力，使微生物污染成为可能，而这些微生物有可能在原料肉加工之前，便已经造成生物胺的积累。虽然并非所有的微生物种类都具有氨基酸脱羧酶活性，但具有此种生理作用的细菌种群却并不在少数。南京板鸭中形成生物胺的主要菌为乳酸菌、肠杆菌、假单胞菌等。肠杆菌具有较高的脱羧酶活性，肠杆菌中的阴沟肠杆菌和沙雷氏菌具有较高的产尸胺和腐胺的能力。4影响生物胺产生的因素南京盐水鸭中生物胺的形成受多种因素的影响，具体如下：原料肉的特性(游离氨基酸、脂肪、pH值等)。微生物的种类和数量。生产工艺及贮藏条件(加热、烹煮、贮藏、冻藏等)。添加剂（糖、亚硝酸钠）。（见图1） 图1影响生物胺生成的因素2生物胺的检测方法生物胺的检测方法有：高效液相色谱法（HPLC）、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）、薄层色谱法（TLC）、离子色谱法（IC）、毛细管电泳法（CE）、气相色谱法（GC）、生物传感器法。利用TLC与HPLC法均从盐水鸭样品中检测到了酪胺、腐胺、精胺、尸胺、2-苯乙胺及亚精胺共6种生物胺，并且研究发现TLC对各种生物胺的检测限值较低，故TLC可以作为一种便捷、经济的定性分析食品中生物胺的方法。5.1高效液相色谱法（HPLC）HPLC具有分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析准确的特点，是目前食品中生物胺含量分析测定的主要手段。5.2反相高效液相色谱法（RP-HPLC） RP-HPLC法几乎可以分离所有的有机化合物，被多数研究者选择用于对食品中的生物胺进行分离和定量分析。许多食品中的生物胺在可见和紫外区域既没有满意的吸收，也没有荧光成分，所以在采用HPLC测定时，一般需要对生物胺进行化学衍生处理。衍生有柱前衍生和柱后衍生之分。柱后衍生是样品经过色谱柱分离后，先进入特殊的衍生设备中衍生，再通过检测器鉴定分析。柱后衍生的结果色谱图干扰少、重复性好、耗时少，并且实现了操作的程序化、自动化；但所需的仪器设备昂贵，投资大。所以研究者多选择各种柱前衍生法。衍生试剂的选择以衍生产物稳定性好、杂质少、衍生过程简单为原则。常用的柱前衍生剂有邻苯二甲醛（OPA），丹磺酰氯（Dns-Cl），二硝基甲酰氯（Dabs-Cl）等。邻苯二甲醛的优点在于衍生反应快，耗时少，生物胺衍生物的检测限可以达到fmol水平；但缺点也很明显，即其仅与初级生物胺反应，衍生物不稳定，必须严格控制反应条件，否则影响结果的重复性。二硝基甲酰氯的稳定性最好，Ingolf等的试验结果表明，其生物胺衍生物室温下可稳定四周，-200C下稳定性超过一年。检测器是RP-HPLC系统测定生物胺的重要组成部分。UV检测器是RP-HPLC应用最多的一种检测器，灵敏度较高；二极管阵列检测器是一种新型UV检测器，已应用于生物胺的检测；但荧光检测器对于生物胺衍生物具有更高的灵敏度和选择性。食品中生物胺的种类较多，为了有效分离，一般选择混合流动相的梯度洗脱，从而达到同时测定多种生物胺的目的。5.3离子色谱（IC）离子色谱是HPLC的一种，是分析离子的一种LC方法。离子色谱又分为高效离子交换色谱（HPIC）、离子排斥色谱（IEC）和离子对色谱（IPC）。离子色谱主要利用离子之间对离子交换树脂亲和力差异而进行分离。离子色谱的检测限为ug/L~mg/L级，常用于检测的是电导检测器。离子色谱主要用于阴、阳离子的分析，可同时测定多种离子，简便、快速。生物胺是最弱的阳离子，适于离子色谱法测定。与RP-HPLC法相比，由于不需要衍生过程，缩短了分析时间，减少了衍生化带来的干扰和衍生物不稳定等问题，提高了分析方法的稳定性和重现性。 Jean等采用离子对色谱法测定了十种意大利腊肠中的生物胺结果表明：意大利腊肠中存在的生物胺主要是组胺、酪胺、色胺和苯乙胺。Cinquina等报道了一种以低疏水性和中等强度的弱离子交换聚合色谱相为分离柱填料的离子交换色谱法，以电导检测器测定了食品中四种主要的生物胺（组胺、腐胺、尸胺、亚精胺），检测限3.7ng~12.5ng，以金枪鱼肉为基质的回收率分别为：97.71%，94.74%，94.63%，99.79%，该方法简化了原料处理程序，且整个检测分析过程简单、快速、重现性好。同时指出，电导检测器无论是在样品处理还是在峰形上均优于脉冲安培检测和全脉冲安培检测法。Draisci等用一种改进的离子交换色谱法测定了多种食品中的五种生物胺（尸胺、腐胺、组胺、酪胺和亚精胺）和2种生物胺前体氨基酸（组氨酸、酪氨酸）。他们采用了阳离子交换柱和全脉冲安培检测器简化了样品前处理过程并得到了更低的检测限（1.2ng~2.50ng）。Salma和John采用带浓缩晶核光散射检测器的阳离子交换色谱法，分析了鱼肉中的组胺、腐胺、尸胺和组胺酸。检测限为0.8ng~2ng，该法分析时间短（<10min），无需衍生，无需检测器的电化学特性。Maria和Christopher研制了一种测定疏水性和/或多价胺的新的CS17阳离子交换柱。该柱用聚合羟基作为阳离子交换固定相，具有离子选择性和中等强度的阳离子交换能力，因此具有最佳的多价胺和/或疏水胺选择性。5.4毛细管电泳毛细管电泳又称高效毛细管电泳（HPCE），是指带电粒子或离子以毛细管为分离室以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异进行分离。与传统的电泳技术和现代色谱技术相比，毛细管电泳具有灵敏度高、分离速度快、仪器简单、成本低、无环境污染等优点。毛细管电泳有多种分离模式，根据分离原理可分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、胶束电动力学毛细管电泳、毛细管等电聚焦电泳、毛细管等速电泳。一般情况下，多价生物胺（如腐胺、精胺、亚精胺等）比单价生物胺更难于衍生完全。因此，迄今为止，以毛细管电泳分离生物胺的技术中，只有毛细管区带电泳技术可直接对生物胺进行分析测定而不需要衍生化过程。5.5毛细管区带电泳（CZE）CZE是CE中最简单、应用最广的一种形式。其原理是依各分离物质的质荷比的差异而分离。即不同离子按照各自表面电荷密度的差异，以不同速度在电解质中移动而分离。其缺点是中性物质的表面电荷密度无差异，无法分离。32Lin等[15]利用毛细管区带电泳技术，UV检测器（215nm），无需衍生直接分离测定了六种生物胺（组胺、色胺、酪胺、苯甲胺、苯乙胺、5-羟色胺），并以PH7.5的醋酸氨为缓冲液，观察了甲醇和乙腈作为修饰成分对生物胺分离效果的影响，结果显示：乙腈对六种生物胺的分离具有更高的分辨率。Sun等[16]首次报道了以连接脉冲安培检测器的毛细管区带电泳分离测定生物胺（腐胺、尸胺、精胺、亚精胺）的方法，检测限为100-400nmol/L、理论塔板数达105，均高于目前报道的连接UV检测器和激光诱导荧光检测器的毛细管区带电泳方法。5.6胶束电动力学毛细管电泳(MECC） MECC/MEKC是1984年首次出现的。这一技术最大特点是使毛细管电泳有可能在用于分离离子化合物的同时进行中性物质的分离，因此扩展了毛细管电泳的应用范围。Rodriguez等以荧光异硫氰酸酯（FITC）为衍生剂，用连接荧光检测器的MECC方法分离了八种生物胺（腐胺、组胺、酪胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺、亚精胺），检测限达到10-8mol/L。5.7生物传感器生物传感器是利用酶、组织、抗原、抗体等生物活性物质作为传感器的探针（电极）与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器将这些反应转换成可以输出检测的信号（如电压、频率等），通过分析信号对被测物进行定性和定量。在生物胺分析方法中，主要研究的是电化学生物传感器。其原理是：生物胺在单胺氧化酶（monaminoxidase,MAO）或二胺氧化酶（diamineoxidase,DAO）的催化下脱去氨基生成醛、氨和过氧化氢，反应过程如下：(MAO/DAO)RCH2NH2+O2+H2ORCHO+NH3+H2O2通过测定反应产生的H2O2的量来确定样品中生物胺的含量。Draisci等[18]研制了一种测定生物胺的电化学生物传感器，检测了八种生物胺，将已经固定了DAO的膜绑定在铂电极的外套上，并与铂电极的端部紧密接触，H2O2感应器由一个铂电极和一个固定的银/氯化银电极构成，测定的线性范围1×10-6～5×10-5mol/L，检测限5×10-7mol/L。酶生物传感器的关键在于酶源的选择和酶敏感层的制备。不同来源的酶制成的传感器，选择性、稳定性和灵敏度都有所不同。Tombelli和Mascini[19]利用DAO研制了三种电化学生物传感器，他们通过对组胺的测定研究发现：电化学生物传感器测定生物胺可以得到较低的检测限。采用同一种生物来源酶的不同传感器对生物胺的选择性相当一致，而同一传感器采用不同生物来源的酶时对生物胺的选择性将会发生改变。电化学生物传感器作为食品中生物胺含量的初步筛选方法，具有简便、快速的特点因所用的酶主要是从自然界筛选而来，成本高、难保存、不能反复使用。因此，该方法仍处于实验室研究阶段。5.8薄层色谱（TLC） 薄层色谱是一种简便、快速的分析方法。现已有效地应用于临床和生化检验、毒物分析、药材及其制剂真伪的鉴定、质量控制、含量测定和资源调查等方面。Shalaby[20，,21]报告了一种可同时分离测定食品中组胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、酪胺、色胺、精胺、亚精胺等八种生物胺的半定量薄层色谱法。薄层板规格为20×20cm表面涂有0.25mm厚硅胶的铝薄板，衍生剂为丹磺酰氯。采用二次展开技术，展开系统1.氯仿/苯/三乙胺（6：4：1v/v/v）；2.苯/丙酮/三乙胺（10：2：1v/v/v/），于360nm紫外条件下对色谱板进行观察，以确定样品中是否存在目标生物胺。然后，采用岛津色谱扫描仪在254nm条件下对色谱板进行扫描，根据每个斑点的吸光值进行定量计算。标准曲线的线性良好，r2为0.97~0.997。该方法可在两小时内同时测定14个样品，尸胺腐胺、组胺、亚精胺、酪胺的定量限为5ng；色胺、精胺、苯乙胺的定量限为10ng。该方法应用于测定鱼类、肉类和奶酪样品中生物胺含量的前期筛选简便快捷。与其它分析方法相比，TLC法无需昂贵的分析仪器，费用低，操作简便、快捷，对食品中生物胺的定性与半定量测定，可有效降低监控成本。6生物胺—腐胺产生的路径解析生物体中有几种途径均可合成腐胺。而且，腐胺的生物合成受到相应基因的控制。具体详述如下：6.1鸟氨酸产腐胺鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶（ODC）的作用下可直接产生腐胺。鸟氨酸脱羧酶（ODC）受speC基因的控制。6.2胍基丁胺产腐胺在一些肠道菌中，胍基丁胺可通过胍基丁胺酶的作用直接转变为腐胺。胍基丁胺酶受speB基因的控制。6.3ADC路径产腐胺在一些假单孢菌和气单孢菌中，首先，精氨酸在精氨酸脱羧酶（ADC）的作用下转变为胍基丁胺。精氨酸脱羧酶(ADC)受speA基因的控制。胍基丁胺在胍基丁胺脱亚胺酶（AgDI）的作用下转变为N-氨甲酰基腐胺。胍基丁胺脱亚胺酶(AgDI)受aguA基因的控制。然后在N-氨甲酰基腐胺氨基水解酶的作用下，脱去N-氨甲酰基腐胺上的脲基，转变为腐胺。该水解酶受aguB基因的控制。另外，腐胺氨甲酰基转移酶也可以使N-氨甲酰基腐胺转变成腐胺。7腐胺合成基因的鉴定