大学生物化学简答题总结(蛋白质)免费

第二章蛋白质蛋白质分类1、根据蛋白质分子的外形，可以将其分作3类。①球状蛋白质：分子形状接近球形，水溶性较好，种类很多，可行使多种多样的生物学功能。②纤维状蛋白质：分子外形呈棒状或纤维状，大多数不溶于水，是生物体重要的结构成分，或对生物体起保护作用，如胶原蛋白和角蛋白。有些可溶于水，在一定的条件下聚集成固态，如血纤维蛋白原。还有一些与运动机能有关，如肌球蛋白。有些纤维状蛋白质是由球蛋白聚集形成的，一般归类于球蛋白，如微管蛋白和肌动蛋白。③膜蛋白质：一般折叠成近球形，插入生物膜，也有一些通过非共价键或共价键结合在生物膜的表面。生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。2、根据分子组成可将蛋白质分为两类。（1）简单蛋白质：仅由肽链组成，不包含其它辅助成分的蛋白质称简单蛋白质（simpleprotein），按照溶解度的差别，可将简单蛋白质分为7类，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白（2）结合蛋白质：结合蛋白质（conjugatedprotein）由简单蛋白质和辅助成分组成，其辅助成分通常称为辅基。根据辅基的不同，结合蛋白质可分为5类：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和金属蛋白。3、按功能将蛋白质分为10类。（1）酶：酶是具催化活性的蛋白质，是蛋白质中种类最多的类群，新陈代谢的每一步反应都是由特定的酶催化完成的。（2）调节蛋白：许多蛋白质具有调控功能，这些蛋白质称为调节蛋白。其中一类为激素，如调节动物体内血糖浓度的胰岛素，刺激甲状腺的促甲状腺素，促进生长的生长素等。另一类可参与基因表达的调控，它们能激活或抑制基因的转录或翻译。（3）贮存蛋白质：有些蛋白的生物功能是贮存必要的养分，称贮存蛋白。例如，卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮源。许多高等植物的种子含高达60%的贮存蛋白，为种子的发芽准备足够的氮素。铁蛋白能贮存铁原子，用于含铁蛋白如血红蛋白的合成。（4）转运蛋白质：主要有两类，一类存在于体液中，如血液中的血红蛋白转运氧气，血清蛋白转运脂肪酸。另一类为膜转运蛋白，能在膜内形成通道，被转运的物质经它进出细胞。（5）运动蛋白：生物的运动也离不开蛋白质，如肌肉收缩是由肌球蛋白和肌动蛋白的相对滑动来实现的，细胞内的细胞器移动是通过细胞骨架的某些蛋白质实现的。（6）防御蛋白和毒蛋白：有些蛋白质具有防御和保护功能，如抗体能够与相应的抗原结合而排除外来物质对生物体的干扰。凝血酶作用于血纤蛋白原使血液凝固，防止血液的流失。南极和北极的鱼含有的抗冻蛋白能防止低温下血液冷冻，病毒外壳蛋白可保护其核酸免遭破坏。毒蛋白包括动物毒蛋白，蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋白，植物毒蛋白，如蓖麻毒蛋白。细菌毒素蛋白，如白喉毒素和霍乱毒素。（7）受体蛋白质：是接受和传递信息的蛋白质，如激素的受体。（8）支架蛋白：能通过蛋白-蛋白相互作用将多种不同的蛋白质装配成复合体，参与激素和其他信号分子胞内应答的协调和通讯，锚定或导向。如SH2组件（即肉瘤病毒Src蛋白及其家族成员中的SH2结构域）能与含有磷酸化酪氨酸残基的蛋白质结合，SH3组件能与富含脯氨酸残基的蛋白质结合。 （9）结构蛋白：用于建造和维持生物体结构的蛋白质称为结构蛋白，这类蛋白质多数是不溶性纤维状蛋白质，如构成毛发、角、甲的α-角蛋白，存在于骨、结缔组织、腱、软骨组织和皮中的胶原蛋白。（10）异常功能：某些蛋白质具有特殊的功能，如应乐果甜蛋白有着极高的甜度，可作为人工增甜剂。昆虫翅膀的铰合部存在一种具有特殊弹性的蛋白质，称节肢弹性蛋白。某些海洋生物如贝类分泌一类胶质蛋白，能将贝壳牢固的粘附在岩石或其他硬表面上。蛋白质水解蛋白质的水解产物为氨基酸，说明氨基酸是蛋白质的基本组成单位。酸水解：常用6mol/LHCl回流20h，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。 碱水解：蛋白质与5mol/L的NaOH共煮10～20h，也可完全水解，会引起消旋，但色氨酸不破坏。 酶水解：水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破坏，主要用于蛋白质的部分水解。氨基酸混合物的分析分离（1）纸层析 Rf主要与R基的极性有关，溶剂的pH可影响R基的极性，氨基酸与滤纸的吸附作用也影响Rf。（2）离子交换层析 （3）高效液相层析蛋白质的沉淀反应 蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜，或中和了蛋白质的电荷，蛋白质就会从胶体溶液中沉淀出来。有多种方法可以促进蛋白质的沉淀，有些温和的方法可以将非变性的蛋白质沉淀出来，一些强烈的方法则可以使蛋白质变性沉淀。 ①加高浓度盐类用硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等中性盐使蛋白质产生沉淀称盐析法（saltfractionation）。盐析法沉淀的蛋白质不变性，常用于分离制备有活性的蛋白质。不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称为分段盐析。例如血清中加硫酸铵至50%饱和度，则球蛋白先沉淀析出，继续再加硫酸铵至饱和，则清蛋白（白蛋白）沉淀析出。②加有机溶剂酒精、丙酮等有机溶剂和水有较强的作用，可破坏分子水膜，使蛋白质沉淀。溶液的pH在等电点时，沉淀效果更好。在低温条件下，用有机溶剂沉淀的蛋白质一般不变性，且沉淀的效果比盐析法好。有些结构稳定的蛋白质，如超氧化物歧化酶（SOD），在较高温度下用有机溶剂沉淀也不变性。 ③加重金属盐类蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与氯化高汞、硝酸盐、醋酸铅、三氯化铁等重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。重金属盐类沉淀的蛋白质是变性的，但沉淀的效率很高，常用于除去样品中蛋白质杂质。 ④加某些酸类苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质形成不溶解的盐而使其快速沉淀。沉淀的蛋白质是变性的，常用于沉淀去除样品中的蛋白质杂质。 ⑤加热加热可以使大多数蛋白质变性沉淀，是去除样品中蛋白质杂质的常用方法。不过，有些蛋白质在加热变性后并不沉淀，如乳品中的蛋白质。18、 蛋白质的含量测定 测定可溶性蛋白的含量，除上述双缩脲法和酚试剂法外，常用的方法还有： ①考马斯亮蓝染色法蛋白质可用考马斯亮蓝在室温下染色，反应迅速，约2min可完成，生成物稳定，测定蛋白质含量的灵敏度较高，近年来被广泛使用。 ②紫外吸收法由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm左右有强烈的光吸收，可用这一性质测定溶液中的蛋白质含量。此法不需要任何反应，直接测定蛋白质溶液的A280nm和A260nm，用下列公式可算出蛋白质浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280nm－0.47A260nm 这一方法准确度不很高，但是十分简单方便，在分子生物学实验中常用。③凯氏定氮法测定包括可溶性蛋白和不溶性蛋白的总蛋白含量，只能用本章2.1.1介绍的凯氏定氮法，这一方法的缺点是不能区分蛋白氮，和非蛋白有机氮，计算时，将所有的有机氮均看作蛋白氮，因此，将计算出的蛋白含量称作粗蛋白含量。此外，计算时所用的系数6.25对某些蛋白质是不合适的，需要用校正后的系数。不过，测定总蛋白含量，尚未找到取代凯氏定氮法的更好方.法。 ④其他方法微量的可溶性蛋白还可用胶体金法和免疫学方法测定，有活性的蛋白质，如酶和激素，可直接测定其生物学活性。对蛋白质混合物进行凝胶电泳后染色，再进行扫描分析，或用图像分析系统分析照片，可以测定各种蛋白质成分的相对含量。蛋白质的分离和分析技术（1）根据蛋白质溶解度不同进行分离 ①盐析蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5～5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。　　蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析的办法除盐，所需时间较短。②等电点沉淀法蛋白质在等电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法和有机溶剂沉淀法结合使用。 ③低温有机溶剂沉淀法常用可以与水混溶的有机溶剂如乙醇或丙酮去除蛋白质的水膜，同时，将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀，此法沉淀效率比盐析法高，但蛋白质较易变性，只用于分离某些较稳定的蛋白质，并应在低温下进行。作用机理： 降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低； 破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。 经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。 优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。注意： ①有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。 ②样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。 ③在样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pH，即与等电点沉淀结合使用。 ④中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加0.05mol/L的中性盐。由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。注意离子强度，离子种类的影响。（2）根据蛋白质分子大小进行分离 ①透析与超滤透析法是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖和氨基酸等分开。 超滤法是利用高压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子质量的蛋白质。现在已有各种市售的超滤膜装置可供选用，有加压、抽滤和离心等多种形式。滤膜也有多种规格，他们截留相对分子质量不同的蛋白质。使用中最需注意的问题是滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞，使超滤速度减慢，能被截留物质的Mr变小。超滤的主要应用： 浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质，并逐渐分离纯化出大分子物质。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。②凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。其要点是，用凝胶颗粒填装层析柱，将蛋白混合物加到柱上进行洗脱时，大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙移动，现被洗脱出来，小分子可以进入凝胶颗粒内部后被洗脱出来，从而使各种蛋白质得以分离。常用的填充材料是葡聚糖凝胶（Sephadexgel）和琼脂糖凝胶（agarosegel），近年来常用的Sephacryl等新型凝胶有更好的强度和稳定性，分别率更好。③密度梯度离心（3）根据蛋白质带电性质进行分离 ①电泳法现时常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异（电荷效应），和大小差异（分子筛效应）高分别率地分离或分析蛋白质。在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS），消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统，是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。等电聚焦电泳是在PAGE中加入一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质，也可用于测定蛋白质的等电点。②离子交换层析法离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；即CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；即DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强，随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附力从小到大的顺序先后洗脱下来。近年来常用的离子交换剂是DEAE-sepharoseFF和CM--sepharoseFF，其分离效果比离子交换纤维素好。 在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。（4）根据配体特异性进行分离 亲和层析法（aflinitychromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，通常只需经过一步处理，即可将待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是将称为配体（Ligand）的分子共价结合在层析柱中的固体材料上，蛋白质混合物流经层析柱时，目标蛋白与配体结合被层析柱中的固体材料截留，而非目标蛋白则不能与层析柱中的固体材料结合。先洗脱除去杂蛋白，再用含游离配体的洗脱剂将目标蛋白替换下来，从而分离纯化目标蛋白的。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相，而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化目的。例如，既可把辅酶作为固定相，分离纯化样品中的酶，也可把酶作为固定相，分离纯化样品中的辅酶。（5）利用选择性吸附的纯化方法（6）高效液相层析和快速蛋白液相层析 高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，HPLC），又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。蛋白质分子中氨基酸序列的确定（1）多肽链的分离 如果蛋白质分子含一条以上的多肽链，则首先须分离纯化各肽链。多聚蛋白质的亚基之间是借助非共价相互作用缔合的，所以可以用8mol/L尿素，或6mol/L盐酸胍，或高浓度盐处理，使多聚蛋白质中的亚基分开。一旦拆分后，可根据大小和/或电荷的不同分离各肽链。（2）二硫键的断裂 断开多肽链的链内二硫键（如果是链间二硫键，步骤2须先于步骤1进行）常用的方法有：（a）过甲酸氧化切割；（b）巯基化合物如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）还原切割，随后与碘乙酸反应保护游离的－SH。（3）氨基酸组成的分析 常用6mol/LHCl水解蛋白质，水解产物中的各种氨基酸可用氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，用水合茚三酮法检测其含量。也可用Edman反应将氨基酸转化为苯硫乙内酰脲衍生物，再用高效液相色谱进行定量分析。氨基酸分析不能直接给出多肽链中每种氨基酸残基的数目，但可以得出各种所得氨基酸的比率或百分含量。此外，在酸水解过程中，Trp被破坏，需要通过碱水解或酶水解另行测定。Gln和Asn分别被水解为Glu和Asp，在测序以后才能区分Gln和Glu，及Asn和Asp。 （4）N-末端残基的鉴定 鉴定N-末端的氨基酸残基常用本章2.2.3所述的2,4-二硝基氟苯（DNFB）的反应，或丹磺酰氯反应。异硫氰酸苯酯（PITC）反应也可用于鉴定N末端的氨基酸残基，但主要是用于测定肽段的氨基酸序列。某些蛋白质的N末端氨基被封闭，需要用氨肽酶水解来鉴定N末端的氨基酸残基。①二硝基氟苯（DNFB）法（Sanger法）: 2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。②丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到1´10-9mol，比DNFB法灵敏100倍。③异硫氰酸苯酯（PITC）法:N末端氨基酸生成相应的PTH（苯乙内酰硫脲）–AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定。 ④氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。（5）C-末端的测定 ①还原法C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。 ②肼解法多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。③羧肽酶法将蛋白质在pH8.0，30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。（5）多肽链的裂解由于现用的各种测定氨基酸序列的方法，只能连续测定较小的肽段，因此，需要用两种以上不同的方法，在不同的切割位点将长肽链裂解成两套以上大小不等的小肽段，分离后分别测序，然后拼接成长肽链（6）肽段氨基酸序列的测定 ①Edman法苯异硫氰酸酯与蛋白质的游离氨基结合，N-端的氨基酸会从多肽链切割下来，进一步生成苯乙內酰硫脲氨基酸（PTH）衍生物，PTH衍生物可以用色谱法进行鉴定。在弱碱性溶液中，多肽链的其它部分没有发生变化，因此该法可以连续测定N-末端的氨基酸残基，确定肽段氨基酸序列。Edman将这一方法用于氨基酸序列测定，称Edman降解法（Edmandegradation），是氨基酸序列测定的常规方法，现已经设计出用来测序的自动仪器（Edman序列仪）。不过，该仪器只能连续测定几十个氨基酸残基，若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.54。②质谱法测序质谱法的分析原理是在磁场中运动的带电粒子，由于其质量与携带电荷的比值（质荷比）不同，以不同的速度和偏转角度穿过磁场，按一定的次序进入监测器，由此来判断粒子的质量和特性。串联质谱法（MS/MS）可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按质荷质比分离，依次经碰撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。质谱法测序可以同时进行肽段的分离和序列分析，由于不需要分离肽段，分别用Edman法测序，再进行拼接，大大地提高了测序的效率，适合于对蛋白质序列进行高通量的研究，在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。蛋白质组学的基本方法是用双向电泳分离蛋白质，选取目标斑点，再用串联质谱法测序。③根据核苷酸序列推断法由于测定DNA的核苷酸序列比测定蛋白质的氨基酸序列容易得多，对于较长的肽链，常用的策略是分离编码该肽链的基因，测定其核苷酸序列，再用遗传密码推断氨基酸序列。④降解法 可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。（7）肽段的拼接 如前所述，长肽链需要裂解成两套以上大小不等的小肽段，分离后分别测序，然后进行拼接。肽段的基本方法是，先从一套肽段中选定一个肽段，再从另一套肽段中寻找与其有部分重叠的肽段，如此反复交替从两套以上肽段中寻找有部分重叠的肽段，即可将肽段拼接起来。（8）二硫桥位置的确定 若肽链中有多个半胱氨酸残基，则需要确定二硫键的位置。要找到含二硫键的肽段，常用的方法是对角线电泳。其要点是在不断裂二硫键的情况下，将蛋白质水解成小肽段（常用胃蛋白酶），在一块方形滤纸上先对水解产物进行一次电泳，用过甲酸处理滤纸断裂二硫键后，将滤纸旋转90°，再用与第一次电泳完全相同的条件进行第二次电泳。在过甲酸处理时未发生变化的肽段，在两次电泳中的迁移率相同，将位于滤纸的对角线上。含二硫键的肽段由于二硫键断裂，在两次电泳中的迁移率不同，会偏离对角线。将偏离对角线的肽段洗脱下来，分别测定其序列，通过与完整肽链对比，即可找出二硫键的位置。