丹参溢心胶囊微生物检查法验证

丹参溢心胶囊微生物检查法验证[摘要]目的：建立丹参溢心胶囊微生物限度检验方法。方法：在样品1：10，1：50和1：100中加入阳性试验菌，用2种方法测定回收率来确定适宜的检验方法。结果：丹参溢心胶囊在1：10有抑菌作用，稀释到1：50抑菌消除。结论：细菌数测定用培养基稀释法测定，霉菌、酵母菌测定用直接法，控制菌用常规法。[关键词]丹参溢心胶囊；抑菌作用；微生物限度检查法[中图分类号]1128.0　[文献标识码]A　[文章编号]1007-8517(2011)09-0041-02为探讨丹参溢心胶囊微生物限度，我们对该药品的微生物限度检查进行了细菌，霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法验证。1、试验材料1.1试药与培养基营养肉汤、营养琼脂、玫瑰红钠、改良马丁培养基PH7.0氯化钠－蛋白胨缓冲液(均来源于中国生物制品检定所)氯化钠分析(汕头市西陇化工有限公司)。1.2样品丹参溢心胶囊，批号为2010021，20100418，20100719由云南文山特安呐制药有限公司生产，编号为1，2，3。6 1.3仪器电热鼓风干燥箱(型号：DG101－1A，北京市永光医疗仪器厂)；隔水式电热恒温培养箱(型号：PYX-34×40，上海市跃进医疗器械七厂)；电子恒温水浴锅(DZ－KW－4，上海科析试验仪器厂)；电热手提式压力蒸汽消毒器(型号：YXQ1280，上海医疗用核子仪器厂)；电子恒温水浴锅(DZKW－4，上海科析试验仪器厂)。1.4阳性对照菌枯草芽胞杆菌[CMCC(B)63501]，大肠埃希菌[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)980003]。均由云南省食品药品检验所提供。2、实验方法与结果2.1供试液的制备分别取供试品10g，加入PH7.0氯化钠―蛋白胨缓冲液至100ml，45℃水浴15分钟混匀，制成1：10的供试液，取2ml加入8mlPH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液混匀，制成1：50的供试液，取1ml加入9mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液混匀，制成1：100的供试液，备用。2.2菌液的制备6 ①取经36±1℃培养24h的大肠埃希菌，枯草芽胞杆菌，金黄色葡萄球菌的肉汤培养物1ml，用0.9％氯化钠溶液稀释到10-5－10-7。②取经26±1℃培养18-24h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1ml，用0.9％氯化钠溶液稀释到10-6。③接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23－28℃培养5-7天，加人3ml0.9％氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出1ml，用0.9％氯化钠溶液10倍稀释到10-51ml。以上三种使成每1ml含50-100cfu，经活菌计数备用。2.3回收率测定2.3.1直接接种法每组平行试验2份①试验组取供试液1ml，加入各菌液1ml，立即倾注相应的琼脂培养基；②菌液组取上述菌液1ml注入平皿后，立即倾注相应的琼脂培养基；③供试品对照组取供试品1ml，立即倾注相应的琼脂培养基；④取稀释液1ml注入平皿，立即倾注相应的琼脂培养基，作阴性对照。大肠埃希菌，枯草芽胞杆菌，金黄色葡萄球菌的平皿注入营养琼脂培养基，37℃培养48h，白色念珠菌和黑曲霉的平皿注入玫瑰红钠培养基，置25-27℃培养72h。结果见表1。2.3.2培养基稀释法平行试验2份。①试验组取1：10，1：56 0、1：100供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，加入枯草芽胞杆菌菌液1ml，立即倾注相应的琼脂培养基；②菌液组取菌液枯草芽胞杆菌1ml注入平皿后，立即倾注相应的琼脂培养基；③供试品对照组取供试品1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，立即倾注相应的琼脂培养基；培养。结果见表2。2.4回收率的计算方法试验组回收率＝(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数×100％2.5控制菌检查法验证本品为口服制剂，按2005年药典标准检查控制菌是大肠埃希菌，平行试验2份。①供试液对照组：取1：10供试液10ml接种于100ml的胆盐乳糖增菌液；②试验组：按方法①再加入1ml相应的阳性对照菌，混匀；③阴性对照组：按①取样后，胆盐乳糖增菌液中加1ml金黄色葡萄球菌；④阳性对照组：取1ml大肠埃希菌加入100ml胆盐乳糖增菌液中。于36±1℃培养24h。取上述培养物0.2ml，加入含5mlMUG培养基的试管内，培养，用MUG培养基作对照，分别于5h和24h在360nm紫外线下观察。沿管辟加入靛基质试液数滴，观察。试验结果：供试品对照组未检出大肠埃希菌，阳性对照组检出相应的阳性菌。阴性对照组未检出大肠埃希菌，结果表明可用常规法进行检查。3、讨论6 丹参溢心胶囊是由三七、紫丹参、灯盏细辛等组成，主要用于活血化瘀，具有一定的抑菌作用。从表1、2可见，样品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率大于70％。证明其对上述4种菌无抑菌作用。枯草芽胞杆菌有抑菌作用，在1：10稀释级回收率均不过20％，1：50、1：100稀释级回收率均大于70％，故1：10稀释级应采用培养基稀释法测定该样品的微生物限度，在1：50、1：100稀释级可用常规方法测定。根据上述结果，丹参溢心胶囊在生产工艺，组成成份及原检验条件不变时，微生物限度检查细菌数测定用培养基稀释法，霉菌和酵母菌数测定用直接法，控制菌用常规法测定。参考文献：[1]中国药典[s]，一部，2005：附录71－74[2]中国药品生物制品检定所，中国药品操作规范[M]，北京：中医药科技出版社，2005：335－341[3]杜鹃，范兵三，高茶的微生物限度检查方法验证研究[J]，中国药事，2006，20(3)：156－158[4]陆蓓，凌明，栓剂的微生物限度检查方法的验证[J]，中国药事，2006，20(3)：167－168[5]孙玲兰，双黄连口服液微生物限度检查法验证[J]，中国药师，2008，11(1)：102－103[6]吴潇，乌洛托品溶液的微生物限度检查[J]，中国药师，2007，10(12)：1261－12626 [7]张雪原，林晓辉，三种医院制剂微生物限度检查法的建立[J]，中国药师，2008，11(8)：1004－1006[8]张蓓，荷叶降脂胶囊微生物限度检查方法的验证[J]，中国药事，2010，24(10)：1017－1018[9]林常定，依沙吖啶溶液的微生物限度检查法[J]，中国药师，2010，13(4)：597－5996