土壤微生物群落磷脂脂肪酸(plfas) 生物标记多样性分析

9土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记多样性分析基金项目:福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIF-Y03)，福建省自然科学基金资助项目(B0410024)；福建省烟草专卖局科技计划项目（闽烟科[2006]18号）；福建省农科院预试课题(A2006YYS09)FoundationItem:TheprojectwassupportedbyspecificprojectofFujianFinancefortheFundofScienceTechnologyInnovationTeamofFujianAcademyofAgriculturalSciences(STIF-Y03);NaturalScienceFoundationofFujian(N0.B0410024);FujianTobaccoCompanySci-technologyproject(MYK[2006]No.18);Pre-projectofFujianAcademyofAgriculturalSciences(A2006YYS09)作者简介：张秋芳（1973-），女，福建闽清人,硕士，副研究员，主要从事环境微生物及生化物质分析研究。E-mail:qfzhang@163.com;手机(0)13055748230Biography:ZHANGQiu-fang(1973-),Master,AssociateResearcher,mainlyengagedinenvironmentalmicrobiologyandbiochemicalsubstanceanalyse.E-mail:qfzhang@163.com**通讯作者:刘波，男，博士，研究员，主要从事微生物生物技术和微生物防治研究，Correspondedingauthor:E-mail：fzliubo@163.com。张秋芳1，刘波1**，林营志1，唐莉娜2，史怀1，杨述省1，周先冶1（1福建省农科院农业生物资源研究所，福建福州350003；2福建省烟草公司，福建福州350003）摘要:以磷脂脂肪酸(PLFAs)作为生物标记是一种可定性和定量地分析土壤微生物群落多样性的方法。本研究应用生态学评价方法，即结合Shannon-Wiener(H1)､Brillouin(H2)､Mcintosh(H3)多样性指数､丰富度指数(S)和Pielou均匀度(J)､Simpson优势度指数(D)等各多样性指数测度方法，以烟草土壤为例，分析土壤中微生物PLFAs生物标记的多样性､丰富度和均匀度。研究结果表明：不同生长阶段供试烤烟土壤微生物群落中，先后出现了43种PLFAs，PLFAs的生物量于生长后期为最高；各PLFAs的各多样性指数､丰富度和均匀度皆不相同。根据各PLFAs生物标记的含量大小，经聚类分析后得出，可以将其依次分成五大类：Ⅰ类为高含量、高频次和多样性，PLFAs为18:1ω9c的真菌生物标记；第II类：含量仅次于第I类，较高频次和多样性指数，PLFAs为16:0的假单胞菌标记；第III类：较高含量和频次，多样性中等，PLFAs为16:1ω5c的甲烷氧化菌生物标记；第IV类：中等含量，频次较高，多样性中等，含有表征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的PLFA，还有表征厌氧细菌的18:1ω7c以及硫酸盐还原细菌的16:010Me；第V类：低含量，低频次和多样性，其特征生物标记有表征好氧菌的i15:03OH、15:1iG、a16:0、i16:1G、i16:1H、17:0、i17:0、15:02OH、15:03OH、17:0和17:02OH的PLFA，存在有表征真菌的18:3ω6c(6,9,12)、放线菌的17:010Me和18:010Me以及表征原生动物的20:4ω6,9,12,15c。关键词:土壤；微生物群落；磷脂脂肪酸(PLFAs)；生物标记；多样性ThediversityofphospholipidfattyacidsbiomarkerforthemicrobialcommunityinsoilsZHANGQiu-fang1,LIUBo1*,LINYing-zhi1,TANGLi-na2,SHIHuai1,YANGShu-sheng1andZHOUXian-zi1(1AgriculturalBioresourceInstitute，FujianAcademyofAgriculturalSciences，Fuzhou，Fujian350003，China;2FujianTobaccoCompany，Fuzhou，Fujian350003China）Abstract：Phospholipidfattyacidswasusedasakindofbiomarkerstodetectedthemicrobialcommunitydiversityqualitativelyandquantitatively.Thediversityofphospholipidfattyacidsinthetobaccosoilswasanalyzed,firstlycombiningwiththeevaluationmethodsofecology,suchasShannon-Wiener（H1）,Brillouin（H2）andMcintosh（H3）diversityindexes，theabundance(S)， 9Pielouevenness（J）andSimpsonindex（D）.Theresultshowedthat:thetotal43kindsofPFLAsinthesoilswhichweretestedinthedifferentgrowingperiodsoftobacco,thebiologicalamountofPLFAswerethehighestinthelastgrowingperiodin90days,andthevaluesofdiversity,abundanceandevennessforbiomarkerswerechangebleinthetobaccofields,thatimpliedthemicrobialcommunityfluctuated.The43kindsofPFLAsbiomarkerscouldbedividedinto5groupsasfollows:NO.1was18:1ω9ccharacterizedwithhighquantity,highfrequencyanddiversity,belongingtoFungi;NO.2had16:0whichwashighquantityonlylessthanthatofNo1,highfrequencyandhighdiversity,belongingtoPseudomonas;NO.3had16:1ω5cwithcharacteristicsofhighquantity,highfrequencyandmoderatediversity,belongingtoMethanotrophs;NO.4hadi15:0,a15:0,i16:0anda17:0whichwererelatedtoAerobicBacteric’sPLFAsbiomarkers,18:1ω7cwhichwasAnaerobe’sPLFAsbiomarkers,16:010MewhichwasSulfateReducingBacteriaPLFAsbiomarkers,thoseofPLFAsbiomarkersweremoderatequantityanddiversity,highfrequency;NO.5hadi15:03OH,15:1iG,a16:0,i16:1G,i16:1H,17:0,i17:0,15:02OH,15:03OH,17:0and17:02OHwhichwereAerobicBactericPLFAsbiomarkers,18:3ω6c(6,9,12)whichwasfungi,17:010Meand18:010Mewhichwereactinomyces,20:4ω6,9,12,15cwhichwasprotozoa,thoseofPLFAsbiomarkerswerelowquantity,frequencyanddiversity.Keywords：Microbialcommunity;Phospholipidfattyacids(PLFAs);Soil;Biomarker;Diversity前言土壤微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一[1]，土壤微生物多样性，代表着土壤生物活性的特征，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。磷脂脂肪酸（phospholipidsfattyacids，PLFAs)存在于活体微生物细胞膜，分布广泛、含量相对恒定、周转迅速，而且对环境因素的变化敏感、分析方法较简单[2,3,4]，用于鉴定土壤微生物种类和识别微生物类群，具有较高的准确性、稳定性和敏感性，被认为是最有潜力生物标记（biomarker）之一[5,6]，广泛地应用于土壤微生物种类和类群的分析。PLFA谱图分析方法的原理是基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，不同类群的微生物可通过不同的生化途径合成不同的PLFA，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定，它具有结构多样性和微生物特异性，土壤中PLFAs的存在及其丰度可揭示特定微生物种类或微生物类群的特性[6]，代表着土壤中微生物群落结构微生物指纹图谱，不同土壤微生物菌群的脂肪酸生物标记（PLFAs）特征指纹谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群落中不同群体的生物标记[7]。因此，PLFA可以作为微生物多样性指示性的生物标记，阐明土壤样品中微生物群落结构的变化，可以对微生物群落进行识别和定量描述，并为进一步的研究提供相关信息。利用PLFA研究土壤微生物结构变化有过许多的报道，Priha等用PLFA法对某森林中松树、云杉、桦树下土壤进行研究，发现不同树种下的土壤微生物群落结构明显不同，桦树土壤中革兰氏阴性菌(如假单胞菌)数量很多，松树和云杉土壤中革兰氏阳性菌数量则较多[8]。且用于分析PLFA谱图的方法常见的主要有直接将所测得的PLFA用主成分分析（PCA）、部分最小二乘法识别（D-PLS）和群落多余度分析（RDA）等方法[7]进行分析，而利用生态学的分析方法研究土壤微生物PLFAs生物标记的多样性变化来体现土壤微生物群落功能多样性的变化至今尚未见报道。因此，基于微生物磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的特异性和多样性等特点，本研究拟应用生态学的观点，借用各生物多样性指标为评价参数，以烟草土壤微生物磷脂脂肪生物标记为例，并以磷脂脂肪酸的数量和结构作为研究对象，根据微生物磷脂脂肪酸的特异性，揭示土壤微生物群落的动态变化，为了解烤烟施肥技术对土壤微生物群落多样性影响提供参考依据，并建立起一种用以评价土壤微生物群落功能多样性的新的评价方法和模式。 91材料与方法1.1供试材料供试土壤取自福建省烟草农业研究所试验基地。供试烤烟品种为K326。试验土壤为水稻土，前茬作物为水稻。供试烟田土壤基本理化性状：土壤pH值5.0,有机质20.9g/kg，碱解氮99.0mg/kg，速效磷8.8mg/kg，速效钾87.0mg/kg，水溶性氯2.0mg/kg。所用有机肥均为完全腐熟，各种有机肥养分含量：菜籽饼肥的全N43.0g/kg，P2O528.0g/kg，K2021.0g/kg；鸡粪（福建圣农养鸡场提供）全N23.0g/kg，P2O529.0g/k，K2034.0g/kg？。烟草栽培试验自2007年3月进行，共设不施肥（CK）、施用纯化肥、25%菜籽饼肥、25%鸡粪4个处理，每处理重复3次。田间管理按烟草生产标准进行。取烤烟定植后0d（基础土样）、30d、60d和90d耕作层烟草根际土壤新鲜土样，混匀，进行磷脂脂肪酸的提取和测试分析。1.2土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记分析方法土壤微生物群落结构分析，采用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记法。磷脂脂肪酸的提取过程和分析参考Frostegård和Kourtev方法[9,10]，操作步骤为：将20ml的0.2moL/L的KOH甲醇溶液和4g的新鲜土样加到50ml的离心试管中，混合均匀，在37℃下温育1h(脂肪酸释放，并甲脂化，样品10min涡悬1次)。加入3ml1.0mol/L的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀。加10ml正己烷，使磷脂脂肪酸（PLFAs）转到有机相中，600r/min离心15min后，将上层正己烷转到干净试管中，在N2气流下挥发掉溶剂。将磷脂脂肪酸（PLFAs）溶解在1ml体积比为1:1的正己烷:甲基丁基醚溶液中,用作GC分析。采用美国Agilent6890N型气相色谱仪，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，l70℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃、检测器温度300℃；载气为H2(2ml/min)、尾吹气为N2(30ml/min)；柱前压l0.00psi(1psi=6.895kPa)；进样量lμl，进样分流比100:1。磷脂脂肪酸（PLFAs）的鉴定采用美国MIDI公司(MIDI,Newark,Delaware,USA)开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的SherlockMIS4.5系统(SherlockMicrobialIdentificationSystem)。1.3数据分析（1）PLFAs生物标记指纹图谱及其数据利用将脂肪酸分析结果绘制成指纹图谱图，将相关参数列表。对指纹图谱进行解读和对脂肪酸分析的参数进行说明，对利用的数据进行归类。（2）PLFAs生物标记数量结构分析将分析结果重复处理计算平均值，构建以脂肪酸生物标记为样本，以不同处理施肥方法为指标的数据矩阵，分析特征脂肪酸生物标记在不同施肥处理土壤中的变化，揭示土壤特征微生物的变化。（3）PLFAs生物标记多样性分析本研究将脂肪酸生物标记作为数量测度，引入生态学多样性测度Shannon-Wiener（H1）[11,12]、Brillouin（H2）[13]、Mcintosh（H3）[11]多样性指数、丰富度指数(S)[11,14]和Pielou均匀度（J）[11,14]、Simpson优势度指数（D）[14]等方法，分析微生物PFLAs生物标记。1）Shannon-Wiener多样性指数（H1）计算公式为[11]：H=-∑PilnPi式中，Pi=Ni/N，Ni为处理i的特征脂肪酸个数，N为该试验中总特征脂肪酸个数。S为特征脂肪酸i在供测土样中出现的次数，即丰富度指数[11]。2）Pielou均匀度指数（J） 9计算公式为[11]：J=-∑PilnPi/lnS式中S为群落中的脂肪酸的总种类数。3）Simpson优势度指数（D[14]）计算公式为：D=1-∑Pi2，式中，Pi种特征脂肪酸占该试验中总的特征脂肪酸个数比例。4）Brillouin多样性指数（H2）[13]计算公式为：H2=式中，n1为第1个磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的个体数量，n2为第2个磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的个体数量，ni为第i个磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记的个体数量，N为所有供试处理中磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记出现的个体总和。I5）Mcintosh多样性指数（H3）[11]计算公式为：H3=式中，N为特征脂肪酸总数；Ni为第i个处理的土样微生物特征脂肪酸个数；S为磷脂脂肪酸生物标记（PLFAs）生物标记总种类数。（4）土壤微生物群落PLFAs生物标记数聚类分析以不同施肥处理数据为指标，以脂肪酸生物标记为样本，构建分析矩阵。以欧氏距离（EuclidianDistance）为聚类分析的尺度，用最短距离法对矩阵进行系统聚类，分析利用多样性指标将脂肪酸生物标记归类的结果，阐明其相似程度。2结果与分析2.1土壤微生物群落PLFAs生物标记指纹图谱及其数据利用的诠释试验结果见图1和表1。图1为从土壤样品Z-7中所提取的微生物PFLAs进样后所得到的气相色谱图，为该样品中所提取到的总PFLAs的图谱。其中，横坐标表示各PLFAs在气相色谱中出现特征峰的时间，纵坐标则表示各PLFAs的峰高。 9图1.烟草土壤样品Z-7微生物群落磷脂脂肪酸气相色谱图Fig1.Chromatogramprofileofphospholipidsfattyacidsofmicrobialcommunityinflued-tobaccosoilsampleZ-7表1则为该土壤样品微生物群落PFLAs标记的信息表，是将图1中的气相色谱图信息进行量化，转化成数据形式。其中，retentiontime(RT)表示各PLFAs特征峰的滞留时间；Response表示各PLFAs特征峰的反应区域值，体现了各PLFA的含量；area/heightratio（Ar/Ht）表示反应区域/峰高度比值；RFact表示相关因子系数；theequivalentchainlength(ECL)表示各磷脂脂肪酸的相对链长度；PeakName指各磷脂脂肪酸特征峰名称；Percent是指磷脂脂肪酸各特征峰占总脂肪酸的百分数，Comment1、Comment2表注解1、2。特定的生物标记指示着特定的微生物，总PLFA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的。例如,表1中，TBSA10Me18:0脂肪酸为放线菌的特异性生物标记，其各参数分别为：特征峰滞留时间(RT)值是14.920min，特征峰值Response为8976，表示其相对生物量的大小；面积/峰值比（Ar/Ht）为0.073；因子相关系数（RFact）为0.879；该PLFAs相对链长度(ECL)为18.392；该PLFAs峰名（PeakName）为TBSA10Me18:0，该特征PLFAs占总提取的PLFAs量的百分数（Percent）为1.98，其相对链长度的偏离度为0.000。脂肪酸浓度通常应用标准品甲基十九烷脂肪酸(19:0)作为内标来进行定量测定[1]，可以将表示各特征PLFAs相对生物量的Response值换算成各脂肪酸的具体含量，而且PeakName磷脂脂肪酸各特征峰通过比对可以定性地确定脂肪酸名称[15]。另有研究表明，不同的提取方法，出现的特征峰数量，即PFLAs种类可能不同。在本试验条件下，各供试土壤中所获得的PLFAs生物标记最多的处理有43个特征峰，即可能出现有43种不同的PFLAs可作为生物标记指示土壤微生物群落的多样性。表1.烟草土壤样品Z-7微生物群落磷脂脂肪酸信息表Table2.Phospholipidsfattyacidsinformationofmicrobialcommunityintheflued-tobaccosoilsampleZ-7滞留时间(特征峰值面积/峰值比因子相关系数相对链长度峰名百分数注解1注解2RTResponseAr/HtRFactECLPeakNamePercentComment1Comment21.6986.298E+70.024----7.046SOLVENTPEAK----maxar/ht 914.55338670.051----18.184----14.69610250.0460.88218.26517:02OH0.23ECLdeviates0.01114.78841030.059----18.318----14.92089760.0730.87918.392TBSA10Me18:01.98ECLdeviates0.00015.21716780.059----18.561----15.48156790.051----18.711----15.6427850.0480.86918.803unknown18.8140.17ECLdeviates-0.01115.74525380.0450.86818.861SumInFeature70.55ECLdeviates0.00319:1w6c/.846/19cy15.819144020.0510.86718.90319:0CYCLOw8c3.13ECLdeviates0.001Reference0.00215.99410830.0500.86419.00219:00.23ECLdeviates0.002Reference0.00316.47455810.049----19.279----16.68743260.0490.85519.40220:4w6,9,12,15c0.93ECLdeviates0.00716.81815140.047----19.478----16.96819110.048----19.564----17.04617970.062----19.609----17.21060540.048----19.704----17.3279290.0410.84619.77120:1w9c0.20ECLdeviates0.00117.72360090.0490.84020.00020:01.27ECLdeviates0.000Reference0.00018.18433500.053----20.265---->maxrt18.30178510.085----20.333---->maxrt18.45259350.077----20.420---->maxrt----17676-----------SummedFeature34.2016:1w7c/15iso2OH15:0ISO2OH/16:1w7c----45048-----------SummedFeature510.1318:2w6,9c/18:0ANTE18:0ANTE/18:2w6,9c----2538-----------SummedFeature70.55un18.846/19:1w6c19:1w6c/.846/19cy------------------------19:0CYCLOw10c/19w62.2土壤微生物脂肪酸(PLFAs)生物标记数量和结构分析2.2.1土壤微生物脂肪酸(PLFAs)生物标记数量和结构总体变化（1）脂肪酸(PLFAs)生物标记种类数的变化烟株生长过程中，所采集的新鲜土壤样品中各PLFAs种类和PLFAs特征峰反应值大小如表2所示。从表2可知，各处理的PLFAs种类随着生长时间而变化。不同生长期，烟草土壤中的微生物群落的PLFAs不同，但总的变化趋势一致，即；PLFAs的种类，随生育期的延长呈增加趋势。基础土样中PLFAs主要有14种（4个处理中有3个或以上存在的同一种PLFAs），第30天的土样中PLFAs达到了22种，60天后达到24种，烟叶成熟采收期则稳定地达到了34种；对于整个生育期而言，先后总共出现有43种的PLFAs。（2）特征脂肪酸(PLFAs)生物标记量的变化PLFAs不但在种类上随着生育期的延长而增加，其含量也呈递增的趋势。而对于PLFAs总含量和各特征PLFAs含量而言，因处理和时间而异。尤其是到了烟草叶生长后期，14:0、i14:0、i15:1G、16:010Me、a16:0、16:0Nalcohol、17:0、17:010Me、cy17:0、17:1ω8c、18:0、18:3ω6c(6,9,12)、20:0、20:1ω9c、20:4ω6,9,12,15c和unknown14.502等主要脂肪酸生物标记（PLFAs），不但在总脂肪酸中占主要地位，而且各处理PLFAs含量皆为最高，尽管在整个生长过程，各PLFAs含量的变化趋势有所不同。且生长后期，施用25%鸡粪处理的各PLFAs含量皆高于其它各处理。（3）特征脂肪酸(PLFAs)生物标记分布结构的变化从烟田不同处理组土壤中提取到的43种脂肪酸生物标记，指示着不同类群的微生物，包括细菌、真菌、放线菌、原生生物等。不同脂肪酸生物标记在土壤的分布可分为4种类型：（1）生物标记数量小，在各处理中的分布不完全，如12:0指示着细菌，相对生物量在0到1654；（2）生物标记数量小，在各层次的分布为完全分布，如14:0指示着细菌，相对生物量在519到5918；（3）生物标记数量大，在各层次的分布不完全，如18:010Me 9指示着放线菌，数量在1854-10315之间；（4）生物标记数量大，在各层次的分布为完全分布，如16:0指示着细菌，数量在31320-107126之间。2.2.2土壤特征微生物类群磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记数量和结构的变化（1）特征微生物脂肪酸（PLFAs）生物标记的结构变化从图2可知，对于表征土壤中各大类微生物的特征PLFAs标记而言，其大小顺序为：细菌的i16:0[1]相对生物量（405408）大于表征真菌的18:1w9c[16]（360420）大于表征放线菌的10Me18:0[1]（29178）大于原生动物20:4w6,9,12,15c[6]（25146）。图2土壤微生物类群主要特征微脂肪酸PLFAs相对含量Fig2.TherelativecontentofmainmicrobialcommunitiesvarietiesPLFAsinsoil（2）不同施肥处理组脂肪酸（PLFAs）生物标记的结构变化从图3可知，对于不同处理对各大类土壤PLFAs相对生物量的影响不同，但趋势相似，表征土壤中各大类微生物的特征PLFAsi16:0、18:1w9c、10Me18:0和20:4w6,9,12,15c的相对生物量较为一致，皆为施用25%鸡粪大于25%饼肥大于不施肥的对照处理大于化肥处理。图3施肥处理对主要PLFAs的影响Fig3.TheeffectsoffertilizationtreatmentsonthePLFAscontent 9 18表2烟草土壤微生物各PLFAs的反应区域值的动态变化Table3.DynamicchangesoftheresponsevalueofthePLFAsbiomarkersinsoilsduringinthetobaccogrowth序号Code磷脂脂肪酸生物标记（PLFAs）第0天采样0day(basicsoils)第30天采样30dayscollected第60天采样60dayscollected第90天采样90dayscollectedIIIIIIIVIIIIIIIVIIIIIIIVIIIIIIIV111:03OH0000000000000001036212:0000057706265520000776116101654313:00000000000000007794i13:000000000000031252305695微生物14:060368465481019147341584193651938242678142903681365859186耗氧细菌G+a14:0000012333539140000000007耗氧细菌G+i14:0000053604566660000126711389821591814:1ω5c0000000000006630025179好氧菌15:02OH00000000017549641079001216010好氧菌15:03OH000000000000010691657378311细菌G+a15:0906107011821210403413783230392015321220168929118808819182841658112细菌G+i15:01184176116441961489817613672520220221482176328971410911735146261768713i15:03OH00056100001051181617902319104512052940322114i15:1G0000000000004541013310229015细菌（微生物）16:055067313630096192280975261710225592162291313314470215606443449869715627391316硫酸盐还原细菌16:010methyl636767897110627307561682230117259991358206388436646100221308317细菌a16:00037201951749148311521292127216992257292130973391930418细菌i16:068487796413153195113723473705210813801793298012176905110494137621916:0Nalcohol0005497590052166846955186610269141218205220好氧菌16:12OH000010820009957130889309803244345221i16:1G000000000000001290296422i16:1H000000000000133212610023甲烷氧化菌G-16:1ω5c7851049106013573519162828673189315642233828573489088747190591512224细菌17:000001152048010191178001124287322103933337225硫化还原菌17:010Me00007710517789556390429589283117592896342226好氧菌17:02OH00001172000000086113940102527细菌a17:00589845134330948541989304918792508223835557292617186781317028细菌（无色菌G-）cy17:005710012500614175048905286883091250236043650 1829细菌G+i17:0055762678419125491245209115259771230172061905013781876103017:1ω8c000000010250000201416982131239631微生物/厌氧细菌18:01203141214892353501717303517560238293206339548861410411713154641673832厌氧细菌18:1ω7c1362306316852413632417826172666334393536329151261397711051156041623533真菌18:1ω9c4483723347999092204245639195362445715351131101401519250572354505956734632223418:3ω6c(6,9,12)00425831113953972889486992910761185289726403722683935细菌19:0000000000000115901028108336细菌G-cy19:0w8c11221806146520085144123332055574280231272809378114455989213781144023720:0066358493117800130117301579152013971990550839885742600938真菌20:1ω9c0000000000001370635228992939原生动物20:4ω6,9,12,15c037806311055012621679102711296741787394733805627432640a17:1ω9c000000000000136800041放线菌18:010Me000000027041777174115632021521907167897642unknown14.50200000000000057570141883843unknown18.814000000000000000785注:I、II、III和IV分别表示不施肥（CK）、施纯化肥、施用25%饼肥和施用25%鸡粪处理。Note:I,II,IIIandIVarethetreatmentsofunfertilization(control),applyingchemicalfertilizer,25percentsoybeanmanureand25percentChickenmanure,respectively. 182.3土壤微生物群落PLFAs生物标记多样性指数分析2.3.1主要类别微生物群落PLFAs生物标记多样性指数变化（1）PLFAs生物标记的总量与丰富度的关系土壤微生物群落PLFAs生物标记各多样性、丰富度、均匀度及优势度指数统计结果，见表3。从表可知，不同PLFAs，其多样性指数不同。对于丰富度，即PLFAs生物标记出现频次(S)而言，对于细菌而言，PLFAs生物标记14:0、a15:0、i15:0、16:0、i16:0、16:1ω5c、18:0、18:1ω7c和cy19:0ω8c[1，4，5，6，7]、16:010Me[1]在供试的16个土样中均出现，细菌的PLFAs生物标记i17:0、a17:0[1]出现在15个供试土样中；真菌的PLFAs生物标记18:1ω9c[16]16个土样中均出现；说明供试土壤中上述PLFAs生物标记丰富度皆相对较高。（2）PLFAs生物标记多样性指数之间的关系从表3中可知，其Response值总和较高，均匀度(J)较低，其Simpson优势度指数（D）、Shannon-Wiener（H1）、Brillouin（H2）、Mcintosh（H3）多样性指数也相对较高；放线菌18:010Me出现在8个供试土样中，Simpson优势度指数（D）、Shannon-Wiener（H1）、均匀度(J)、Brillouin（H2）、Mcintosh（H3）多样性指数分别为0.8156、2.6831、0.8944、2.6815和0.5738；原生动物则出现于13个供试土样中，Simpson优势度指数（D）、Shannon-Wiener（H1）、均匀度(J)、Brillouin（H2）、Mcintosh（H3）多样性指数分别为0.8765、3.2968、0.8909、3.2940和0.6525。（3）PLFAs生物标记分布频次与多样性指数的关系而PLFAs生物标记a17:1ω9c、11:03OH、13:0和unknown18.814只出现于1个土样中，14:1ω5c、i16:1G和i16:1H只出现于2个土样中，i13:0、a14:0、15:03OH和19:0只出现于3个土样中，说明在供试土壤中，上述PLFAs丰富度皆相对较低，均匀度(J)较高，其Response值总和较低，其Simpson优势度指数（D）、Shannon-Wiener（H1）、Brillouin（H2）、Mcintosh（H3）多样性指数也相对较低。表3.土壤微生物群落磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记反应值及各多样性指数Table4.ThediversityindexandtotalresponseofthePLFAsbiomarkersofthemicrobialcommunityinthetobaccosoils序号CodePLFAsName频次Freq.PLFA值总和PLFAtotalvalueSimpson(D)Shannon(H11)均匀度(J)EvennessBrillouin(H22)Mcintosh(H33)111:03OH110360.5000010.50.1212:0653460.80022.45350.94912.44800.5605313:017790.50000.000010.50.14i13:0314040.64811.54100.97231.53340.41755微生物14:016285740.88503.47060.86763.46730.66476耗氧细菌G+a14:0325000.60341.43250.90381.42790.37767耗氧细菌G+i14:0766360.83362.68580.95672.68040.5992814:1ω5c231800.33020.73860.73860.73680.18489好氧菌15:02OH450130.73561.96020.98011.95650.492610好氧菌15:03OH365090.57051.38550.87421.38360.348911细菌G+a15:016661460.87383.40890.85223.40730.647312细菌G+i15:016884040.87723.40050.85013.39930.651713i15:03OH9159480.86302.99900.94612.99580.634814i15:1G440670.60281.60220.80111.59800.375515细菌（微生物）16:0164269370.88993.51270.87823.51240.669216硫酸盐还原细菌16:010Me16556140.86323.29940.82483.29760.632817细菌a16:013309400.85853.25570.87983.25310.627418细菌i16:016679680.87393.36770.84193.36620.6473 181916:0Nalcohol1195930.88653.30660.95583.30040.669820好氧菌16:12OH7134730.80452.53860.90432.53570.56262116:1iG242540.42270.88520.88520.88380.24392216:1iH225930.49980.99950.99950.99720.298523甲烷氧化菌G-16:1ω5c16842310.87863.43590.85903.43470.653924细菌17:09173410.84972.91620.91992.91320.616925硫化还原菌17:010Me11149490.84933.02070.87323.01660.616826好氧菌17:02OH444520.74241.97770.98881.97360.499827细菌a17:015572540.87993.41290.87363.41120.656128细菌（无色菌G-）cy17:011187370.86213.08650.89223.08310.633229细菌G+i17:015398470.87323.33920.85473.33690.64713017:1ω8c592640.78722.27100.97812.26820.544231微生物/厌氧细菌18:016956580.89093.52020.88013.51910.671832厌氧细菌18:1ω7c161017230.90033.60560.90143.60450.686433真菌18:1ω9c163796390.89523.55090.88773.55060.67743418:3ω6c(6,9,12)14247130.86263.29960.86673.29630.633335细菌19:0332700.66611.58320.99891.57960.429536细菌G-cy19:0ω8c16866060.89023.51490.87873.51370.67083720:014347220.88763.43150.90133.42910.668338真菌20:1ω9c452230.69291.84070.92041.83720.451939原生动物20:4ω6,9,12,15c13269020.87653.29680.89093.29400.652540a17:1ω9c113680.50000.000010.50.141放线菌18:010Me8311680.81562.68310.89442.68150.573842unknown14.502425320.73531.95560.97781.94900.495143unknown18.814113680.50000.000010.50.12.3.2功能微生物群落PLFAs生物标记多样性指数的变化对于细菌而言，出现的主要功能菌标记如：标记甲烷氧化菌的16:1ω5c[6]、硫酸盐还原细菌的16:010Me[1]和厌氧菌的18:1ω7c在供试的16个土样中均出现，；真菌的PLFAs18:1ω9c[16]也在供试的16个土样中均出现，这些主要标记物在供试土壤中丰富度皆相对较高，且从表3和图4所示，可知其Response值总和较高，均匀度(J)较低，其Simpson优势度指数（D）、Shannon-Wiener（H1）、Brillouin（H2）、Mcintosh（H3）多样性指数也相对较高。 182.4土壤微生物群落脂肪酸生物标记的聚类分析将表3中的磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记各参数值进行聚类分析，并以欧氏距离为尺度，用最小距离法进行系统聚类，结果见表4和图2。从各指数的聚类分析结果表明，当λ=6662.14，可将分析结果分成五大类。各类烟草土壤微生物群落脂肪酸生物标记（PLFAs）相对生物量大小顺序为：Ⅰ类>Ⅱ类>Ⅲ类>Ⅳ类>V类。第I类：特点为脂肪酸生物标记（PLFAs）含量高，在样方中分布的频次较高，多样性指数高；属于该类的PLFAs为18:1ω9c，表征真菌的脂肪酸生物标记[16]，在各处里样方中的PLFAs相对生物量为379639，在样方中分布的频次为16，多样性指数为3.5509；代表着主导真菌的属性。第II类：特点为脂肪酸生物标记（PLFAs）含量高，在样方中分布的频次为也较高，多样性指数高；16:0，属于假单胞菌[17]的脂肪酸生物标记，在各处里样方中的PLFAs相对生物量为426937，在样方中分布的频次为16，多样性指数为3.5127，其属性可能代表着主导细菌的属性。第III类：特点为脂肪酸生物标记（PLFAs）含量高，在样方中分布的频次较高，多样性中等；属于该类的PLFAs为16:1ω5c，在样方中分布的频次为16，表征甲烷氧化菌的脂肪酸生物标记[5]，在各处里样方中的PLFAs相对生物量为84231，说明土壤中也含有较多的甲烷氧化菌. 18表4磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记峰值聚类分析Tab.4TheclusteranalysisofResponevalueTIJ距离Distance图2.烟草土壤微生物群落PLFAs生物标记含量聚类分析Fig3.TheclusteranalysisofPLFAsamountofmicrobialcommunityintobaccosoils14336.00231251.003424589.86441644.1851481103.396721119.5973511124.5482621227.91940221261.5110821286.74112211308.601221101395.78133811435.8214211456.741528241466.25161011517.721725241578.52181911635.9419611757.02203011861.17212412053.96222012201.1423912693.612439372777.71253452867.992637293045.35272913121.65281753203.51291313297.2730513297.373127163322.243232313706.103331123867.733436123872.553518164662.203616115030.373712115669.73384115864.73391116662.14402317981.6641331520868.364215190915.61第IV类：特点为脂肪酸生物标记（PLFAs）含量中等，在样方中分布的频次较高，多样性中等；属于该类的PLFAs有序号13:0、i15:0、cy19:0ω8c、18:0、18:1ω7c、a15:0、i16:0、16:010Me、a17:0。其中，已知i15:0、a15:0、i16:0和a17:0可用于表征革兰氏阳性菌[1]，且也是好氧菌的生物标记；18:0、18:1ω7c和cy19:0ω8c可用于表征革兰氏阴性菌，且18:1ω7c为厌氧细菌[1]的生物标记；16:010Me 18可用于表征硫酸盐还原细菌[1]。第V类：特点为脂肪酸生物标记（PLFAs）含量低，在样方中分布的频次较低，多样性低；属于该类的PLFAs有序号11:03OH、12:0、13:0、i13:0、14:0、a14:0、i14:0、14:1ω5c、15:02OH、15:03OH、15:0i3OH、15:1iG、a16:0、16:0Nalcohol、16:12OH、i16:1G、i16:1H、17:0、17:010Me、17:02OH、cy17:0、i17:0、17:1ω8c、18:3ω6c(6,9,12)、19:0、20:0、20:1ω9c、20:4ω6,9,12,15c、a17:1ω9c、10Me18:0、unknown14.502、unknown18.814。其中，已知a14:0、i14:0、14:0、15:0i3OH、15:1iG、a16:0、16:12OH、i16:1G、i16:1H、17:0、i17:0可用于表征革兰氏阳性菌[1]，且15:0i3OH、15:1iG、a16:0、i16:1G、i16:1H、17:0、i17:0也是好氧细菌的生物标记[1]；15:02OH、15:03OH、a16:0、16:0Nalcohol、16:12OH、17:0、17:02OH、cy17:0可用于表征革兰氏阴性菌[1]，且15:02OH、15:03OH、17:0、17:02OH也可用于表征好氧菌[1]；18:3ω6c(6,9,12)可用于表征真菌的生物标记[1]；17:010Me和10Me18:0可用于作为表征放线菌的生物标记[1]；20:4ω6,9,12,15c可用于作为表征原生动物的生物标记[6]。3小结与讨论目前常用于进行微生物群落多样性分析的方法主要有磷脂脂肪酸（PLFAs法）、生理学（Biolog法）、分子生物学（DGGE等）等方法，三者方法各有其特点[15，18，19]。磷脂脂肪酸（PLFA）法更敏感[3]，具有能够快速、直接、较全面、有效地提供土壤微生物群落的信息，且试验条件要求较低，结果较为客观、可靠[4，6]。因此，脂肪酸生物标记（PLFAs）法是目前较为流行的测定微生物生物量的一种新方法。它主要是根据不同类群微生物的指示PLFA不同，通过提取和分离指示性PLFA，并测定它们的含量，定量地反映可繁殖或有潜在繁殖能力的不同类群微生物生物量和总生物量，是一种较好的评价广谱群落差异的分析方法，可用于土壤微生物群落结构和生物多样性的分析。特别是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。由于PLFA在死亡微生物中很快被分解，所以，能够很好地测定有繁殖能力的微生物生物量。但是，PLFA方法也还存在一些缺点，如，尚未确立土样中所有生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法完全确定土样中某些特定脂肪酸和特定的微生物或微生物群落的对应关系，即对原位土壤微生物群落中特定菌种指征有时不够明确[4，6]等等。土壤微生物群落结构，受土地使用历史、植被覆盖类型和作物栽培方式等多种因素的影响[4，6，7]。在本研究供试烟草的生长过程中，其根际土壤微生物群落结构多样性还受田间管理方式，包括施肥方法和类型、生育期等方面的影响，烟草植株或其分泌物与根际土壤微生物的互作对土壤微生物群落多样性样性也起着重要作用。测定结果表明，所获得的烟草土壤43种磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记各多样性指数、丰富度及均匀度皆不相同，且不同生长阶段的脂肪酸生物标记（PLFAs）各指数皆不相同；但总体而言，有随着生长时间的延长而加大的趋势，PLFAs的生物量在生长后期为最高，且此时施用25%鸡粪处理的其各PLFAs含量皆高于其它处理。经聚类分析并结合多样性指数分析后，我们可以将土壤中提取到的43种磷脂脂肪酸（PLFAs）生物标记依据其生物量的大小分成五大类，即：第I类：高含量，高频次，高多样性指数的PLFAs为18:1ω9c的真菌脂肪酸生物标记[16]；第II类：含量仅次于第I类，在样方中分布的频次较高，多样性指数高；PLFAs为16:0，属于假单胞菌[20]的脂肪酸生物标记；第III类：高含量，较高频次，多样性中等；表征甲烷氧化菌的PLFAs为16:1ω5c的脂肪酸生物标记[6]；第IV类：中等PLFAs含量，较高多样性，含有表征好氧菌的i15:0、a15:0、i16:0和a17:0的PLFA，还有表征厌氧细菌的18:1ω7c以及硫酸盐还原细菌的16:010Me；第V类：低含量，低多样性分布，其特征生物标记有表征好氧菌的i15:03OH、15:1iG、a16:0、i16:1G、i16:1H、17:0、i17:0、15:02OH、15:03OH、17:0和17:02OH的PLFA，有表征真菌的18:3ω6c(6,9,12)的PLFA、放线菌的17:010Me和10Me18:0的生物标记以及表征原生动物的 1820:4ω6,9,12,15c的生物标记。因此，从上述分析结果，我们可以认为，对于本研究中的供试土壤，在该环境条件下的在烟草整个生长过程的土壤微生物群落中，能够起主导作用的功能菌可能依次是真菌、假单胞菌、甲烷氧化菌和部分的好氧菌、厌氧细菌及硫酸盐还原细菌，影响最小的是可能是一些好氧菌、放线菌及原生动物。因此，根据分析所得到的结果，可以推出，若要调控土壤微生态系统中的生物群落对土壤肥力及各种抗逆能力的影响，我们应该首先着重研究该土壤中的真菌和假单胞菌的各种生理生化性质，并据此提出解决的方法，这有助于我们今后在生产上合理调节土壤的微生态系统的功能提供理论指导和参考。同时本研究也将为进行其它土壤微生物群落的功能多样性的研究提供了一个新的模式。当然，本研究中所选取的土壤样品数可能还不够有代表性，还有待于进一步选用更多的烟草土样进行脂肪酸（PLFAs）生物标记的提取、鉴定和比较分析，使所得的结论更准确、可靠。References：[1]ChenZH.X.,YuX.,XiaM.F.,etal.2005.Applicationofphospholipidfattyacid(PLFA)analysisinmicrobialecology.ChineseJournalofEcology,24(7):828-832[2]ZhangH.X.,WangX.Y.,QiH.Y..2003.Developmentinresearchmethodsofmicrobialecology.Actaecologicasinica,23(5):988-995[3]WangS.G.,HouY.L..2004.Applicationofphospholipidsfattyacidmethodinsoilmicrobialanalysis.Microbiology,31(1):114-117[4]BaiZH.,HeH.B.,ZhangW.,etal.2006.PLFAstechniqueandit’sapplicationinthestudyofsoilmicrobiology.ActaEcologicaSinica,26(7):2387-2394[5]Kaur1A.,ChaudharyA.,Kaur1A.,etal.2005.Phospholipidfattyacid–Abioindicatorofenvironmentmonitoringandassessmentinsoilecosystem.CurrentScience,89,(7):1102-1112.[6]YanH.,CaiZ.C.,ZhongW.H..2006.PLFAanalysisanditsapplicationsinthestudyofsoilmicrobialdiversity.ActaPedologicaSinica,43(5):851-859[7]QiH.Y.,XueK.,ZhangH.X..2003.Phospholipidfattyacidanalysisanditsapplicationsinmicrobialecology.ActaEcologicaSinica,23(8):1576-1582[8]PrihaO,SusanJ,etal.2001.MicrobialcommunitystructureandcharacteristicsoftheorganicmatterinsoilsunderPinussylvestris,PiceaabiesandBetulapendulaattwoforestsites.Biol.Fertil.soils,33:17-24[9]FrostegårdA，TunlidA，BaatIE．1993.Phospholipidfattyacidcomposition，biomass，andactivityofmicrobialcommunitiesfromtwosoiltypesexperimentallyexposedtodiferentheavymetals.App1.Environ.Microb.,59:3605-617．[10]KourtevPS，EhrenfeldJG,HäggelomM．2002.Exoticplantspeciesalterthemicrobialcommunitystructureandfunctioninthesoil．Ecology，83(11)：3152-3166．[11]GeF..2002.Modernecology.Beijing:SiencePubishingHouse,252-254[12]MagurranAE.1988.Ecologicaldiversityanditsmeasurement.Princeton,N.J:PrincetonUniversityPress,141-162.[13]ZhangY.B.,WangX.L.,FanM.ZH.,etal.2007.DiversityofentomogenousfungiandtheirhostsandpopulationdynamicsofthefungiinaMasson’spineplantationecosystem.JournalofAnhuiAgriculturalUniversity,34(3):342-347[14]SunH.X.,LiuX.L..2004.Microbesstudiesoftearhizosphere.ActaEcologicaSinica,24(7):1353-1357[15]SalomonováS.,LamačováJ.,RulíkM.,etal.2003.Determinationofphospholipidfattyacidsinsediments.ActaUniversitatisPalackianaeOlomucensis,Chemica42,39–49[16]JaredL.DeForest,DonaldR.Zak,KurtS.Pregitzer,etal.2004.Atmosphericnitratedeposition,microbialcommunitycomposition,andenzymeactivityinNorthernHardwoodForests.PublishedinSoilSci.Soc.Am.J.68:132–138.[17]TengY.,LuoY.M.,LiZH.G..2006.Microbialdiversityinpollutedsoils:anoverview.Actapedologicasinica.43(6):1018-1025[18]PhilipW.R.,MatthiasC.R.,KevinP.F.,etal.2006.Choiceofmethodsforsoilmicrobialcommunityanalysis:PLFAmaximizespowercomparedtoCLPPandPCR-basedapproaches.Pedobiologia,50:275-280[19]HeribertInsam.2001.Developmentsinsoilmicrobiologysincethemid1960s.Geoderma,100:389-402[20]ZhanF.D..2004.Communitystructuresanddynamicsofmicroorganismsintherhizosphereofflue-curedtobacco.MasterdegreedissertationofWest-easternAgricultureUniversity,5参考文献:[1]陈振翔,于鑫,夏明芳,等.磷脂脂肪酸分析方法在微生物生态学中的应用.生态学杂志,2005.24(7):828-832 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