兽医生物制品制造的条件监察制度和质量检验

第11章兽医生物制品制造的条件、监察制度和质量检验第一节兽医生物制品制造的条件和要求一、制造生物制品的基本条件制造兽医生物制品必须具备以下基本条件：①一定比例的专业技术人员；②相应的厂房和动物舍；③相应的生产设备；④具有防止散毒的设施和隔离条件；⑤具有良好的消毒和排污设施；⑥保证水、电供应；⑦具有稳定的合乎标准要求的菌、毒种；⑧合格的实验动物及细菌、病毒的培养基质；⑨经国家有关部门批准取得生产许可证。（一）机构和人员兽药生产企业应建立生产和质量管理机构，各类机构和人员职责应明确，并配备一定数量的与兽药生产相适应的具有专业知识和生产经验的管理人员和技术人员。从事生物制品制造的全体人员均应根据其生产的制品和所从事的生产操作进行卫生学、微生物学等专业和安全防护培训。对从事高生物活性、强污染性及与人畜共患病有关的生产操作人员和质量检验人员，应经相应专业的技术培训。兽药生产管理部门和质量管理部门负责人均应由专职人员担任，并不得互相兼任。质量检验人员应经省级兽药监察所培训，经考核合格后持证上岗。质量检验负责人的任命和变更应报省级兽药监察所备案。25 生产企业主管兽药生产管理的负责人和质量管理的负责人，应具有制药或相关专业大专以上学历，有兽药生产和质量管理工作经验。生产和质量管理负责人应具有兽医、药学等相关专业知识并有丰富的实践经验以确保在其生产、质量管理中履行其职责。（二）厂房和设施厂房建设应首先注意厂址的选择，厂址应当远离闹市区。交通方便、地势高燥，有利于污水的排放与净化，具有电源和充足而质量良好的水源，而巨应当具有一定的发展余地。兽药生产企业必须有整洁的生产环境，其空气、场地、水质应符合生产要求。厂区周围不应有影响兽药产品质量的污染源；厂区的地面、路面及运输等不应对兽药生产造成污染；生产、仓储、行政、生活和辅助区的总体布局应合理，不得互相妨碍；厂房应按生产工艺流程及所要求的空气洁净度级别进行合理布局，同一厂房内以及相邻厂房之间的生产操作不得相互妨碍。此外，《兽药生产质量管理规范》还规定：生物制品应按微生物类别、性质的不同分开生产。强毒菌种与弱毒菌种、生产用菌毒种与非生产用菌毒种、生产用细胞与非生产用细胞、活疫苗与灭活疫苗、灭活前与灭活后、脱毒前与脱毒后其生产操作区域和贮存设备应严格分开；生产生物制品必须设置生产和检验用动物房；厂房及仓储区应有防止昆虫、鼠类及其它动物进入的设施；生物制品检验用强、弱毒操作间要分室进行。按照生产工艺和质量要求，根据洁净程度将厂区划分为三类：①一生产区（辅助车间等），对洁净度无明确要求；②控制区，要求比较清洁，菌落数（用90mm直径的培养皿平板培养基露置半小时，37°C培养72h）平均£10；③洁净区，如菌毒种工作间，菌落数应当平均£3。在控制区和洁净区应当做到三防，即防动物、防昆虫和尽可能防灰尘。此外，还有一些重要原则性问题应予注意：①生产区与行政区、生活区严格分开，并互相之间问隔相当距离；②处理烈性强毒的强毒区，必须单独设立，并且必须具有严密的隔离设施，绝对不得散毒；③各种动物舍应与生产、研究等主体建筑分开，应设于僻静处，并有专用排污设备。（三）生产设备25 根据我国兽药生产企业应具备的基本条件规定，生产生物制品的企业应有转瓶机、培养罐、过滤器、冻干机、孵化箱、压盖包装机、高压灭菌柜、烘烤箱及冷藏设备等。1．无菌设备。无菌室、超净工作室或超净工作台是生物制品厂可缺少的重要设置，对生物制品厂来说，无菌室更为重要。对无菌设备总的要求是：①严密，不能有缝隙；②采光良好；③有缓冲间；④有紫外线灯，操作之前进行空气消毒；⑤有条件的单位，应安装净化空气设备，使室内保持止压，外界有菌空气不能进入。2.空调设备。3．培养设备，①细菌培养装置（发酵罐，又称反应罐，由空气压缩机、空气贮存罐、滤器和反应罐组成）；②细胞培养装置（转瓶机，悬浮培养瓶）；③温室、温箱。4．孵化设备（孵化箱）。5，冻干设备（冻干机及其附属设备）。6．灭菌设备，包括于热火菌器、高压蒸气灭菌器及流通蒸气消毒器等，其中最重要的是高压蒸气灭菌器。高压灭菌器有圆形、方形、矩形，有卧式、立式、台式和手提式等多种形式，大小不一，种类繁多，生物制品厂不同于一般实验室，多半用大型卧式灭菌器。近年来，国内外己生产自动程序控制高压蒸气灭菌器。设备的性能和主要技术参数，应能保证生产和产品质量控制的要求，并定期经法定计量部门校验。与设备连接的主要固定管道应标明管内物料名称、流向。设备应易于清洗、消毒，便于生产操作和维修、保养，并能防止差错和减少污染。生产设备的安装需跨越两个洁净度级别不同的区域时，应采取密封的隔断装置。生产、检验设备及器具均应制定使用、维修、清洁、保养规程，定期进行检查、清洁、保养与维修，并由专人进行管理和记录。主要生产和检验设备、仪器、衡器均应建立设备档案。（四）排污和防止散毒设施根据国家保护自然环境和自然资源，防止污染和其他公害的规定和《兽医生物制品制造及检验规程》的规定，生物制品的制造、检验及试验研究部门的污水必须经过无害处理后才能排放，粪便等带毒材料应就地消毒，厂体应全部化制或焚毁。25 1．排污处理设施生物制品生产及研究单位的污水中含有各种病原微生物及非病原微生物，必须经过工害处理方准排放。无害处理的方法包括：①物理法：如加热、沉淀、过滤和离心分离等；②化学法：利用中和、氧化、还原、吸附或电解等化学反应以改变污染物的性质；③生物法：利用微生物的作用，使污水的有机污染物转化为元害物质。污水的排放标准是：①生化需氧量（biochemicaloxygendemand，BOD），（5天，20°C）达到60mg/L，生化需氧量越高，表示水中有机污染物越多；②化学需氧量（chemicaloxygendemand，COD）：达到100mg/L，氧化剂可用重铬酸钾或高锰酸钾，此标准指重铬酸钾法；③动物检测：水中是否存在病原菌，应当用对该菌、毒敏感的动物进行检验。2.强毒室的防护强毒室必须隔离，人畜不得任意出入。门窗等处设必要的防护设备，防止犬、猫、飞禽及野鼠进入。强毒区各工作房舍门口应设消毒池。凡有车辆出入的，应设能使车轮全面消毒的消毒他。3．带毒粪便及垫草的处理带毒粪便及垫草等均采用生物发酵法处理，在生物发酵池中自然发酵二年以上方可作为肥料使用。4．尸体处理尸体应用焚尸炉焚烧或化制。在此情况下有的厂将尸体高压蒸气（121°C30min）灭菌后，按粪便处理办法进行生物发酵处理，亦很安全。（七）文件管理兽药生产企业应有完整的生产管理、质量管理文件和各类管理制度、记录。文件管理是制药企业质量保证的重要工作内容。各类制度及记录内容应包括：1．业管理、生产管理、质量管理、生产辅助部门的各项管理制度；2．厂房、设施和设备的使用、维护、保养、检修等制度和记录；3．物料验收、发放管理制度和记录；4．生产操作、质量检验、产品销售、用户投诉等制度和记录；5．环境、厂房、设备、人员、工艺等卫生管理制度和记录；6．不合格品管理、物料退库和报废、紧急情况处理、三废处理等制度和记录；7．兽药生产质量管理规范和专业技术培训等制度和记录。产品生产管理文件主要包括生产工艺规程、岗位操作法或标准操作规程、批生产记录等。产品质量管理文件主要包括：①产品的申请和审批文件；②物料、中间产品和成品质量标准、企业内控标准及其检验操作规程；③产品质量稳定性考察；25 ④批检验记录，并附检验原始记录和检验报告单。兽药生产企业应建立文件的起草、修订、审查、批准、撤销、印刷和保管的管理制度，分发、使用的文件应为批准的现行文本，己撤销和过时的文件除留档备查外，不得在工作现场出现。生产管理文件和质量管理文件应符合以下要求：①标题应能清楚他说明文件的性质；②各类文件应有便于识别其文本、类别的系统编号和日期；③文件数据的填写应真实、清晰，不得任意涂改，若确需修改，需签名和标明日期，并应使原数据仍可辨认；④文件不得使用手抄件；⑤文件制定、审查和批准的责任应明确，并有责任人签名。二、生物制品生产的申报与审批根据规定，我国新制品的生产与审批需经以下步骤。（一）实验室试验菌（毒、虫）种的选育和鉴定毒力、抗原性、免疫原性、稳定性、特异性试验和生产工艺，制品的安全性、效力（对实验动物及使用对象动物）。免疫期及保存期试验等。表1-1新制品实验室各项试验要求批数实验批数分类安全效力免疫期保存期第一类（我国创制，国外只有文献而未批准生产的制品）5533第二类（国外已批准生产，但我国尚未生产的制品）第三类（我国已生产使用，但对生产工艺有新的根本改进的制品）3332（二）田间试验应用3-5批实验室制造的新制品，对生产条件下的使用对象动物进行试验，观察其安全性和效力。表1-2田间试验供试动物的数量要求供试动物的种类和数量生物制品类别大动物中小动物禽类鱼第一类疫苗第二、三类疫苗诊断制剂20010050-100100050050-10010000500050-10020001000注：大动物：牛、马、驴、骡、骆驼25 中动物：猪、羊、犬、狐，鹿小动物：兔、貂、獭（三）中间试验根据实验室生产工艺，在生物药品厂或国家认可的具备一定条件的中试车间试制5-10批（诊断制剂不少于3批）制品，定型生产工艺。（四）区域试验用工厂生产的3批以上中试产品在较大范围对不同品种的使用对象动物试验，进一步观察制品的安全性和效力。表1-3区域试验供试动物数量要求供试动物的种类和数量生物制品类别大动物中小动物禽类鱼第一类疫苗第二、三类疫苗诊断制剂200010001000-200020000100001000-200040000200001000-20004000020000（五）申报新制品经过中间试验和区域试验之后，证明工艺完善，安全性和效力良好，研制单位可提出新制品制造及检验规程草案，连同有关技术资料报农业部。（六）审批审批手续包括：①农业部进行预审；②预审合格者，农业部组织专家进行初审；③初审合格者，由兽药审评委员会进行审评；④农业部进行最后批准，发给《新兽药证书》及批准文号。（七）新制品试生产获得《新兽药证书》和批准文号后，可以进行信纸品的试生产（八）正式生产试生产总结后，申请转为正式生产。（九）发给正式生产批准文号经兽药评审委员会再评价后，建议列入规程，发给正式生产批准文号。25 第二节兽医生物制品制造的条件、监察制度和质量检验一、药品生产管理与质量检验标准自1969年世界卫生组织（WHO）宣布《药品生产管理规范（GoodManufacturingPractice，GMP）》以来，美国、日本、德国、瑞士等一百多个国家相继颁布了本国的GMP，我国也在1988年公布了《药品生产管理规范》。目前，GMP已成为国际公认并遵守的药品生产管理与质量检验的基本准则。GMP涉及的内容十分广泛，一方面要求每个药品生产厂家具有合格的硬件，即厂房、仓库、空气清洁装置、污水处理和绿地等；另一方面还必须具有一系列能保证产品质量的软件，即人员素质、管理和技术等。GMP的主要内容包括如下几个方面：1.厂房和长区厂址选择城镇郊外，环境幽静、空气清洁的地区。厂区绿地与建筑物地面比为10:1.5—10:2.0。长内水泥路面，无露土地面。厂区与生活区分离，健康动物区与污染区分离，洁净区、控制区和污染区不得直接接触。水质符合卫生标准。长内照明充足，具有必要的通风、空调、净化等设备，生产工序衔接合理，人和物分流，并按生产工艺划分清洁区和清洁等级。2.设备所有设备应符合轻质、体积小、有惰性、耐磨损、防腐蚀和低噪音、易清洁和消毒等要求。全部设备应依工艺要求尽可能为联动操作或自动控制。3.工艺工艺流程布局要科学、合理，工艺流程中的各种条件应予以保证。25 4.实验动物生物制品生产和检验用动物均应符合等级动物标准，至少要达到清洁级实验动物标准。生产和检验禽类生物制品的禽和卵应为SPF标准。动物房的环境控制应符合等级动物标准。5.人员素质专业技术人员要按GMP标准进行专业训练，才能按GMP标准生产出符合GMP的优质产品。二、兽医生物制品监察制度兽医生物制品是一种特殊药品，其质量优劣直接关系到对畜禽防病的有效性和安全性，也关系到人类的健康和可能给生态环境造成的影响。因此，世界各国对兽医生物制品的质量、生产、经营和使用都非常重视，不仅制订有严格的生产、检验技术法规和质量标准（如药典、规程等），而且对制品的生产、经营和使用也进行严格的法制管理。目前包括我国在内许多国家都采用生产许可证制度，经营许可证、进口兽药的注册、登记管理制度。对于新生物制品的生产和使用，多采用根据申报资料由专家委员会审议，再经检验机构进行复核，经政府主管部门审批等制度。我国对兽医生物制品的全面管理始于1952年，由农业部颁布了第一部《兽医生物制品制造及检验规程》统一了兽医生物制品的质量标准，建立了兽医生物制品监察制度，设立了中国兽药监察所（原名为中央农业部兽医生物药品监察所，简称中监所），负责监督执行。当前我国兽医生物制品监察制度的主要内容包括以下几个方面。（一）兽医生物制品质量管理体系国务院1987年发布了《兽药管理条例》，其中规定由国务院农牧行政管理机构主管全国的兽药管理工作，并对兽医生物制品的生产、质量、经营和使用施行监督。凡生产生物制品的单位必须经农业部批准，取得《兽药生产许可证》和当地工商行政管理机构批准发给的《营业执照》。生产的各种制品还必须取得农业部或所在省、市、自治区农（牧）行政主管部门发给的《批准文号》。25 生物制品生产企业均应设立监察室，业务由中监所领导。监察室的任务是：对成品进行检验和判定，并了解生产中执行《规程》情况和产品使用情况与效果等。中监所是农业部领导下的兽医生物制品国家级的质量监督、检验、鉴定的专业技术机构，负责全国兽医生物制品质量监督，抽检制品和对制品质量检验、鉴定的最终技术仲裁。负责检验用标准品、参照品和生产、检验用菌、毒、虫种的研究、制备、标定、鉴定、保管和供应。培训技术人员，开展学术交流活动等。新研制的生物制品必须经过农业部新药审评委员会审评通过后报农业部批准，才能投入批量生产。外国企业首次向我国出口生物制品，必须向农业部申请注册，并经质量复核合乎标准，取得《进口兽药登记许可证》，才能在我国境内出售。出口生物制品，须符合进口国的质量要求，并应报农业部批准。（二）菌毒虫种和标准品的营理用于兽医生物制品制造和检验用的菌种、毒种、虫种等均实行种子批和分级管理制度。种子分三级：原种、基础种子和生产种子。原种由研究单位和中监所负责保管；基础种子由中监所或中监所委托的单位负责制备、鉴定、保管和供应；生产种子由生产企业自行制备，按各项《规程》的规定鉴定后使用；各级种子均应规定使用代次。各级菌（毒、虫）种的保管必须有专人负责，应分别保存于规定的条件下，有严密的登记制度，分类建立档案。寄发菌、毒、虫种和标准品时，必须装入金属筒内密封，妥善包装。一般菌、毒、虫种和标准品可以航寄，烈性传染病或人畜共患传染病的强毒茵（毒）种，必须派专职技术人员领取。非批准生产牛瘟、口蹄疫、狂犬病、猪瘟、炭疽、马鼻疽、破伤风、C型肉毒梭菌、布鲁氏菌病、结核等产品的制造单位，需用上述强毒菌（毒）种，须经农业部批准后始可领用，并须专人领取。（三）防止散毒的原则与措施25 兽医生物制品都是用病毒、病菌或其它病原体，有的还是用人畜共患的病原体；所以，兽医生物制品生产或研究单位防止散毒应作为监察制度的主要内容之一。防止散毒的措施包括厂内划定隔离区，建立隔离设施，制定污水的无害处理和畜粪与尸体的无害处理办法。在强毒区尤应注意勿污染周围地区，所有进出人员及用具等都应经过一定的消毒处理。甚至对蚊、蝇、猫、狗、鼠、鸟等也要采取严格防范或消灭措施，以防止其传播某些病原体。（四）制品的贮容及运输根据兽医生物制品特性，在贮存、运输和使用方面需要特定的条件，各生产企业和使用单位必须设置相应的冷藏设备。指定专人负责，按各制品的要求严格管理，定时检查和记录贮存温度。运输生物制品应尽量缩短运输时间。凡要求在2～8°C贮存的灭活疫苗、诊断液及血清等，宜在同样温度下运送。若在严寒冬季运输，须采取防冻措施。凡须低温贮存的活疫苗，应按制品要求的温度进行包装运输。所有运输过程，必须严防日光曝晒。（五）新制品的管理新制品是指我国创制或首次生产用于畜禽等动物疾病预防、治疗和诊断用的生物制品。对已批准的生物制品所使用的菌（毒、虫）种和生产工艺有根本改进的，亦属于新制品管理范畴。新制品应经过实验室试验、田间试验、中间试生产及区域试验等研究过程取得完整数据。由研制单位提出新产品制造及检验试行规程草案，连同有关技术资料报农业部。预审合格后，组织有关专家进行初审。评审合格后，审评办公室将申报材料提请兽药审评委员会进行审评。符合规定的，提出技术审评意见及规程草案、质量标准及使用说明书送农业部审批。农业部审查批准的新制品，发给《新兽药证书》。持有此证书者，方可进行技术转让。接受转让的生产企业，经农业部审查批准后发给试生产批准文号。新制品的试产期按审批的一、二、三类制品，分别为五年、三年、二年。在试产期内，生产单位要会同原研制单位继续考核制品的质量，完善质量标准。当中监所抽样检查，发现有使用严重反应或效果不确者，向农业部报告，令其停止生产及使用。具有特殊用途的或紧急疫情防疫所需个别新产品，经农业部特别批准后，方能使用。（六）进口制品的管理25 随着国际交往的增加，为保证进口兽医生物制品质量，根据《兽药管理条例》的规定，对进口的兽医生物制品一律报农业部注册、审批。农业部将申报的品种及有关资料交中监所进行质量复核，然后交新兽药审评委员会审议，符合规定者，报农业部审批，发给《进口兽药登记许可证》，才能准许进口在我国销售。为科学研究试验或为积累临床资料进行试验而进口的生物制品可不需注册，但需报农业部批准。三、兽医生物制品的质量检验生物制品的质量检验，应从用于生产的菌种、毒种、虫种和原材料到半成品的检查，直至最终的成品检验，都属于质量检查范围，应贯穿于生产的始终，即全面质量管理（TQC）。生物制品质量检验主要包括物理性状检验、无菌或纯粹检验、枝原体检验、鉴别检验、活菌计数或病毒含量测定、安全检验及外源病原体检验、效力检验（效价或恃异检验）、剩余水分检验、真空度测定，以及灭活剂、防腐剂的检查等。上述各项检验项目，主要是指成品检验，但有的只用于某些制品，如剩余水分检验和真空度测定，只用于冻干制品；活菌计数和病毒含量只用于弱毒活疫苗等。（一）无菌检验或纯粹检验生物制品（除另有规定者外）都不应有外源微生物污染。灭活疫苗不得含有活的本菌或本毒。因此各类生物制品必须按规定进行无菌检验或纯粹检验，全部操作应在无菌条件下进行。1.抽样应随机取样，样品应有确切的代表性。我国兽药按灭活菌苗及血清批量在50万ml以下者每批抽样5瓶，50-100万ml者每批抽样10瓶，100万ml以上者抽样15瓶；同批冻干制品分几柜冻干者，应以柜为单位，每柜抽样5瓶；诊断液每批抽样5瓶。效力检验，同批菌苗分为若干组分装时应逐组随机抽样检验，抽取样品数依需要而定。2.检验用培养基厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基（T.G）及酪蛋白胨25 琼脂（G.A），霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基（G.P）。上述培养基均须用指定的需氧菌菌株、厌氧菌菌株及霉菌菌株做灵敏度测定，达到标准后方能使用。3.检验方法及结果判定（1）含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品：用T.C培养基50m1，接种供试品（冻于制品先做10倍稀释）1m1，置36±1°C培养，3天后自小瓶中吸取培养物，分别接种T.C小管和G.A斜面各2支，每支0．2m1，1支置36±1°C，1支置25±1°C；另取0．2m1接种1支G.P小管，置25±1°C，均培养5天，应无菌生长。（2）细菌性活疫苗及不含防腐剂、抗生素的其它制品：将供试品（冻干制品加稀释液恢复原量）接种T.G小管、G.A斜面或适于本菌生长的培养基各2支，每支0.2m1，1支置36±1°C，1支置25±1°C。另用1支G.P小管，接种0．2m1，置25-36±1°C，均培养6天。细菌性活疫苗应纯粹。（3）血液制品和混浊制品：如未加防腐剂或抗生素，可直接用不加琼脂的T.G小管和G.A斜面，接种量、培养条件、时间和判定标准同2项，如加有防腐剂或抗生素，检验方法和判定同1项。如培养后混浊不易判定时，可移植培养后再判定。（4）判定结果：每批抽检的样品（除允许含一定数量非病原者外）应全部无菌或纯粹生长。如发现个别瓶有杂菌或结果可疑时，可重检原瓶（如为安瓶或冻干制品，可重抽样品），如无菌或无杂菌生长，可作无菌或纯粹通过。如仍有杂菌，可抽取加倍数量的样品重检，个别瓶仍有杂菌，则作为污染杂菌处理。4.杂菌计数及其病原性鉴定（1）杂菌计数：每批污染制品至少抽样3瓶，用肉汤或蛋白胨水分别作50倍稀释，接种于含4％血清及0.1％血红素的马丁琼脂（或G.A）平板上，每个样品接种平板2个，置36±1°C培养48小时后，再移置室温24小时，数杂菌菌落数（CFU），然后分别计算杂菌数。任何1瓶每克被检样品（或每头剂）的非病原菌数不应超过该规程的规定。如污染霉菌时，亦作为杂菌计算。（2）病原性鉴定：25 A.检查需氧性细菌：将污染需氧性杂菌管培养物移植1支T.G管或马丁汤，置同条件下培养24小时，取培养物用蛋白胨水稀释100倍，接种体重18-20g的健康小鼠3只，每只皮下注射0.2m1，观察10天。B.检查厌氧性细菌：将生长有杂菌管延长培养至96小时，取出置65°C水浴加温30min后移植T.G管或厌气肉肝汤1支，在同样条件下培养24-72小时。如有细菌生长，将培养物接种体重350-450g的豚鼠之只，每只肌肉注射1m1，观察10天。C.如发现制品同时污染需氧性及厌氧性细菌，则按上述要求同时注射小鼠及豚鼠。D.判定：小鼠、豚鼠均应健活。如有死亡或局部化脓坏死，证明有病原菌时，该批制品应废弃。5.禽沙门氏菌的检验凡用普通鸡胚生产的各种弱毒疫苗，将被检物用划线法接种麦康凯平板或S.S琼脂平板，经37°C培养18-24小时后，挑选无色半透明、边缘整齐、表面光滑并稍突起的菌落2-3个，分别接种于三糖铁培养基。先在该培养基上层斜面涂布，再穿刺至底部。经37°C培养24小时后，如培养基下层变黄，斜面为淡红色时，应进一步用多价沙门氏因子血清作玻片凝集试验，如为阳性即证明为沙门氏菌污染。除此之外，有些生物制品在需要的情况下，还要进行枝原体检验和衣原体检验。（二）安全检验 生物制品的安全性是其首要的条件，各种制品都必须经过安全检验合格者方可出厂。1．安全检验的内容（1）检验外源性污染：上述无菌与纯粹试验也应包括在内，这不仅是因为有致病性细菌的污染，而且即使是非病原菌，如数量过多，其代谢产物也会影响安全。另外，外源性的病毒及枝原体的污染亦是影响安全的重要方面。25 特别是活疫苗在采用细胞培养时，可通过培养病毒的组织细胞带来外来的病毒，如猪瘟兔化弱毒疫苗采用猪肾细胞培养时，有可能带入野外猪瘟强毒。细胞培养多用犊牛血清，犊牛血清就可能带入牛腹泻病毒，如使用马血清又可能带入马传贫病毒，使用鸡胚则可能带入鸡白血病等病毒。而且除原材料以外，生产环境不佳及操作不严密，亦可能造成外源性污染。生产全过程各个环节，均须重视防止污染。（2）检查杀菌、灭菌或脱毒情况：灭活疫苗都是以致病微生物加入甲醛或其它灭活剂灭活，而类毒素则是加入甲醛将毒素脱毒。但如灭活不彻底或脱毒不完全，都影响制品的安全性。（3）检查残余毒力或毒性物质：这主要是对活疫苗而言。所谓残余毒力是指生产这类制品的菌（毒）种，本身是活的减毒株或弱毒株，允许有轻微毒力的存在，能在接种的机体内表现出来。这种残余毒力的大小，按制品的不同而有不同的指标要求，测定和制定方法也不一致。如无毒炭疽芽孢苗菌种的毒力标准是允许实验动物（小鼠、家兔、豚鼠）在注射部位引起剧烈水肿，但家兔不能死亡，豚鼠可死亡1/2，而小鼠可全部死亡。又如羊痘鸡胚化弱毒疫苗，安全试验的标准是试验羊2/3可发生不全经过型痘种，接种局部皮肤的表面应出现0.5-4cm微红色或无色的丘疹（痘肿），持续10天左右，有的还有体温反应，但不应有其它异常现象。毒性检查主要是对死菌苗或类毒素这类制品，这类制品虽经杀菌或脱毒，仅具有抗原性，但其本身的某些成分，当接种一定量时，可引起对机体的有害反应，即毒性反应。这种毒性反应可存在于某些污染革兰氏阴性菌的制品中，即有时也会产生热原性的类毒素。在冻干活菌疫苗中有的也出现毒性反应，如仔猪副伤寒活疫苗，冻于后的存活率过低会出现内毒素反应，有时引起死亡，在这种情况下采用口服免疫可以避免。（4）检查对胚胎的毒性：有的病毒致弱毒株虽对免疫动物已经致弱，但还能通过孕畜影响胚胎。25 如国外猪瘟的某些弱毒株，就可通过孕猪的胎盘屏障传给胚胎以致造成死胎、胎儿畸形或生后发育不良等。因此欧洲药典中明确规定猪瘟病毒应经过对胚胎毒性的检查。其检查方法是：选10头未免疫的母猪在怀孕25-35天时肌肉注射两头剂的疫苗，同时另选10头未免疫的同龄同源怀孕母猪注射等量生理盐水，然后观察疫苗对胎儿或仔猪是否有影响。2．安全检验的方法及要点成品的安检方法主要是动物检验。安检剂量应大于使用剂量。但凡能以小动物作出正确判断者，则多用实验小动物，这主要是材料易得，费用较低。禽苗则可直接以使用对象动物作安检。但无论使用何种动物，其首要条件是选用敏感的动物。安检动物要求一定的品种，譬如猪丹毒以鸽和小鼠比较敏感；而猪肺疫则以家兔比较敏感。但同一种动物不同品系其敏感性也下一样，如鸡新城疫的安检鸡，用我国土种鸡就不如用来航鸡敏感。又如不同日龄的小鼠对猪丹毒的敏感性也下一致，日龄过大则敏感性差。到底哪种日龄动物最适宜，各种动物不一样。一般概念敏感动物是不含母源抗体的，如以猪检查猪瘟疫苗的安全性，就必须检查供试猪是否含有母源猪瘟抗体，无母源抗体者方可使用。除了动物的敏感性外，动物的健康状况也与安检结果的正确判断密切相关。试验期间的饲养管理也会影响安检结果的判断，安检动物舍应与健康动物和其它试验动物分开，以免相互干扰，即必须在专用动物舍内进行。在安检期间，如安检动物有死亡时，必须及时解剖明确原因，在整个安检期内应及时观察动物的健康情况，并予以记录。3．安全检验的判断（1）安检期死亡的动物经解剖明确非制品所致者可以重检，如检验结果可疑难以判定时，应以加倍头数的该种动物重检。（2）凡规定用多种动物进行安检的制品，如牛瘟兔化绵羊化活疫苗用小鼠和豚鼠两种动物检验，两种均应安全合格。（3）用小动物检验不合格者，有的规定可用使用对象动物重检。但用使用对象动物检验不合格者，不能再以小动物重检。4．外源病毒检验（1）用于鸡的活疫苗：取样品2-3瓶混合（如是细胞苗，须用超声波或3次冻融方法破坏细胞），用相应含专一特异性抗体的血清中和后作为检品。用鸡作检验用动物，被检样品不做处理。如对检验样品中病毒中和不完全，可用高效价血清重做，或用制品使用对象进行检验。A.25 鸡胚检查法：用9-11日龄SPF鸡胚20个，分为2组，每胚各以10个使用剂量接种，第一组10个胚接种于尿囊腔内；第二组10个胚接种于绒毛尿翼膜上，在37°C培养，弃去在接种后24小时内死亡的胚，但每组胚须存活6个以上，试验方可成立。7天后剖检，胎儿应发育正常，绒毛尿囊膜无病变。取鸡胚液做凝集试验，应无血凝价。用来自对脑脊髓炎（AE）易感鸡群的1-7日龄鸡胚15只，每胚卵黄囊内接种0.2m1，继续孵化直至孵出雏鸡。对雏鸡观察15天，不应出现运动失调，或呈现AE组织病理变化的死亡，并至少有9只胚孵出小鸡，试验才成立。用鸡胚检查无结果或可疑时，可用鸡检1次。B.检查禽白血病病毒:用COFAL试验。用对禽白血病病毒易感的SPF9-11日龄鸡胚，制成鸡胚成纤维细胞单层，将用特异性血清中和过的疫苗（至少含50个使用剂量）接种于成纤维细胞单层上，维持培养不少于14天，在此期间每隔3-4天细胞继代1次，培养结束时，做COFAL试验检查细胞中应无鸡白血病病毒。C.鸡检查法：用适于接种本疫苗日龄的SPF鸡20只，点眼、滴鼻接种10个使用剂量，肌肉注射100个使用剂量，接种后21天，按上述方法重复接种1次，第一次接种后42天采血，进行有关疫病的血清抗体检验。在42天内，不应有疫苗引起的局部或全身症状和呼吸道症状或死亡。如有死亡，应做病理学检验，查明是否由于疫苗所致。血清抗体检验，除本疫苗所产生的特异性抗体外，不应有其它疫苗的抗体存在。（2）非禽源细胞的活疫苗：A.荧光抗体检查法：对细胞制品检验，将3瓶样品混合，经3次冻融后，接种细胞单层培养4天，传第2代，取第2代培养物，分别进行丙酮固定后，以适宜的荧光抗体进行染色。猪细胞应检查：牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）、伪狂大病毒（PRV）、狂犬病病毒（RV）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（HCV）。牛羊细胞应检查：BVDV、RV、PRV、PPV、BTV（蓝舌病病毒）。马细胞应检查，马传染性贫血病病毒。犬细胞应检查：RV、PRV、PPV、BVDV。25 确定被检对象后，取片进行染色与镜检。若被检血出现任何一种特异荧光，为不合格；若阳性对照组不出现特异荧光或不明显为无结果，可以重检。若被检组出现不明显荧光，必须重检，重检仍出现不明显荧光，为不合格。B.绿猴肾（Vero）传代细胞检查法：疫苗用相应特异性血清中和后，用Vero细胞3个单层，总面积不少于100cm2，每个单层接检品1m1，连传2代，每代7天，应不出现细胞病变，并无红细胞吸附因子存在及荧光抗体检查无特异荧光。（3）用细胞单层生产的病毒性活疫苗：检测外源病毒时，亦可采用致细胞病变和（或）红细胞吸附试验。先用相应的特异性血清中和后，接种敏感的细胞单层进行培养。A.致细胞病变的检测：取经传代后培养至少7天的细胞单层（每个cm2）1个或多个，用适宜染色液，对细胞单层进行染色，观察细胞单层，检查包涵体、巨细胞的数目异常或其它由外源病毒引起的细胞病变的出现情况。B.红细胞吸附病毒的检测：取经传代后培养至少7天的细胞单层（每个cm2）1个或多个，以PBS洗涤细胞单层数次，加入0．2％红细胞悬液适量，以覆盖整个单层表面为准。红细胞悬液应是洗涤过的豚鼠红细胞、人“0”型红细胞、鸡红细胞的等量混合悬液，可在加入前混合，亦可分别滴加于不同的细胞单层上。4°C放置30min，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。若无明显的红细胞吸附现象可重复1次，在细胞单层加入红细胞悬液后置20-25°C培养30min，用PBS洗涤，再次检查红细胞吸附情况。也可用2个细胞单层分别在4°C和20-25°C培养。C.若出现外源病毒所致的特异性细胞病变或红细胞吸附现象，判不合格；若疑有外源病毒污染，但又不能通过其它试验排除这种可能性，则作不合格处理。（三）效力检验 制品的效力是指它的使用价值。效力不好的制品，如为疫苗和类毒素，则无法有效地控制疫情；如为治疗用的血清，则无法医治病畜，从而使疫病蔓延；如为诊断制品，则影响检疫及诊断的正确性。1．效力检验的内容25 （1）免疫原性：首先是菌（毒）种的免疫原性应良好，制备生物制品的茵（毒）种的免疫原性，应经过周密的试验测定。如制猪丹毒灭活疫苗的菌种应选择2型菌，因为2型菌株免疫原性良好，试验证明对其它菌型也有免疫力。又如流感与口蹄疫，因其在流行中病原常有型的变化，所以用以制备疫苗毒株的型必须与流行型相对应。否则即使是制品的免疫原性良好，也收不到免疫效果。（2）制品的免疫持续期：这也应在选育菌（毒）种时测定，但不同制品其免疫持续期各异。理想的制品应具有较长的免疫持续期，免疫持续过短的应考虑增加免疫接种的次数。（3）抗原的热稳定性：一般灭活苗和血清的热稳定性较好，弱毒疫苗较差，但也随制品的种类而异，如牛痘苗的热稳定性就很好。但制品的热稳定性也与制品中所加入的冻干稳定剂的种类或制备工艺有关。（4）抗原量的测定：活的疫苗的效力取决于接种动物的毒量，即一定量病毒（细菌）才能在体内增殖到一定程度，促使机体产生免疫应答，若数量不够，则达不到免疫效果。所以常以测定抗原量来检查制品的效力，当然实验室的检定指标应和使用效果一致。灭活苗也同样要求一定抗原量才有效。所以应测定制品的最小免疫量。制品中的抗原量并非愈多愈好，应求其适当有效量，规定上限和下限，过多还会出现副作用，如鸡痘鹌鹑化弱毒疫苗对6日龄以下雏鸡刺种反应大，而改用稀释一倍后刺种1针则安全有效。2．成品的效力检验（1）动物保护力试验：这是兽用生物制品最常用的检验方法。所用动物依制品而异，但使用的敏感小动物应与使用的对象动物有平行关系者，禽用疫苗一般均使用对象动物作检验，当小动物检验如遇有某种原因难以判断者，可以改用制品使用对象动物检验。但使用对象动物检验不合格者不能再用小动物重检。有的制品没有相应的小动物，就只能用使用对象动物检验，如抗猪瘟血清与羊痘活疫苗只能用猪和羊效检。动物保护试验的方法虽有许多种，但凡需攻毒者，均应设立同品种、同来源的同批动物作对照组，并必须在特设的隔离强毒动物舍内进行。A.25 定量强毒攻击法：这种方法是以待检品接种动物，经2-3周后，用相应的强毒攻击。观察动物接种后所建立的自动免疫抗感染水平，即以动物的存活或不受感染的情况来判定制品的效力。如猪丹毒活疫苗的效检，用小鼠10只，每只注射0.02个使用剂量的猪丹毒活疫苗，14天以后连同未接种的小鼠3只攻击1000个小鼠致死量的强毒，另3只攻1个MLD。观察10干，免疫组存活8只以上，攻1000MLD对照组全死、攻1个MLD对照小鼠至少死亡2只为合格。如以猪检验则用易感猪10头，其中5头接种疫苗，每头注射1m1活疫苗，14天后连同对照组5头，每头攻击致死量的强毒，免疫猪保护4头以上，对照猪全部发病，并有2头以上死亡，疫苗为效力合格。B.定量免疫变量攻击法：这种方法是把动物分为两大组，一为免疫组，一为对照组，两大组又各分为相等的若干小组，每小组的动物数相等。免疫动物均用同一剂量的制品接种免疫，经一定时间后，与对照组同时用不同稀释倍数强毒攻击，比较免疫组与对照组的存活率。按LD50计算，如对照组攻10-5稀释毒有50%的动物死亡，而免疫组攻10-3稀释毒死50%，即免疫组对强毒的耐受力比对照组高100倍，亦即免疫组有100个LD50的保护力。在兽用生物制品中狂犬病灭活疫苗的效力即按此法检验。C.变量免疫定量攻击法：即将疫苗稀释为各种不同的免疫剂量并以之接种动物，间隔一定时间待动物的免疫力建立以后，各免疫组均用同一剂量的强毒攻击，观察一定时间，用统计学方法计算能使50%的动物得到保护的免疫剂量。如鸡新城疫油乳剂灭活苗即用此法进行效力检验。具体的检验方法是：用3-4周龄易感鸡35只，以1/25、1/50、1/100稀释的疫苗0.5ml剂量，各皮下或肌肉注射10只鸡，另5只不接种作对照，3-4周后，每只鸡肌肉注射10-5ELD50的强毒，观察14天，记录每组的死亡数，对照应全部死亡，最后算出50%的保护剂量，以PD50表示。每一使用剂量（0.5ml）的效价应不低于50个PD50。在国外如英国的口蹄疫疫苗与猪瘟活疫苗也用这种方法检验，前者应不小于6个PD50，后者应不小于100个PD50。D.被动免疫抗体测定：用经高度免疫的动物抗病血清注射易感动物，经一定时间（一般1-3天）用相应的强毒攻击，观察血清抗体被动免疫所引起的保护作用。25 各种抗病血清的检验均用此法，如炭疽血清，用8只豚鼠作检验，每组4只，分别注射被检血清0.5和1ml，24小时后，连同不注血清对照豚鼠4只攻击致死量的炭疽芽孢液，如对照组7天内全死，两组免疫豚鼠共健活6只以上；或对照组死亡3/4，免疫组全部健活时，血清为合格有效。有的疫苗也可用这种方法检定效力，即用疫苗接种免疫试验动物后，然后采取免疫动物的血清测定其抗体效价，来判定疫苗的免疫力，如羊梭菌多联干粉灭活疫苗即用此法。（2）活菌计数与病毒量的滴定：A.活菌计数：某些活疫苗的菌数与保护力之间有着密切而稳定的关系，因此，可以不用动物来测保护力，只需要进行细菌计数。活菌数能达到使用剂量规定要求者，即可保证免疫效力，如无毒炭疽芽孢苗计活芽孢数，每毫升含活芽孢数应在：500万-2000万之间。布鲁氏菌活疫苗、仔猪副伤寒活疫苗也是用计活菌数测定。B.蚀斑计数或其它滴定病毒量的方法：鸡马立克氏病活疫苗采用蚀斑计数，无论是HVT还是“814”疫苗都采用此法，因为火鸡疱疹病毒与马立克病毒都能形成蚀斑（PFU），蚀斑的数量又与鸡保护率之间有直接而稳定的关系。采用病毒量滴定来检验效力的制品为猪瘟细胞苗测定对兔的发病量，10-5为合格；鸡新城疫低毒力活疫苗测其EID50，每头份EID50≥106为合格。如用细胞培养则用TCID50来计算其病毒滴度。（3）血清学试验：即以血清学方法检验抗体水平和抗原活性。在我国的兽医生物制品的成品检验中使用血请学检验方法者，主要用于诊断用制品，因为绝大多数诊断制品都是用于血清学试验，因此也必须用血清学方法检验其敏感性和恃异性，在其它生物制品中也有少数使用血清学方法检验的，如牛瘟活疫苗，在效检时当体温反应可疑时可用体温可疑牛的血清以免作中和试验以判定其效力。又如马传染性贫血病活疫苗的效检，是以安全检验马定期作血清学检查，凡血清学阳转2/3-3/4者，认为其效价合格。在兽医生物制品效检中血清学方法有如下几种：A.25 凝集试验：凝集试验有试管法与平板法两种，前者为布鲁氏茵试管凝集试验抗原与阴阳性血清的检验等，后者为布鲁氏菌平板试验抗原检验等。B.沉淀试验：沉淀试验法有三种：①环状沉淀反应，如炭疽沉淀素血清的检验；②琼脂扩散反应，如马传染性贫血琼扩抗原的检验；③培养凝巢试验法，如猪丹毒抗原的检验。C.中和试验：中和试验用于兽医生物制品的效力检验比其它血清学方法应用较多，在疫苗中除牛瘟与马传贫疫苗以外，尚有小鹅瘟活疫苗，一些梭菌属灭活疫苗等。在诊断液的检验中也较多用，如牛鼻气管炎抗原、产气英膜梭菌定型血清等。 D.补体结合试验：这在很多诊断用制品中常用，如牛肺疫补体结合试验抗原、马传染性贫血补体结合试验抗原、布鲁氏菌补体结合试验抗原等。E.抗毒素单位的测定：抗毒素的测定方法仍然是利用抗原抗体反应，但抗毒素血清中所含的抗毒素抗体，国际上都采用“单位”来表示它的效价，抗毒单位简称“AE”，是德文Antitoxineinheit的缩写。如破伤风抗毒素单位的测定，是将被检血清不同倍数稀释与定量标准毒素中和，同时以标准血清与定量标准毒素作对照，用小鼠来测定，以与对照动物死亡时间相近的最高稀释度数的一半，即为待检血清的抗毒单位。每毫升被检血清应含：000AE以上，精制的每毫升含2000AE以上。 F.类毒素单位的测定：在兽医生物制品中，破伤风类毒素的效检用免疫动物攻标准毒素法。但在分装前必先测定其结合力单位（EC），并规定混合后的类毒素结合力单位应不少于250个EC。结合力单位的测定是利用抗原抗体反应原理，并通过动物观察类毒素与抗毒素结合的程度来判断类毒素的质量。（4）其它效检方法：A.与标准品（对照参考品）同时注射致敏动物测定反应值，如结核菌素，被检菌素用一个与标准菌素相当的稀释度（如均稀释为1:1000），在致敏豚鼠身上测定，两者反应面积比值为：1±0.1，即认为合格。B.热型反应与发病观察：如牛瘟活疫苗，用绵羊效检，规定应有2/3羊为定型热反应。猪瘟兔化弱毒活疫苗观察接种兔的热型反应；羊痘鸡胚化弱毒疫苗接种易感羊观察发痘情况等。3.影响效检的因素与应注意的问题25 （1）检验动物的影响：效力检验目前主要还是以动物保护法为主，动物的品种、健康状态和饲养管理等对效力都有明显的影响，虽然在制造与检验规程中对动物都提出了一定的规格与要求，然而国腋按照所规定的要求选用检验动物，但动物个体的差异仍然存在，这对效检的正确性有一定的影响。固此实验动物的规格化，应是生物制品中一个重要问题。（2）培养基的影响：使用的培养基，特别是作活菌什数的培养基对计数结果影响更为明显。而有些兽医生物制品茵数不仅是质量标准而且是量的标准，而培养基质量下一致时，菌数就会出现较大的差异，因此培养基质量规格是影响效验的另一因素。（3）增设标准品对照：在我国兽医生物制品中除破伤风抗毒素、鸡马立克氏病活疫苗和一些诊断用制品使用标准品或参照品作为对照，其它制品还没有标准品或参照品作为对照，这对正确评价制品效力会有影响。（四）其它检验1．一致性检验（1）一致性检验的定义一致性检验（identitytest）又名鉴别检验或同一性试验。这种试验主要用于：①生物制品的试验，即根据生物制品的性状（生物学、理化方面等）进行核实检查。②决定微生物种属的试验。在生物制品中的应用，既可属于效力检验的范围，譬如抗原性的变异，亦可属于安全检验的范围，如毒力的变化等。目前我国规程中有不少制品有此检验规定。（2）一致性检验方法一般采用已知特异血清（国家检定机构发给的标准血清）或参考血清和其它适宜方法，对制品进行特异鉴定。不同的制品采用不同的方法，如中和试验、凝集试验、沉淀试验、间接血凝试验、血凝试验、抑制血凝试验以及菌种形态和培养特性检查等。常用方法如下：A.中和试验：主要用于活疫苗，此法系将特异性血清与疫苗中和，如鸡马立克氏病活疫苗（火鸡疱疹病毒），当疫苗毒和单一特异性抗火鸡疮疹病毒血清混合后，再接种于易感细胞，由于该病毒彼中和，失去产生细胞病变的能力。B.25 培养特性的检验，常用于细菌灭活疫苗，如仔猪副伤寒活疫苗，由于该菌种是通过一定浓度的醋酸钝减弱的，在醋酸铊普通肉汤中均匀混浊生长，而仔猪副伤寒强毒菌株不能在此种培养基中生长，可用此鉴别。2.物理性状检验（1）液体疫苗和诊断液：各种液体疫苗及诊断液，外观必须符合其规定要求，如炭疽芽孢苗静置后为透明液体，瓶底应有少量白色沉淀；又如含氢氧化铝胶的灭活菌苗，静置时上部应为黄棕、黄褐或褐色透明液体，下部为氢氧化铝胶沉淀，振摇后为均匀混浊液，但所有这类制品应无异物，无摇下散的凝块及霉团等，同时检查瓶装量是否准确，封口是否严密，瓶签有无差错等。（2）血清制品：所有血清都应为微带乳光橙黄色或茶色清朗液体，不应有摇不散的絮状沉淀与异物。若有沉淀时，稍力摇动，即成轻度均匀混浊。装量、封口、瓶签同时检查。（3）冻干疫苗：应为海绵状疏松物，色微白、微黄或微红，无异物和干缩现象。如为安瓶应无裂口及烧焦物。冻干制品加稀释液或水（原量）稀释振荡后，应在常温几钟内迅速溶解成均匀一致悬浮液。3．干燥制品剩余水分检验冻干制品都要求测定水分含量，水分含量高低，直接影响制品的质量和保存。冻干制品剩余水分均不应超过4%。测剩余水分的方法有两种。（1）真空烘干法：取样品置于含有五氧化二磷的真空烘箱内，抽真空度达133.322～666.61Pa，加热至60-70°C干燥3小时，两次烘干达到恒重（恒重指物品连续两次干燥后重量差异在0.5mg以下的重量）为止，减失的重量即为含水量。水分计算公式为： 含水分％=（样品干前重-千后重）/干前重Xl00（2）卡氏测定法：卡氏测定法是利用化学方法来测定制品的含水量。卡氏试剂用的化学药品为碘、二氧化硫、甲醇、吡啶。其原理为：因水分能与碘、二氧化硫发生作用，因一分子水与一分子碘作用后，大量碘能与微量水起反应，碘即变为碘化物，溶液由原来的棕红色，吸水后变为无色，可用肉眼来观察终点，计算制品的含水量。25 无论哪种方法测水分都应注意不受或少受空气湿度的影响，因为冻干制品都容易吸潮，所以在操作中，一是要掌握快速、二是要在干燥环境中进行、三是所使用的工具都必须干燥。在上述两种方法中卡氏法要求更高，雨天不宜进行，且化学药剂的配制标化保存都比较麻烦，所以一般部使用真空法。4．真空度测定 经冷库保存的冻干制品，出厂前两个月应由监察室测定真空度，无真空的制后，应子剔除报废，不得重抽真空。真空测定的方法是通过高频火花真空测定器来测定，凡容器内出现白色、粉色或紫色辉光者为合格。有些生物制品还需要以下检验：苯酚（石炭酸）含量测定、汞类防腐剂含量测定和甲醛含量测定。附注：5.苯酚（石炭酸）含量测定(1)对照品溶液的制备：取苯酸（精制品）适量，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。(2)供试品溶液的制备：取供试品1ml，置50ml量瓶中，加水释至刻度，摇匀，即得。(3)检查法：分别精密吸取对照品溶液和供试品洛液各5ml，置100ml量瓶中，加水30ml，分别加醋酸钠试液2ml，对硝基苯铵、亚硝酸钠混合试液1ml，混合，再加碳酸钠试液2M．加水至160ml，充分混匀，放置10min后，照分光光度法（兽药典一部附录16页）在550nm的波长处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得大于对照品溶液的吸收度。5.汞类防腐剂含量测定(1)对照品溶液的制备：精密称取于105°C干燥至恒重的二氯化汞0.1354g，置100ml量瓶中，加硫酸液（0.5m/L）使溶解并稀释至刻度，摇匀即得，每1ml溶液中适含1mg的Hg，此液为汞浓溶液。精密量取汞浓溶液5ml于100ml量瓶中，用硫酸液（0.5m/L）稀释至刻度，摇匀即得。每lml溶液中适含50mg的Hg。(2)测定法：A.消化：精密量取摇匀的供试品溶液（约相当于汞50pg）置25ml凯氏烧瓶（瓶口加小漏斗）中，加硫酸2ml，硝酸浴液（1®2）0.5ml，加热沸腾15min（或3X24cm试管中，加盖，于85-90°C水浴中加热1小时），放冷后加水20ml，再放冷至室温。B.滴定：将上述消化液移入125ml分液漏斗，用水分多次洗涤凯氏烧瓶，使总体积为80ml，加20%盐酸羟胺试液5ml，摇匀，用0.00125%双硫腙滴定液滴定，开始时每次滴加3ml左右，以后逐渐减少，至每次0.5m1，最后至少至0.2m1，每次加入滴定液后，强烈振摇10s，静置分层，弃去四氯化碳层，继续滴定，直至双硫腙的绿色不变，即为终点。抗毒素等样品用水浴法消化，滴定时会出现少量絮状物，但不影响结果。C.对照品标化:精密量取汞溶液（含Hg50ug）1ml，置125ml分液漏斗中，加硫酸2ml，水80ml，20%盐酸羟胺5ml，用双硫腙滴定液滴定，操作同“滴定”。汞类含量%（g/m1）=供试品滴定ml数X25 0.050x2.02X100对照品滴定ml数供试品ml数x10007.甲醛含量测定(1)对照品溶液的制各：取甲醛溶液约1.5m1，精密称定，置锥形瓶中，加水10ml与溴麝香草酚指示液2滴，滴加氢氧化钠液（1m/L）至溶液呈蓝色，加氧化氢试液25m1，再精密力，入氢氧化钠液（1m/L）25m1，瓶口置一玻璃小漏斗，在水浴上加热15min，不时振摇，冷却，用水洗涤漏斗，加溴麝香草酚指示液2滴，用盐酸液（1m/L）滴定至溶液呈黄色，并将滴定结果用空白试验校正，即得，每1ml的氢氧化钠液（1m/L）相当于0.3mg的CH2O。取上述已标定的甲醛溶液适量，配成每1ml含甲醛20mg的溶液，精密吸取5ml于50m1容量瓶，加水至刻度，摇匀，即得。(2)供试品溶液制备：精密吸取本品5m1，置50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。(3)检验法：精密吸取对照品容液和供试品溶液各0.5M，分别加醋酸-醋酸铵绥冲液10ml，乙酰丙酮试液10m1，置60°C恒温水浴15min，冷水冷却5min，放置20min后，照分光光度法，在410nm的波长处测定吸收度，供试品溶液的吸收度不得大于对照品浴液的吸收度。25