动物微生物实验实训指导书

动物微生物实验实训指导书一、实验实训指导说明：1、性质与作用：动物微生物是高等农业职业院校畜牧兽医专业的一门岗位素质课程。对应岗位是：动物疫病诊断、检疫、检测技术等实训室技术岗位。作用是：研究微生物与畜禽的关系，并利用微生物学与免疫学的知识和技能来诊断、防治畜禽的疾病与人畜共患疾病，让学生具备畜牧兽医行业高等技术应用型专门人才所必须的畜禽疾病诊断、检测、预防等专业知识和熟练的职业专门技术能力，培养学生具备相应职业关键技术能力和职业道德。在教学过程中，使学生要掌握动物微生物与免疫所必须的专项实践技能和综合职业能力，基本掌握细菌类疾病、病毒类疾病、其他微生物实训室检验技术等。同时，在教学中对学生职业道德进行影响，注意敬业精神、吃苦耐劳、尽心钻研等方面的教育影响，并形成良好职业道德和敬业精神。2、课程内涵：本课程的内涵是通过过程性的训练及考核，通过形成性联系及渐进式教学，使学生不但掌握专业知识而且能够有效把握技能的知识背景及相应的产业历史，为学生在系统掌握本课程专业技能操作的同时，初步具有应对复杂问题及进行有效迁移以及创造的能力。使学生掌握动物微生物课程所必须的专业理论知识，专业实践能力和综合职业能力，掌握主要动物的疾病实训室诊断技术，可以独立的开展动物疫病的实训室检验，具有较强的工作岗位适应能力、分析和解决实际问题的能力以及创新意识和职业道德意识。经过本课程的学习及培养后学生应具有认真负责、踏实肯干，严谨求实的工作态度及独立思考、自主创业的精神。二、实验实训目录：实验实训一显微镜油镜的使用及细菌形态观察方法实验实训二动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备实验实训三细菌标本片的制备及染色方法实验实训四常用培养基的制备实验实训五细菌的分离培养及培养性状的观察技术实验实训六细菌的药物敏感试验（纸片法）技术实验实训七外界环境微生物测定技术实验实训八实验动物接种技术实验实训九病毒鸡胚接种技术实验实训十鸡新城疫病毒的红细胞（血）凝集与凝集抑制试验（微量法）操作技术实验实训十一真菌的检验技术实验实训十二凝集试验实验实训十三琼脂扩散试验技术 三、实践教学内容：实验实训一显微镜油镜的使用及细菌形态的观察一、目的要求：1、要求学生掌握显微镜油镜的使用及保养方法。2、认识细菌的形态、基本构造和特殊构造。二、设备材料：显微镜香柏油二甲苯擦镜纸细菌染色标本三、实验实训内容：（一）显微镜油镜的使用1、油镜的识别：油镜是显微镜物镜的一种，因使用时必须浸于香柏油内，故称油镜。油镜与其他物镜有以下区别：（1）油镜一般是所有物镜中最长的。（2）油镜头上标有其放大倍数“100×”或“90×”。（3）不同厂家生产的显微镜,常在不同镜头上标有不同颜色的线圈以示区别，使用时应先熟悉一下油镜头上的线圈颜色,以防用错物镜。2、基本原理：因光线在香柏油中的折射率（n=1.515）与在玻璃中的折射率（n=1.52）相近，故可减少因折射而射入镜头外的光线，提高了视野的亮度。3、使用方法：（1）对光：将聚光器升至最高，将光圈放大至最大，调节凹面反光镜，使射入镜头中的光线最强。（2）装片：在细菌染色标本片的欲检部位滴一滴香柏油后，将标本片安放于载物台上，用弹簧片固定，将待检部位移至聚光器上，先用低倍镜寻找适当的视野，再换用油镜头观察。（3）调焦：先用粗调节螺旋将载物台上升或使油镜头下降，使油镜头与标本片几乎接触，然后，边用眼睛观察目镜，边用细调节螺旋向相反方向缓慢旋转，直至出现完全清晰的物像为止。（4）保养：油镜用毕，先用粗调节螺旋将载物台下移或使油镜头上升，将细菌标本片取下，用擦镜纸吸去香柏油，如油已干或模糊不清者，可在擦镜纸上滴1－2滴二甲苯或无水乙醇后将玻片上的香柏油吸净，并立即用干擦镜纸拭去二甲苯；用同样的方法将油镜头擦拭干净。然后将低倍镜转至中央或将物镜转成“八” 字形，调节粗调节螺旋，使物镜头与载物台接触，下降聚光器。将显微镜用绸布盖好后装入镜箱，置于阴凉干燥处。（二）细菌形态的观察：1、细菌基本形态的观察：2、细菌特殊构造的观察：（1）球菌标本片的观察（1）细菌荚膜标本片的观察（2）杆菌标本片的观察（2）细菌鞭毛标本片的观察（3）螺旋菌标本片的观察（3）细菌芽孢标本片的观察注意事项：1、当油镜头与标本片几乎接触时，不可再用粗调螺旋向上移动载物台或下降油镜头，以免损坏玻片甚至压碎镜头。2、油镜头和玻片只能用擦镜纸擦拭，不能用手、棉布或其他纸张擦拭。3、香柏油的用量以1－2滴、能淹到油镜头的中间部分为宜，用量太多则浸染镜头，太少则视野变暗不便观察。4、为了增强视野的亮度，应做到三点：聚光器调至最高，光圈调至最大，反光镜用凹面镜。四、教学组织：实验1人一组，每人有一台显微镜，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生观察做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将细菌形态画于实验册上。实验实训二动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备一、目的要求：掌握动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备二、设备材料：试管吸管平皿三角烧瓶烧杯量筒脱脂棉纱布旧报纸石炭酸洗衣粉盐酸等三、实验实训内容：玻璃器皿的准备1、购置的载片，先用2%盐酸浸泡一天，冲去盐酸。再用洗衣粉水洗涤，用自来水冲净，浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。2、用过的玻璃器皿的处理：＆洗涤前必须灭菌：高压灭菌：油类的物品乘热洗涤（培养基、血液试管滴管等）。吸管：浸泡于5%石炭酸48H。＆洗涤：※用过的载片，先用纸擦去香柏油，再放入洗衣粉液中煮沸（或5%的石炭酸48H浸泡），稍冷后取出。逐个用清水洗净，放于酒精中。试管等物品同灭菌及洗涤。※盖片使用前，可用洗衣粉或洗液浸泡，洗净后再用95%乙醇浸泡，擦干备用，用过的盖片也应及时洗净擦干保存。 ※吸管浸泡于洗衣粉水中，用细铁丝取出棉花，用试管刷洗涤，再用自来水洗，用蒸馏水冲洗。＆干燥：自然干燥或干燥箱。＆包装：※棉塞的制备※试管的包装※平皿的包装。※锥形瓶的包装。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训三细菌标本片的制备及染色方法一、目的要求：要求学生掌握细菌标本片的制备基染色方法。二、设备材料：病料细菌培养物接种环玻片酒精灯染色缸染色架染色液三、实验实训内容：（一）细菌涂片的制备：1、液体培养物及液体病料：（1）涂片　用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。（2）干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30－40cm处适当加热干燥。（3）固定分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2－3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2－3min后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。（4）染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。2、固体培养物：用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央,用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合,均匀地涂布成适当大小的薄层,干燥,固定,染色。（二）细菌触片的制备：将固体病料（病变组织）作无菌切开,用切面在玻片中央接触一下或稍用力印压成一薄层,干燥,固定,染色。（三）细菌的染色法：1、单染色法：又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。（1）美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液，染色1－2min后，水洗，干燥（吸水纸吸干或自然干燥），镜检。 （2）瑞特氏染色：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1－3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3－5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3－5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。（3）吉姆萨氏染色法：先将吉姆萨染色液原液稀释成常用的吉姆萨染色液（取5－10滴原液于5ml新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀），在经甲醇固定好的涂片上滴加足量的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30min或浸染数小时至24小时后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。2、复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。（1）革兰氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染色1－2min后，水洗，再加革兰氏碘液，作用1－2min后，水洗，加95％酒精脱色0.5－1min后，水洗，稀释石炭酸复红（或沙黄、番红）染色液复染0.5min后，水洗，干燥，镜检。（2）抗酸染色法：常用的有萋－尼氏染色法和沙黄－美蓝染色法。①萋－尼氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精灯火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持3－5min，水洗；再用3%盐酸酒精脱色至无染色液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约1min，水洗，吸干，镜检。②沙黄－美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯火焰上方微微加热使冒蒸气3－5次，维持1－2min，水洗；再用再用3%盐酸酒精脱色至无染色液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约1min，水洗，吸干，镜检。注意事项：1、做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。2、固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。3、每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。4、每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作、观察、做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将每组涂片结果画于实验册上。实验实训四常用培养基的制备一、目的要求： 1、要求学生掌握常用培养基的制备过程2、要求学生掌握培养基pH的测定和调节方法二、设备材料：灭菌锥形瓶烧杯试管平皿天平高压灭菌器过滤装置漏斗纱布电炉玻棒新鲜牛肉或牛肉浸膏蛋白胨磷酸氢二钾氯化钠琼脂蒸馏水0.1mol/l氢氧化钠溶液精密pH试纸等三、实验实训内容：（一）基础培养基的制备：1、普通肉汤培养基：用新鲜牛肉先制成肉浸液。取新鲜牛肉去脂肪和筋膜，切成小块，称重，按肉水比1：2的比例加水浸泡过夜（夏季应置于冰箱内），煮沸约1h后用纱布滤去肉渣挤出肉水，然后用滤纸过滤肉浸液，补足原有水量，装入锥形瓶中用高压灭菌器灭菌（0.105Mpa，20min）后，置阴凉暗处保存。取上述肉浸液1000ml于锥形瓶中，称取蛋白胨10g、磷酸氢二钾1g，氯化钠5g，加入肉浸液中充分搅拌溶解，必要时可稍加温促进溶解。测定和调整pH为7.4-7.6，用滤纸过滤，置高压过滤器内灭菌（0.105Mpa，20min）后，于无菌室或超净台内分装于试管内，每管约10ml，无此设备者可先分装后灭菌。如无新鲜牛肉，也可用牛肉浸膏代替。用量是每1000ml培养基3－5g。2、普通琼脂培养基：取1000ml普通肉汤培养基于烧杯中，加入20－30g琼脂，煮沸使琼脂充分融化，趁热用2－4层纱布过滤，补充蒸馏水至1000ml，测定和调节pH至所需标准。高压灭菌后无菌分装于试管（装量为1/4－1/3管）中趁热斜置，冷却即成琼脂斜面；或分装平皿（厚度为2－3mm）中，水平静置冷却即成琼脂平板。也可先分装于试管中，再进行高压灭菌，然后趁热斜置冷却。（二）营养培养基的制备：1、鲜血琼脂培养基：亦称为血液琼脂培养基。将灭菌后的普通琼脂培养基加热溶解，冷却至45－50℃时加入无菌鲜血（每100ml普通琼脂中加入鲜血5－6ml），摇匀后趁热分装于试管中制成斜面，或分装于平皿中制成平面。若温度过高时加入鲜血，则血液变为暗褐色，称为巧克力琼脂。2、血清琼脂培养基：方法同鲜血琼脂培养基，血清用量是每100ml普通琼脂中加入5－6ml。（三）其他常用培养基的制备：1、半固体培养基：制备方法同普通琼脂，只是将琼脂的用量减少为0.5%－0.7%。2、马铃薯琼脂培养基：马铃薯200g，去皮后切成小块，加蒸馏水煮沸30min，用4层纱布过滤，加入葡萄糖20g，加入融化后补充蒸馏水至1000ml，调节pH至4.5，灭菌后分装即可。主要用于霉菌和担子菌的分离培养。3、麦抗凯琼脂培养基：蛋白胨2g、乳糖1g、氯化钠0.5g、胆盐0.5g 、1％中性红水溶液0.5ml、蒸馏水加至1000ml。4、SS琼脂培养基：蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、乳糖10g、胆盐10g、枸橼酸钠10－14g、硫代硫酸钠8.5g、枸橼酸铁0.5g、0.5％中性红水溶液4.5ml、0.1%亮绿溶液0.33ml、琼脂25－33g、蒸馏水加至1000ml。（四）pH测定法：1、精密pH试纸法：取该试纸一条浸入欲测的培养基中，0.5s后取出与标准比色卡比较，如为酸性，滴加1mol/l氢氧化钠溶液至pH在所需范围之间。在滴加1mol/l氢氧化钠溶液时，应充分摇匀，再用试纸测定。2、标准比色管法：一般细菌生长的pH为7.6-7.8，测定方法如下：（1）取大小相同的比色管4支，每管分别加入不同的溶液：①培养基管（对照管）加肉汤培养基5ml；②标准比色管；③加有指示剂的培养基管（内装5ml肉汤培养基和0.02%酚红指示剂0.25ml）④蒸馏水管。（2）对光观察：比较两侧观察孔内颜色是否相同，若培养基为酸性（一般为酸性），则向③管内慢慢滴入滴加0.1mol/l氢氧化钠溶液，每滴一次，将试管内液体摇匀，直至④两管相加的颜色与①②两管相同为止。（3）记录5ml培养基用去滴加0.1mol/l氢氧化钠溶液的用量，按下列公式计算培养基总量中需加滴加1mol/l氢氧化钠溶液的用量。全部培养基加滴加5ml培养基所需培养基总毫升1/101mol/l氢氧化钠溶液0.1mol/l氢氧化钠（ml）50培养基的分装装置与棉塞四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训五细菌的分离培养及培养性状的观察一、目的要求：1、要求学生掌握细菌的分离培养、纯化的操作机能；2、要求学生掌握细菌在培养基上的生长特性；二、设备材料：恒温培养箱病料或细菌培养物接种环接种针酒精灯灭菌吸管各种细菌培养基无水碳酸钠氢氧化钠或氢氧化钾凡士林及生理盐水三、实验实训内容：（一）细菌的分离培养：1、病料的采取：将新鲜肛门拭子用灭菌生理盐水洗涤，洗涤液可用于分离培养；无菌采取新鲜粪便的中心部分，用灭菌生理盐水稀释搅匀后澄清，其上清液可用于分离培养；如为病理组织，可用烧红的刀片在其表面烫一下，随即用此刀片在烫过的地方切开一小口，用灭菌接种环在切口内蘸一下即可用于分离培养。2、平板划线分离培养：目的是将病理材料中的细菌分散，以便使细菌单在，从而发育成单个菌落，防止长成菌苔。（1）直接划线分离培养：点燃酒精灯后，左手持皿，底朝下，盖在上，以无名指和小指托底，拇指、食指和中指将皿盖揭开成20度的角度，角度不宜过大，以防空气进入；右手持接种环，在火焰上烧灼后取少许的材料涂在培养基边缘，将接种环上多余的材料在火焰上烧掉，然后在培养基表面进行“Z”字形划线，然后将平皿盖好，倒置于恒温培养箱中培养。（2）分区划线分离培养：用玻璃铅笔在皿底外面划线，将培养基分成3－6个小区，持皿方法同直接划线，但每划完一个小区应将平皿旋转一定角度，以便于划线。平板划线操作示意图 划线分离示意图（3）斜面划线分离培养：左手持试管，手掌朝上，食指和拇指夹住试管；右手持接种环，先将试管的棉塞端在酒精灯火焰上方旋转两周，然后用右手小指和手掌边缘夹住棉塞，打开试管，保持试管口在火焰上方进行操作，在斜面上从试管底部向试管口作“Z”字形划线，接种完毕，在酒精灯火焰附近塞上棉塞后，在火焰上方旋转两周。用铁丝篓或试管架直立放置于恒温培养箱中培养。(4)增菌培养：当病料中的细菌很少时，直接进行分离培养往往不易成功，常先用液体培养基进行增菌培养。方法是取少许病理材料直接加入培养基中，置恒温培养箱中培养24－48h后，可取少量培养液作划线分离培养。（二）细菌的纯化：操作方法基本同分离培养，但进行斜面纯化移植时左手应同时握住原培养管和待接种管，右手小指和手掌边缘夹住一个棉塞，无名指和中指夹住一个棉塞，必要时中指和食指还可夹住第三个棉塞，液体培养基的纯化移植同液体培养基初次分离培养。（三）细菌在培养基上的生长特性观察：1、固体培养基上的生长特性：细菌在固体培养基上生长繁殖，可形成菌落。观察菌落时，主要看以下内容：（1）大小：不同细菌，其菌落大小变化很大。常用其直径来表示，单位是mm或μm。（2）形状：主要有圆形、露滴状、乳头状或油煎蛋状、云雾状、放射状或蛛网状、同心圆状、扁平和针尖状等。（3）边缘特征：有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。（4）表面性状：有光滑、粗糙、皱褶、颗粒状、同心圆状、放射状等。（5）湿润度：有干燥和湿润两种。（6）隆起度：有隆起、轻度隆起、中央隆起和云雾状等。（7）色泽和透明度：色泽有白、乳白、黄、橙、红及无色等；透明度有透明、半透明、不透明等。（8）质地：有坚硬、柔软和粘稠等。 （9）溶血性：分为α－溶血、β－溶血和γ－溶血三种；2、液体培养基上的生长特性：（1）浑浊度：有强度浑浊、轻微浑浊和透明三种。（2）底层情况：包括有沉淀和无沉淀两种，有沉淀又可分为颗粒状和絮状两种。（3）表面性状：分为形成荚膜、菌环和无变化三种情况。（4）产生气体和气味：很多细菌在生长繁殖的过程中能分解一些有机物产生气体，可通过观察是否产生气泡或收集产生的气体来判断；另一些细菌在发酵有机物时能产生特殊气味，如鱼腥味、醇香味等。（5）色泽：细菌在生长繁殖的过程中能使培养基变色，如绿色、红色、黑色等。3、半固体培养基上的生长特性：有运动性的细菌会沿穿刺线向周围扩散生长，形成侧松树状、试管刷状；无运动性的细菌则只沿穿刺线呈线状生长。注意事项：1、细菌的分离培养必须严格无菌操作。2、接种环或接种针在挑取菌落之前应先在培养基上无菌落处冷却，否则会将所挑的菌落烫死而使培养失败。3、划线接种时应先将接种环的环部稍弯曲，同时用力适度；分区接种时，每区开始的第一条线应通过上一区的划线。4、不同细菌所需要的培养时间相差很大，应根据不同的菌种培养观察足够的时间。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训六细菌的药物敏感试验（纸片法）技术一、目的要求：1、掌握消毒药及治疗药物的杀菌或抑菌作用。2、学会药物敏感性试验的操作技术。二、设备材料：接种环酒精灯试管架恒温箱镊子常用消毒剂浸有药物的干燥滤纸片普通琼脂平板大肠杆菌枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的培养物各种抗生素三、实验实训内容：（一）化学消毒剂的杀菌作用：1、以接种环取大肠杆菌及葡萄球菌菌液（18－24h肉汤培养物），用连续划线法分别接种于两个琼脂平板上，使菌液密布于培养基表面。2、以灭菌镊子夹取纸片（直径6mm ）分别浸于0.1%升汞、5％石炭酸、2％来苏儿、2％碘酊中，每管中浸2片。浸透后，再将纸片一一取出，分别放在已接种细菌的琼脂平板表面，各纸片间的距离要大致相等。3、置37℃培养24h，观察结果。测量各消毒剂纸片周围的抑菌圈，并记录、分析实验结果。（二）细菌对抗生素等药物的敏感试验：测定细菌对抗生素等药物的敏感度，可供临诊上正确选用药物。1、取6－8h的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的肉汤培养物，以密集均匀划线法，分别接种在两个普通琼脂平板表面。2、在平皿底部背面用蜡笔标记“青霉素”、“链霉素”、“庆大霉素”、“盐水”、“黄连素”。3、用灭菌镊子夹取浸有药物的干燥滤纸片，按标记位置，轻轻贴在已接种好细菌的琼脂培养基的表面，一次放好，不得移动。图1：药物敏感性试验纸片的贴法4、置37℃温箱内培养18－24h后取出，观察并记录结果、分析结果。根据纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，按表1标准确定细菌对抗生素等药物的敏感度。表1细菌对不同抗菌药物敏感性标准药物名称抑菌圈直径（mm）敏感度青霉素<10不敏感11-20中度敏感>20高度敏感土霉素四环素、新霉素链霉素、磺胺<10不敏感11-14中度敏感>14高度敏感庆大霉素卡那霉素<12不敏感13-14中度敏感>14高度敏感氯霉素红霉素<10不敏感11-17中度敏感>17高度敏感其他<10不敏感11-15中度敏感>15高度敏感附：干燥抗菌纸片的制备法取直径6mm 的无菌滤纸片，浸于一定浓度的抗菌药液中，如青霉素为100IU/ml链霉素、氯霉素等抗生素为2mg/ml，磺胺嘧啶针剂为0.1mg/ml，黄连素或其他中药可根据需要稀释原液。一般每毫升药液中装有滤纸片100片，浸泡1-2h后干燥备用，药剂维持1－2个月有效。注意事项：1、试验用菌种对于被测定的抗生素应具有高度敏感性。2、药检所下发的试验菌种为冷冻干燥品，保存于5－8℃冰箱内，一般可保存约1－3年。3、实验时，一定要建立“无抗生素操作的观念”。4、磺胺类药物用无胨琼脂平板，因蛋白质会使磺胺失去作用。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训七外界环境微生物测定技术一、实验目的：1、了解自然界中微生物的的分布及其意义。2、掌握水中细菌总数的测定方法。二、设备材料：琼脂玻璃平皿生理盐水试管吸管恒温箱自来水三、实验实训内容：（一）空气中的微生物：取琼脂平皿数个，分别置于不同的地方，打开皿盖，暴露于空气中，经5、10、30、60分钟后，将盖盖好，置恒温箱中培养24－48小时，观察生长情况。（二）水中的微生物：水的来源不同，所含细菌种类及活菌数亦不同，按国家规定，1ml饮用水中的细菌总数不得超过100个，大肠杆菌指数不应大于3。水的细菌总数检查法如下：1、吸取自来水1ml移至无菌空培养皿内。2、另取3只空培养皿鸡2支盛有9ml生理盐水的试管备用。吸取井水或池水1ml移至第一个空培养皿内，另1ml移至第一支盐水管中。用吸管吹吸三次，将第一支盐水管混匀后吸出1ml（1：10）移至第二个空培养皿内；吸另1ml移至第二支盐水管中，用同法混匀后，吸出1ml（1：100）移至第三个空培养皿内。3、取4个融化后冷至45℃的高层琼脂，分别倾于上述四个培养皿内，混匀后，静置凝固。4、将上述四个凝固后的培养皿置于恒温箱（37℃ ）内，孵育24小时，取出观察。分别在细菌菌落计算器上算出自来水、井水或池水中每毫升所含活菌数。计算菌落时，一般选择生长有30－300个菌落的培养皿，算出精确菌落数后，分别乘以稀释倍数，再取其平均值即得。（三）动物毛上的微生物：用无菌剪刀和镊子剪取牛毛一束，浸于无菌生理盐水3－5毫升中，振荡片刻，吸取浸泡液0.5毫升作倾注培养，置恒温箱中，次日观察其结果。（四）家畜口腔中的微生物：取新鲜琼脂平皿及加有5％蔗糖的培养琼脂平皿各一个，距离一尺，对准家畜的鼻腔，其呼吸三次，盖好后置恒温箱中培养，次日或再次日检查结果。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训八实验动物接种技术一、实验目的：1、掌握实验动物注射的一般方法。 2、掌握实验动物的剖检技术。3、掌握微生物学诊断用病料的采取法及包装寄送。二、设备材料：实验动物注射器针头酒精碘酊注射药物三、实验实训内容：（一）实验动物接种操作技术 1、实验动物的选择和接种后的管理：根据病原微生物的生物学特点和实验目的的要求选择适宜的实验动物（应考虑经济、健康、适龄、体重和性别适宜）和接种途径。接种完毕后，实验动物必须隔离饲养，作好标记，并作详细记载。2、实验动物的固定方法：示教。 3、实验动物的接种（感染）方法：①皮下接种：一般在前肢或腋下皮下接种。 ②腹腔接种：将后肢抬高，从腹后侧注射，确定注射针进入腹腔后方可注射。③静脉注射：家兔可进行耳外缘静脉注射，小鼠可可尾中缘静脉注射。 ④肌肉注射：从肌肉丰满处注射。（二）实验动物的剖检、病料采取、包装要求 1、实验动物死亡后立即解剖，以免腐败菌及肠道菌侵入脏器，给病原菌的分离带来困难，甚至不能得到应有的结果，同时亦影响病理变化的观察。 2、解剖用器械，必须经煮沸或高压灭菌。每一脏器用一套器械。 3、实验动物放瓷盘中固定后，先用消毒药水将毛充分浸湿，打开皮肤后，用酒精棉球采灼烧腹壁，剪开腹壁。 ①以无菌操作法取病料，放入无菌容器送检或进行接种工作，再取病料制片，以备染色镜检。②用酒精棉球灼烧胸壁，打开胸腔，无菌采取胸水、心包液及血液进行培养或送检，并取病料制片染色镜检。③观察实验动物有无特殊病变。④作好详细记录。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训九病毒鸡胚接种技术一、目的要求：1、要求学生掌握病毒的鸡胚培养方法2、掌握病毒的鸡胚接种技术二、设备材料：消毒设备注射器头皮针滴管接种环酒精灯受精卵照蛋器孵化设备卵盘卵杯接种箱眼科镊子和剪子毛细吸管锥子灭菌平皿恒温箱碘酒70%酒精镊子剪刀封蜡三、实验实训内容：　　1．准备蛋胚：孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。2．接种： (1)绒毛尿囊膜接种(a)将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。(b)用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。(c)用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。(d)用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。(e)用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0．05—0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。(f)在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。(2)尿囊腔接种:　用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。　　(a)将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。(b)将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。(c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液。(d)用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。(3)羊膜腔接种(a)将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。(b)用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm 的裂痕。注意勿划破壳膜。(c)用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。(d)用灭菌尖头镊子，两页井拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来。(e)左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液0．1ml。针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。(f)用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时，保持蛋胚的钝端朝上。3．收获(1)绒毛尿囊膜(a)用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。(b)将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。然后或用于传代，或用50%甘油保存。(2)尿囊腔接种法收获尿囊液(a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。(b)用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。(c)将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4℃以下的温度中保存。(d)观察鸡胚，看有无典型的症状。(3)羊膜腔接种法收获羊水(a)按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。(b)先吸出尿囊液。再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0．5—1．0ml。经无菌试验后，保存于低温中。(c)观察鸡胚的症状。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训十鸡新城疫病毒的红细胞（血）凝集与凝集抑制试验（微量法）操作技术一、目的要求： 1、要求学生掌握鸡新城疫病毒的红细胞凝集和凝集抑制试验（微量法）的操作方法。2、要求学生掌握这两个试验的判定方法。二、设备材料：96孔V型微量血凝集反应板微量吸液器（0.025ml）微量振荡器玻璃注射器离心管离心机灭菌生理盐水0.5%鸡红细胞悬液鸡新城疫弱毒疫苗Ⅱ系或Lasota系鸡新城疫标准阳性血清和阴性血清被检血清三、实验实训内容：（一）试验准备1、0.5％红细胞液的制法：由鸡翅静脉或心脏采血，放入灭菌试管（按每毫升血加入3.8%灭菌柠檬酸钠0.2ml做抗凝剂）内，迅速混匀，将此血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心5～10min，用吸管吸去上清液和红细胞上的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞，按0.5％的稀释度加入生理盐水即配成0.5％鸡红细胞生理盐水悬液。（二）病毒的红细胞凝集试验（微量法）1、用微量吸液器每孔均滴加生理盐水0.025ml。2、用微量吸液器再吸取0.025ml病毒，滴于第1孔中，用吸液器挤5次混合后吸至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去0.025ml，病毒稀释倍数依次为1：2～1：2048，第12孔做对照。3、再以微量吸液器每孔加0.5％鸡红细胞悬液0.025ml。4、置于振荡器上振荡混匀约1min，放入37℃恒温箱中15～30min，取出观察结果。表1鸡新城疫红细胞凝集（HA）试验（微量法）（单位：ml）孔号1234567891011120.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.05弃（0.025）0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0251︰21︰41︰81︰161︰321︰641︰1281︰2561︰5121︰1024生理盐水鸡新城疫弱毒疫苗0.5％鸡红细胞悬液病毒稀释倍数作用温度与时间振荡器上振荡混均约1min，放入37℃恒温箱中15～30min，结果（例）++++++++++++++++++++++++++++++++++－－－注：++++表示完全凝集++表示不完全凝集－表示不凝集观察结果：将反应板倾斜成45度角，沉于管低的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔低的红细胞铺平孔低，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。如上例:病毒液的HA效价1︰256，HI试验时，病毒抗原液0.025 ml内须含4个凝集单位，则应将病毒液作成256/4＝64倍的稀释液.（二）病毒的红细胞凝集抑制试验(HI)：1、用微量吸液器1-10孔均滴加生理盐水0.025ml，第11孔滴加0.05ml。2、用微量吸液器再吸取0.025ml被检血清，滴于第1孔中，用吸液器挤5次混合后吸至第2孔，依次倍比稀释到第10孔，弃去0.025ml，被检血清稀释倍数依次为1：2～1：1024。3、再以微量吸液器每孔加入含有4个单位的病毒液0.025ml至第10孔，第11孔为红细胞对照孔，不加病毒液。4、置于振荡器上振荡混均约1min，放入37℃恒温箱中15～20min。5、再以微量吸液器每孔加0.5％鸡红细胞悬液0.025ml，放振荡器上振荡1～2混匀，置15～30min，判定结果。6、每次试验应做抗原对照管。表2鸡新城疫细胞凝集抑制试验操作术式（微量法）（单位：ml）孔号123456789101112被检血清稀释倍数1︰21︰41︰81︰161︰321︰641︰1281︰2561︰5121︰1024红细胞抗原对照对照生理盐水0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.05弃（0.025）0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025免疫血清4单位病毒0.5％鸡红细胞悬液注：－表示不凝集++表示不完全凝集++++表示完全凝集结果观察：将反应板倾斜成45度角，沉于管低的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔低的红细胞铺平孔低，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2位底的对数表示。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训十一真菌的检验技术 一、目的要求：1.掌握观察霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。2.掌握常用的霉菌制片方法二、设备材料：曲霉青霉根霉毛霉乳酸石炭酸棉蓝染色液20％甘油查氏培养基平板马铃薯培养基无菌吸管载玻片盖玻片U形棒解剖刀玻璃纸滤纸等三、实验实训内容：1．一般观察法　于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。2．载玻片观察法(1)将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U形玻棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套（根据需要而定）如此装置的培养皿叠起，包扎好，用1．05kg/cm2，121．3℃灭菌20分钟或干热灭菌，备用。(2)将6—7ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0．5—1cm2的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。(3)用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针，取（肉眼方能看见的）一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。(4)在培养皿的滤纸上，加无菌的20％甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加。将培养皿置28℃培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。3．玻璃纸透析培养观察法(1)向霉菌斜面试管中加入5ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。(2)用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。(3)用1ml无菌吸管吸取0．2ml孢子悬液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。(4)置28℃温室培养48小时后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训十二凝集试验 一、目的要求：1、掌握玻片凝集和试管凝集试验的操作方法2、掌握这两种试验的结果判定。二、设备材料：沙门氏菌诊断血清鸭沙门氏菌及大肠杆菌24h培养物布氏杆菌阳性及阴性血清布氏杆菌抗原生理盐水毛细吸管试管架刻度吸管接种环玻片三、实验实训内容：（一）玻片凝集试验：将玻片分成三格，在第3格内加1滴生理盐水，第1、2内各加1滴沙门氏菌诊断血清，用接种环自斜面挑取鸭沙门氏间液置于第3格内混匀，随即再取一环置第1格内混匀；接种环灭菌后取大肠杆菌混匀于第2格，静止2－3min后观察结果。结果判定：第一格内应形成白色块状凝集物；第2、3格内均无凝集物形成。（二）试管凝集试验：1、取小试管7支依次编号，按表1先加入生理盐水。2、吸取布氏杆菌阳性血清0.2ml于第1管连续吹吸3次，充分混匀后，吸出1.5ml弃之，再吸出0.5ml加入第2管，同法混匀后又吸取0.5ml于第3管，依次类推连续稀释到第4管，混匀后吸弃0.5ml。第5管不加阳性血清，第6管中加1：25稀释的阳性血清0.5ml，第7管中加1：25稀释的阳性血清o.5ml。3、吸取1：20布氏杆菌抗原于各管内0.5ml，分别摇匀后置37℃24h，观察结果。4、结果判定：以产生明显凝集（++）的血清最高稀释度为其效价。判定标准：++++大凝集块，液体透明，为100％凝集。+++凝集片明显，液体较透明，为75％凝集。++凝集片可见，液体不太透明，为50％凝集。+液体浑浊，少量细菌凝集，为25％凝集。－液体均匀浑浊，无凝集。管号血清稀释度稀释法成份（毫升）12345671：251：1001：200对照 1：50抗原对照阳性血清1：25阴性血清1：250.5%生理盐水被检血清抗原（1：20）2.30.50.50.50.5－－0.20.50.50.5－0.50.50.50.50.50.50.50.50.5弃1.5弃0.5四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。实验实训十三琼脂扩散试验技术一、目的要求：1、掌握环状沉淀和琼脂扩散试验的一般操作。2、掌握这两种试验的结果判定。二、设备材料：小试管毛细吸管三角烧瓶高压灭菌器酒精灯玻片或平皿打孔器温箱及湿盒等优质琼脂1g加pH7.4的0.01mol/lPBS或生理盐水（禽类血清用8％盐水）100ml。抗原：鸡马立克氏病阳性抗原及待检鸡毛囊或马传贫抗原抗体：鸡马立克氏病标准诊断血清或疑似马传贫的病马血清及阳性血清三、实验实训内容：（一）环状沉淀试验（以炭疽杆菌为例）：1、抗原制备：取可疑患炭疽死亡病畜皮肤或脏器约1g放试管或小三角烧瓶中，加生理盐水510ml，煮沸30-40min。冷却后按最初量补足生理盐水，用滤纸过滤2－3次，取澄清液作为待检抗原。2、取3支小试管，用毛细血管加0.1ml炭疽沉淀血清（注意液面勿有气泡）。3、取其中一只用毛细血管将待检抗原沿管壁轻轻加入，使其重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有一整齐界面。4、另两只小试管作对照，一支加炭疽阳性抗原，一支加生理盐水，方法同上。5、在5－10min内判断结果，上下重叠的两液界面上出现乳白色环者为炭疽阳性，证明被检动物死于炭疽。加炭疽阳性抗原的对照管应出现白环，另一对照管则否。（二）琼脂扩散试验：1、取1％琼脂加热融化后用毛细血管加入清洁的玻片上或倒入平皿中，厚2.5-3mm，注意勿倒出气泡。 2、冷凝后打孔，先在纸上画好7孔图案，将上述琼脂玻片或平皿置其上，用金属管或玻璃管按图形位置打孔，用针头或小镊子将孔内琼脂块挑出，外周孔径6mm，中央孔4mm，孔距3mm。孔打完后轻轻在火焰上过数次或用小玻棒加热后封闭孔底。3、中央孔加入马立克氏病标准诊断血清，1、4孔加入阳性抗原，其余各孔加待检鸡毛囊（或中央孔加绵羊血清，周围孔加兔抗羊血清）。样品用毛细吸管滴加，满孔为度。各样品吸管必须标明，不得混用。加样后置湿盒中，于30－37℃温箱中扩散24h，观察结果。4、阳性抗原与标准血清间有明显致密的沉淀带，若样品抗原的沉淀线与之融合可判为阳性；若待检毛囊孔与标准抗血清间无沉淀带出现则为阴性。四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。五、作业：1、实验报告。2、心得体会。四、使用说明：1、本指导书根据《教育部关于加强高职高专教育人才培养工作的意见》精神，按照高职高专牧医专业培养目标，行业岗位的能力需求和专业教学要求而制定。2、本实验实训总学时数为24学时，实训学时数与理论学时数之比约为1：2，按照国家高技能人才的培养要求，制定实训项目。教学实习进行开放式教学，全程学生参与，达到技能掌握的目的。五、实验教材与参考书：教材：《动物微生物》中国农业出版社农业部高职高专规划教材参考书：《兽医微生物学实验指导》农业出版社《动物微生物技能考核方案》自编