分子生物学及检验

《分子生物学及检验》课程学习指南分子生物学及检验课程学习指南（适用于医学检验专业专科使用）生物化学及生化检验教研室编28 《分子生物学及检验》课程学习指南一、课程简介（一）课程目标分子生物学检验技术是生命科学领域中最具有活力的前沿科学。其理论、技术和方法不断地被应用于临床，在疾病的预防、预测、诊断、疗效的评价等诸方面发挥着愈来愈重要的作用，产生了一个新的学科方向——分子医学，分子生物学检验技术是分子医学的重要组成，为疾病病因诊断提供信息和依据，是一门具有广阔前景、并逐渐走向独立的学科。本课程着重介绍分子生物学检验技术的基础理论、技术方法和临床应用，及其有关的基本概念、原理和方法；并详细介绍了一些新近发展的重要技术及其应用，充分反映了分子生物学检验技术的发展趋势。包括三大内容：第一部分主要介绍：生物大分子（基因）的结构与功能、基因组的结构与功能、基因与基因组学等基本理论；第二部分培养学生的基本操作技能，掌握分子生物学常用技术（核酸的分离纯化技术、PCR，分子杂交、核酸序列分析等），基因重组技术。第三部分应用介绍：在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、复杂性疾病的分子诊断等。通过本课程的学习，使学生能够：1、掌握分子生物学的基本知识和基本理论。2、掌握一些重要的、常用的分子生物学检验技术。3、熟悉分子生物学技术在检验医学中的应用。4、了解分子生物学检验技术实验的基本操作。（二）教学内容与时间安排分子生物学及检验是专科医学检验技术专业的一门专业必修课，总学时36学时其中理论课30学时，实验课6学时。表1《分子生物学检验》学时分配表.教学内容时数总时数理论实验一绪论11二原核生物基因组与病毒基因组11三真核生物基因组22四癌基因与抑癌基因22五核酸的分离与纯化532六聚合酶链式反应及应用532七核酸分子杂交技术与应用33八基因工程33九生物芯片技术与应用22十基因诊断222（三）学习参考资料1、参考书①《分子生物学检验技术》，吕建新主编，中国医药科技出版社。②《医学分子生物学》，冯作化主编，人民卫生出版社。③《分子诊断学》，尹一兵主编，高等教育出版社。2、学习网站丁香园（http://www.dxy.cn）检验医学网（http://www.labmed.cn）28 《分子生物学及检验》课程学习指南检验医学在线（http://www.yhyg.com）检验地带网（http://www.labdd.com）分子生物学数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）二、学习指南第二章原核生物基因组和病毒基因组学习目标：掌握：分子生物学检验技术研究的主要内容熟悉：分子生物学检验技术的历史了解：分子生物学检验技术在医学中的应用重点难点剖析：重点：分子诊断学的理论基础难点：分子诊断学的理论基础测试题一、选择题1、下列叙述哪项是错误的A.原核生物基因组具有操纵子结构B.原核生物结构基因是断裂基因C.原核生物基因组中含有插入序列D.原核生物基因组中含有重复序列E.原核生物结构基因的转录产物为多顺反子2、下列哪项不符合转位因子的含义A.转位因子是基因重组的一种形式B.可在质粒与染色体之间移动的DNA片段C.转座子是转位因子的一个类型D.可移动的基因成分E.能在一个DNA分子内部和两个DNA分子之间移动的DNA片段3、质粒的主要成分是A.多糖B.蛋白质C.氨基酸衍生物D.DNA分子E.脂类4、原核生物的基因组主要存在于A.质粒B.线粒体C.类核D.核糖体E.高尔基体5、大肠杆菌类核结构的组成是A.双链DNAB.RNAC.蛋白质+DNAD.支架蛋白E.RNA+支架蛋白+双链DNA6、操纵子结构不存在于A.细菌基因组中B.病毒基因组中C.真核生物基因组中D.大肠杆菌基因组中E.原核生物基因组中7、下列哪项描述是错误的28 《分子生物学及检验》课程学习指南A.细菌是单细胞生物B.细菌是原核生物C.细菌无细胞核结构D.细菌生长快、个体小E.细菌以有丝分裂的方式增殖8、下列哪项叙述不正确A.F质粒的主要特征是带有耐药性基因B.R质粒又称抗药性质粒C.Col质粒可产生大肠杆菌素D.F质粒是一种游离基因E.R质粒在基因克隆中应用较多9、下列说法正确的是A.质粒的主要成分是RNAB.质粒的复制依赖于宿主细胞C.宿主细胞离开了质粒就不能生存D.质粒的存在对宿主细胞没有任何影响E.不同种类的质粒不能共存于同一菌株中10、病毒的遗传物质是A.DNAB.RNA和蛋白质C.DNA或RNAD.RNA和DNAE.DNA和蛋白质11、病毒生物学性状及感染的致病性主要取决于A.病毒早期蛋白B.病毒衣壳表面糖蛋白C.病毒核酸D.病毒晚期蛋白E.病毒衣壳蛋白12、下列哪种病毒是DNA病毒A.冠状病毒B.反转录病毒C.HCVD.HIVE.腺病毒13、基因的编码产物不包括A.snRNAB.hnRNAC.启动子D.转录因子E.核酶14、已知某mRNA的部分密码子的编号如下：127128129130131132133GCGUAGCUCUAAAGCUGAUUC以此mRNA为摸板，经翻译生成的多肽链含有的氨基酸数目为A.127B.128C.129D.130E.131二、填空题1、基因组中不同的区域具有不同的生理功能，有些是编码蛋白质的_________，有些是复制和转录的调控区，也称为_________。2、根据细菌染色体对质粒复制的控制程度是否严格，可将质粒分为_________、_________。质粒按转移方式又可分为_________、_________、_________。3、转位因子是指_________的基因成分，转位因子可分为_________、_________、_________三种类型，转位引起的遗传效应有_________、___________、_________。4、朊病毒是一种具有传染性的变异的_________。三、名词解释1、基因2、操纵子3、质粒4、基因组5、质粒的不相容性6、结构基因四、问答题1、简述原核生物基因组的特点。2、什么是质粒，质粒有哪些性质？28 《分子生物学及检验》课程学习指南参考答案：一、选择题1、C2、A3、B4、A5、B6、C7、A8、D9、B10、E11、D12、C13、A14、A15、E16、E17、D18、A二、填空题1、核小体2、经典的遗传标记小卫星中心（或微卫星标记）单核苷酸多态性标记（SNP）3、遗传图谱物理图谱序列图谱基因图谱4、多基因病三联体重复血红蛋白病苯丙酮尿症遗传性原发性痛风5、回文序列（或回文结构）十字形发夹形三、名词解释1、假基因是指多基因家族中，不产生有功能的产物的那些基因，通常由有功能的基因发生缺失，倒位或点突变而失活所致。2、RFLP即限制性核酸内切酶片段长度多态性。多态性出现在限制性核酸内切酶的酶切位点序列中，用某个限制性核酸内切酶来水解基因组的某段序列时，在同种的不同个体之间可能被水解成长度不等的DNA片段，这段序列在该种生物的群体中形成多态性。3、卫星DNA属高度重复序列。由于这类序列的碱基组成不同于主体DNA，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA。4、基因多态性是基因中某个基因在同种生物的不同个体中，同时或经常存在的两种或两种以上的变异型或基因型的现象。5、内含子是指真核生物结构基因中不编码蛋白质的氨基酸的DNA序列，在初级转录产物的加工过程中被剪接去除掉。6、外显子是指真核生物结构基因中编码蛋白质的氨基酸的DNA序列，在初级转录产物的加工后形成的成熟mRNA中仍然被保留。7、真核生物结构基因大多由不连续的几个编码序列所组成，编码区与非编码区相间排列，称为断裂基因。8、端粒酶是一种核糖核蛋白酶，具有逆转录酶活性，能以自身RNA为模板合成端粒DNA片段，在染色体DNA的末端复制中起重要作用。四、问答题1、细胞核基因组的DNA与蛋白质结合形成染色体。除配子细胞外，体细胞有两个同源染色体，因此基因组有两份同源的基因组。染色体储存于细胞核内，是基因组遗传信息的载体。特点：单顺反子结构、断裂基因、重复序列、多基因家族和假基因、不连续复制、多态性、端粒结构等。2、（1）原核生物通常只有单条染色体，且染色体只有一份基因组；而真核生物有许多条染色体，且体细胞基因组有两份同源的基因组。（2）结构基因的结构不同：原核生物结构基因是连续排列的，没有内含子；真核生物是断裂基因，内含子和外显子相间排列。（3）原核生物是单顺反子mRNA，真核生物是多顺反子mRNA。（4）原核生物基因组小，有基因重叠；真核生物基因组较大，没有基因重叠，有大量的重复序列。3、基因病分为单基因病和多基因病，由结构基因异常所致。常见的单基因病：三联体重复所致的相关疾病、血红蛋白病、苯丙酮尿症、遗传性原发痛风等。常见的多基因病：原发性高血压、糖尿病、实体瘤等。28 《分子生物学及检验》课程学习指南第三章真核生物基因组学习要求掌握原核生物、真核生物、病毒基因组的一般特征熟悉基因组概论了解人类基因组计划重点难点剖析重点：基因组的功能单位一一基因的特点，基因组的定义及特点；原核生物、真核生物、人类、病毒、线粒体基因组的一般特征；难点：基因组的特点、人类基因组计划测试题一、选择题1、人类线粒体基因组中A.产生唯一一个大的转录产物，然后剪接加工，释放出各种RNA分子B.几乎所有的DNA不编码基因产物C.大多数编码蛋白的基因产物是连续的D.几乎所有的编码蛋白质的基因都从不同的方向进行转录2、线粒体基因组是A.为环状的B.不编码蛋白质产物C.遗传密码和核基因组是一样的D.含有大量的短的串联重复序列3、基因组是A.一个二倍体细胞中的染色体数B.生物体的一个特定细胞内的一套完整遗传物质C.一个生物体内所有基因的分子总量D.遗传单位4、指导蛋白质合成的结构基因大多数为A.单拷贝序列B.中度重复序列C.高度重复序列D.回文结构5、遗传图谱的标记不包括A.单核苷酸多态性标记B.表达序列标签C.简短串联重复D.限制性片段长度多态性6、人类基因组的组织特点描述不正确的是A.功能相关的基因常散在分布于不同的染色体上B.基因组含重复序列C.基因组中各个基因的大小和内部组织的差异不大D.每个结构基因都有单独的调控序列7、下列不属于单基因病的是A.原发性高血压B.遗传性原发性痛风C.血红蛋白病D.血友病8、关于多基因家族的特点描述错误的是A.由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因28 《分子生物学及检验》课程学习指南B.通常由于突变而失活C.假基因与有功能的基因是同源的D.所有成员均产生有功能的基因产物9、关于断裂基因的叙述正确的是A.结构基因中的DNA序列是断裂的B.外显子与内含子的划分不是绝对的C.转录产物无需剪接加工D.全部结构基因的序列均保留在成熟的mRNA分子中E.原核生物与真核生物基因的共同特点10、有关外显子的说法正确的是A.外显子的数量是描述基因结构的重要特征B.外显子转录后的序列出现在hnRNA中C.外显子转录后出现在成熟的mRNA中D.外显子的遗传信息可以转变为蛋白质的序列信息E.以上都对11、真核生物基因的特点是A.编码区连续B.多顺反子RNAC.内含子不转录D.断裂基因E.外显子数目=内含子数目-112、增强子是A.一段可转录的DNA序列B.一段可翻译的mRNA序列C.一段具有转录调控作用的DNA序列D.一段具有翻译调控作用的DNA序列E.一种具有调节作用的蛋白质因子13、下列哪种疾病应进行染色体检查A.先天愚型B.苯丙酮尿症C.白化病D.地中海贫血E.遗传性原发性痛风14、早孕习惯性流产者应首先进行的遗传检查是A.针对染色体数目和结构异常的核型分析B.SNP分析C.某些酶的活性检查D.病毒感染的基因诊断E.RFLP分析法15、导致脆性X综合症的遗传基础是A.染色体数目畸变B.移码突变C.染色体重排D.同义突变E.动态突变16、下列疾病中属于单基因病的是A.21三体综合症B.阿尔茨海默症C.高血压D.精神分裂症E.Huntington舞蹈症17、端粒酶是一种A.依赖DNA的DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.RNA连接酶D.逆转录酶E.拓扑异构酶18、关于端粒酶的说法，错误的是A.是一种RNA聚合酶B.有RNA和蛋白质组成C.端粒酶催化端粒DNA延长D.活性缺乏时，端粒会缩短E.合成一小段DNA重复单位二、填空题1、真核生物染色体的基本组成单位是_________。28 《分子生物学及检验》课程学习指南2、遗传标记技术经历了几次由“粗”到“细”的演变，第一代遗传标记是_________，第二代遗传标记是_________，第三代遗传标记是_________。3、人类基因组计划的基本任务可以用4张图来概括，即_________、_________、_________、_________。4、基因病可分为单基因病和_________，单基因病常见的有_________、_________、_________、_________。5、由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向排列而成，这种序列称为_________，这种结构在复性时可形成_________或_________结构。三、名词解释1、假基因2、RFLP3、卫星DNA4、基因多态性5、内含子6、外显子7、断裂基因8、端粒酶四、问答题1、真核生物基因组有何特点？2、比较真核生物基因组与原核生物基因组的不同之处。3、基因病有哪些类型？请举例说明常见的基因病。参考答案一、选择题1、B2、A3、D4、C5、E6、C7、C8、A9、B10、C11、C12、E13、C14、A二、填空题1、结构基因2、松弛型质粒严紧型质粒结合型质粒可移动型质粒自传递型质粒3、可移动插入序列转座子可转座的噬菌体三、名词解释1、基因是基因组中的一个功能性遗传单位，是储存蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。2、操纵子是数个功能上相关联的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位。3、质粒是细菌染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子。4、基因组是指一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。5、质粒的不相容性是指同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入不同的子细胞。6、结构基因是基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列。四、问答题1、（1）原核生物没有典型的细胞核，基因组DNA位于细胞中央的核区，没有核膜将其与细胞质隔开，但能在蛋白质的协助下，以一定的组织形式盘曲、折叠包装起来，形成类核。类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双链闭环的超螺旋DNA。（2）操纵子结构是原核生物基因组的功能单位。原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇的串联排列在染色体上。（3）结构基因中没有内含子成分，基因是连续的，其RNA合成后不需剪接加工。结构基因编码序列一般不重叠。28 《分子生物学及检验》课程学习指南（4）具有编码同工酶的基因。2、质粒是细菌染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子。质粒的一般性质是：①质粒的主要成分为环状双螺旋DNA分子。②质粒可以在质粒与细菌染色体或细菌与细菌之间进行移动。③质粒的复制依赖宿主细胞。④质粒带有选择性标记，如抗药性标记等。⑤质粒具有不相容性。第四章癌基因与抑癌基因学习目标掌握癌基因、抑癌基因的概念，肿瘤发生的多基因学说。熟悉癌基因的激活机制，抑癌基因的失活机理。了解常见的癌基因和抑癌基因，以及它们的作用机理。重点难点剖析重点：癌基因、抑癌基因的概念难点：癌基因、抑癌基因的作用机理。测试题一、选择题1、第一个发现的癌基因是A．mybB.ablC.mycD.srcE.erb2、能编码具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌基因是A.rasB.mybC.srcD.sisE.erb3、表达产物属GTP结合蛋白的癌基因是A.srcB.rasC.mycD.mybE.sis4、第一个发现的细胞癌基因是A．c-mybB.c-ablC.c-mycD.c-srcE.c-erb5、编码蛋白为p21的癌基因是A.mycB.mybC.sisD.rasE.src6、第一个分离到的抑癌基因是A.Rb基因B.P53基因C.P16基因D.BRAC基因E.APC基因7、Rb基因的表达产物是A.p103B.p21C.p53D.p105E.p168、ras癌基因被激活的机制一般为A.染色体易位和基因重排B.基因扩增C.点突变D.获得外源启动子E.甲基化水平降低9、下列不属于细胞癌基因激活机制的有A.点突变B.基因重排C.基因扩增D.染色体易位E.原癌基因基因甲基化程度升高10、下列关于恶性肿瘤发生发展的叙述哪项是错误的A.多种因素协同作用B.肿瘤是一种基因病28 《分子生物学及检验》课程学习指南C.是多因素多阶段变化的结果D.单个基因变化即可引起细胞恶性转化E.既有癌基因改变，也包括抑癌基因变化11、关于细胞癌基因说法不正确的是A.正常细胞本身没有B.含有内含子C.编码产物调控细胞增殖D.可能为病毒癌基因的源头E.通过多种机制激活12、产物为生长因子受体的癌基因是A.rasB.sisC.mycD.cyclinE.erbB213、关于P53基因的叙述，哪项是正确的A.野生型p53蛋白可以促进细胞生长B.P53基因是肿瘤抑制基因C.P53基因定位在13号染色体上D.突变型p53蛋白与生长因子受体同源E.P53基因突变是染色体易位引起的14、细胞癌基因活化的机制A.点突变B.DNA重排C.基因扩增或病毒基因启动子及增强子插入D.染色体易位E.以上都是15、Rb基因的失活与下列哪种肿瘤的发生的关系密切A.结肠癌B.肾母细胞瘤C.视网膜母细胞瘤D.膀胱癌E.乳腺癌二、填空题1、癌基因包括_________和_________两种，具有潜在的诱导细胞_________的特征。2、细胞癌基因在生命过程中的作用是通过其表达产物来实现的，通常根据编码的表达产物的功能，将细胞癌基因的表达产物分为_________、_________、_________、_________、_________、_________。3、根据编码的表达产物的功能，将细胞癌基因家族分为_________、_________、_________、_________、__________________。4、抑癌基因又称为_________，是存在于正常细胞内的一类可_________的基因，其表达产物主要包括_________、_________、_________、_________。5、当正常细胞受到_________、_________以及_________等致癌因素的作用后，经过多次打击多阶段变化后便形成了肿瘤。根据肿瘤的发生发展通常可以分为三个阶段，即_________、_________、_________。6、原癌基因ras基因突变的常用检测方法有_______________、_______________。抑癌基因P53的检测常用方法有______________、______________、______________。三、名词解释1、原癌基因2、抑癌基因3、细胞癌基因4、病毒癌基因四、问答题1、原癌基因是如何被激活的？2、正常细胞是如何一步步转化为肿瘤细胞的？28 《分子生物学及检验》课程学习指南参考答案一、选择题1、D2、C3、B4、A5、D6、A7、D8、C9、E10、D11、A12、E13、B14、E15、C二、填空题1、细胞癌基因病毒癌基因恶性转化2、生长因子类细胞骨架蛋白类核内DNA结合蛋白类（或反式作用因子类）核内转录因子类3、Sis家族erb家族src家族ras家族myb家族和myc家族4、抗癌基因抑制细胞生长跨膜受体胞质调节因子或结构蛋白转录因子转录调节因子5、物理化学生物启动阶段促癌阶段转化阶段6、PCR/ASO探针法PCR-SSCP法PCR-SSCP法PCR产物分析法PCR-RLFP法三、名词解释1、癌基因是正常细胞中一类编码关键性调控蛋白的基因，在正常细胞的生长、发育、分化过程中具有重要的生理功能，当其被异常激活时，可使正常细胞发生恶性转化而导致肿瘤的发生。2、抑癌基因是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜在的抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。3、细胞癌基因是控制细胞生长的基因，在异常表达时，这些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续表达或过高表达，从而引起细胞恶性增生。4、病毒癌基因是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，是一类存在于病毒（主要是反转录病毒）中，能使敏感宿主产生肿瘤或使体外培养细胞转化的基因。四、问答题1、原癌基因激活后，基因编码产物的结构和功能发生变化和（或）表达的量增加，导致细胞增生信号增强。原癌基因激活的机制包括：①点突变；②甲基化程度降低；③基因扩增；④染色体易位或基因重排；⑤获得外源启动子而激活。2、正常细胞受到物理因素（如紫外线、电离辐射等）、化学因素（如黄曲霉素）以及生物因素（DNA或RNA致癌病毒）等因素作用下，经多次打击多阶段变化便形成肿瘤。①启动阶段：在启动因子的作用下细胞的DNA分子已发生改变，但表型仍正常。启动因子以极低剂量与细胞接触一次，即可启动细胞癌变过程，各种干细胞及处于增生状态的细胞比静止状态的细胞对启动因子的作用更敏感。②促癌阶段：表型正常而DNA已发生变化的癌前细胞，在启动因子和促癌因子的作用下，细胞的表型发生变化，出现癌细胞的表型。促癌因子单独无致癌作用，必须在启动因子的作用下，才能促进细胞转化。这类因子要与细胞反复接触才能促进细胞的恶变，即存在一定的剂量阈。③转化阶段：是细胞恶变的终末阶段，即已恶变的细胞进入自主分裂增生状态。促癌阶段形成的增生性病灶会进一步侵润、转移。第四章核酸的分离与纯化学习要求掌握：真核基因组DNA、真核RNA、质粒DNA的分离纯化熟悉：核酸分离纯化的设计及原则了解：蛋白质的分离纯化重点难点剖析28 《分子生物学及检验》课程学习指南重点：基因组DNA分离的常用方法，如酚抽提法；RNA分离纯化方法，如酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法；质粒DNA分离纯化方法，如加热法和碱裂解法。难点：RNA分离纯化方法，质粒DNA分离纯化方法。测试题一、选择题1、以下哪种方法不是DNA的适宜保存法A.调节TE缓冲液的pH到8.0B.加入少量氯仿C.加入EDTA金属螯合剂D.常温保存E.加入NaOH2、构建高容量载体的DNA文库时最好使用下列哪种方法提取得DNAA.酚抽提法B.甲酰胺解聚法C.玻棒缠绕法D.异丙醇沉淀法E.乙醇沉淀法3、以下哪种方法不能抑制或灭活RNase活性A.实验玻璃器皿及溶液用DEPC处理B.加入强烈的胍类变性剂C.加入β巯基乙醇D.加入EDTA金属离子螯合剂E.加入DTT4、波长260纳米紫外光下，A值等于1时的光密度值大约相当于多少的双链DNAA.38μg/mlB.33μg/mlC.50μg/mlD.20μg/mlE.40μg/ml5、以下属于DNA的保存方法的是A.溶于TE缓冲液中在-70℃保存B.溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水中，在-70℃～-80℃保存C.沉淀溶于70%的乙醇溶液或去离子水的甲酰胺溶液中，可在-20℃长期保存D．以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解保存E.异丙醇沉淀保存6、CsCl-EB法纯化质粒DNA时，经离心后各种成分由上到下依次分布为A.RNA蛋白质染色体DNAcccDNAB.染色体DNA蛋白质cccDNARNAC.蛋白质染色体DNAcccDNARNAD.RNA染色体DNAcccDNA蛋白质E.染色体DNAcccDNA蛋白质RNA7、下列关于紫外分光光度法用于核酸的纯度鉴定的说法正确的是A.TE缓冲液中，纯RNA的A260/A280比值为1.8，纯DNA的A260/A280比值为2.0B.TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0C.蛋白质与核酸提取过程中加入的酚均使比值上升D.比值为1.8时的DNA溶液一定为纯的DNA溶液E.比值为2.0时的RNA溶液一定为纯的RNA溶液8、下列不属于从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的方法是A.DEAE纤维素膜插片电泳法B.电泳洗脱法C.冷冻挤压法D.压碎与浸泡法E.柱层析法9、下列选项中不是保证RNA制备成功的条件的是A.在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力的抑制其活性B.28 《分子生物学及检验》课程学习指南选择性的使用针对RNase的蛋白质变性剂并联合使用RNase的特异性抑制剂，极大地防止内源性RNase对RNA的水解。C.应使用pH4.5～5.5的水饱和性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离D.在抽提过程中加入少量氯仿，目的在于消除抽提过程中因蛋白质变性而产生的泡沫E.低温操作10、纯DNA的A260/A280比值为1.8，可使比值升高的是A.蛋白质B.酚C.RNAD.氯仿Mg2+11、下列哪项属于核酸纯度的鉴定A.紫外分光光度法B.以放射性标记的寡脱氧核苷酸oligo(dT)为探针的Northern杂交C.聚丙烯胺凝胶电泳D.离子交换层析E.琼脂糖凝胶电泳12、下列不属于分离纯化质粒DNA的方法的是A.碱裂解法B.甲酰胺解聚法C.煮沸裂解法D.SDS裂解法E.牙签少量裂解法13、完整的无降解或降解很少的总RNA电泳图谱中，3个条带的荧光强度积分应呈特定的比值，下列表达错误的是A.沉降系数大的核酸条带分子量大，电泳迁移率低B.分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低C.28SRNA的荧光强度比18SRNA的荧光强度高D.原核生物总RNA电泳结果，荧光强度由高到低为：23SRNA，16SRNA，5SRNAE.RNA中以mRNA的含量为最多14、SDS的作用是A.螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性B.高效水解RNAC.引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质，并使它们降解D.增加溶液黏度，维持渗透压，防止机械力作用而降解E.沉淀DNA15、有关核酸的鉴定描述错误的是A.荧光光度法可以鉴定核酸样品的纯度B.紫外分光法可以鉴定核酸样品的浓度C.纯DNA样品的A260/A280比值为2.0D.琼脂糖凝胶电泳可以判断核酸样品的完整性E.蛋白质与在核酸提取过程中加入的酚均使比值下降16、RNA中数量最多的是A.mRNAB.rRNAC.tRNAD.hnRNAE.snRNA17、抽提过程中加入少量异戊醇可以A.去除植物色素和蔗糖B.消除抽提过程中产生的泡沫C.去除核酸样品中的恒量酚D.使酚脱水防止mRNA的丢失E.提高RNA回收率18、为了避免反复冻融对核酸样品产生的破坏作用，最好A.将核酸大量保存B.将核酸小量分装保存C.将核酸沉淀保存D.将核酸冻干保存E.将核酸溶解保存19、PAGE最有效的分离范围为A.50bp～500bpB.500bp～5000bpC.5bp～500bp28 《分子生物学及检验》课程学习指南D.50bp～10MbE.300bp～30000bp20、琼脂糖凝胶最有效的分离范围为A.50bp～500bpB.500bp～5000bpC.5bp～500bpD.50bp～10MbE.300bp～30000bp二、名词解释：1、挖块回收法2、荧光光度法三、问答题1、简述异硫氰酸胍-酚一步法提取RNA的原理。2、RNA的分离纯化过程中应如何有效地防止RNase对RNA的降解。3、试述酚抽提法的方法原理。4、分离纯化核酸的基本原则是什么？如何保持其完整性？5、简述从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。6、质粒DNA的提取有哪些方法？参考答案一、选择题1、D2、B3、D4、C5、A6、C7、B8、D9、D10、C11、A12、B13、E14、C15、C16、B17、B18、B19、C20、D二、名词解释1、A260/A280：核酸样品在紫外光260nm和280nm下的吸光度的比值，用于核酸的纯度鉴定，在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A280比值为2.0，比值升高或降低均表示不纯。2、荧光光度法是指基于核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙黄色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比这一原理对溶液浓度进行定量分析的方法。三、问答题1、（异）硫氰酸胍-酚氯仿法是经典的一步法，用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。它以4mmol/L的（异）硫氰酸胍与0.1mmol/L的β-巯基乙醇变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提裂解液，最后通过异丙醇沉淀洗涤而获得RNA。该法具有简便、经济和高效的特点，能同时迅速地处理多个标本，且RNA的完整性与纯度均很高。总RNA的产量取决于标本的起始量。但该法不适合于从富含甘油三酯的脂肪组织中提取总RNA。2、（1）要避免细胞外RNase的污染：选择一个洁净的实验室进行操作以防止因细菌、真菌等微生物而带来RNase酶的污染。由于操作者本人亦是RNase污染的一个重要来源，因此操作时必须带手套和口罩。对实验用的试剂和器材，尽量用一次性的材料和新包装的化学试剂，所有的玻璃器皿与溶液均应以RNase的抑制剂DEPC进行处理，并在处理后除去残留的DEPC。另外，在冰浴条件下进行操作，也是减低RNase活性的有效措施。（2）尽快地抑制细胞内RNase的活性：选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂、蛋白水解酶和能与蛋白质结合的阴离子去污剂。另外，在变性溶液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等还原剂可以破环RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解、灭活。28 《分子生物学及检验》课程学习指南3、（1）方法：酚抽提法是以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析和沉淀处理，获得所需的DNA样品。（2）原理：裂解缓冲液中的EDTA为二价金属离子螯合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时还有降解DNA酶的作用。无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA并避免DNA的消化，而蛋白酶K则有水解蛋白质的作用。酚可以使蛋白质变性，也抑制DNA酶的活性。pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。4、（1）核酸分离纯化的基本原则是：①保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本要求；②尽量排除其他分子的污染，保证核酸样品的纯度。（2）保持核酸完整性应：首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。其次，对无法避免有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。5、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法有：①DEAE纤维素膜插片电泳法；②电泳洗脱法；③冷冻挤压法；④低熔点琼脂糖挖块回收法。6、质粒DNA的提取方法有：①碱裂解法：该法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。②煮沸裂解法；③SDS裂解法；④其他方法：如小量一步提取法，牙签少量制备法。第四章聚合酶链式反应及其应用学习要求掌握：PCR的基本原理，实时荧光定量PCR的基本原理熟悉：PCR的常见问题及体系优化了解：PCR方法的标准化重点难点剖析重点：PCR的概念和基本原理；PCR反应体系的组成；实时荧光定量PCR的概念、原理和荧光示踪方法难点：PCR产物的检测方法；PCR技术的发展变化和PCR相关的扩增技术；临床PCR实验室的标准化和质量控制测试题一、填空题1、DNA链的Tm主要取决于核酸分子的A.A-T含量B.C-G含量C.A-G含量D.T-G含量E.C-T含量2、以mRNA为模板合成cDNA的酶是A.DNA酶B.TaqDNA聚合酶C.末端转移酶D.RNA酶E.反转录酶3、聚合酶链式反应是一种A.体外特异性转录RNA的过程B.体外翻译蛋白质的过程C.体外特异性转录DNA的过程D.体外特异性复制DNA的过程E.体内特异性复制DNA的过程4、有关PCR描述下列哪项不正确A.是一种酶促反应B.引物决定了扩增的特异性C.扩增的产量按Y=A（1+X）n(A是模板量，X是扩增效率，n是循环次数)D.循环次数越多产物量越大，增加循环次数可提高产物量E.扩增的对象是DNA序列28 《分子生物学及检验》课程学习指南5、决定PCR反应特异性和PCR长度的物质是A.模板B.dNTPC.引物D.缓冲液E.TaqDNA聚合酶6、关于PCR引物的描述，不正确的是A.引物的长度一般在18～25bpB.引物内部不能存在连续的互补序列，防止产物二聚体和发夹结构C.引物中G+C含量占45%～55%D.引物的3’可以带有生物素、荧光素或酶切位点E.两条引物的Tm值应该尽量相近7、下列关于TaqDNA聚合酶的描述正确的是A.催化一条双链DNA3’端羟基与另一条双链DNA5’端磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键B.TaqDNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，PCR扩增过程中有校正功能C.增加酶量可以提高反应速度，减少碱基错配D.扩增的DNA片段越长，错配几率越大，每次循环移码突变率为1/8000左右E.在引物的3’-OH末端加入脱氧单核苷酸，形成3’，5’-磷酸二酯键8、下列除什么外是PCR反应体系中必需存在的成分A.引物B.模板C.dNTPD.Mg2+E.DMSO9、下列因子不影响聚合酶链式反应忠实性的是A.退火温度B.反应pH值C.牛血清白蛋白D.MgCl2E.TaqDNA聚合酶10、TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA末端加上1个碱基A.dGTPB.dATPC.dCTPD.dTTPE.dTTP11、一条引物的序列是GACTCCATGATACGATCTACTG，它的Tm值约为A.68℃B.58℃C.64℃D.72℃E.46℃12、平台效应的出现与下列哪个因素关系密切A.引物浓度B.初始模板量C.TaqDNA聚合酶浓度D.Mg2+浓度E.反应变性的时间13、下列哪种方法不可以用作未知点突变的检测方法A.RFLPB.融点曲线分析C.SSCPD.DGGEE.Squencing二、填空题1、PCR的每一个循环包括3个步骤：即_________、_________、_________，从理论上讲，一个分子的模板经过n次循环可得到_________拷贝产物。2、产于PCR反应的成分主要是_________、_________、_________、_________和缓冲液。3、引物决定PCR扩增产物的特异性和_________，PCR反应中的引物为化学合成的_________。4、TaqDNA聚合酶具有_________活性，能催化DNA的合成，但是缺乏_________活性，因此无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。5、耐热的DNA聚合酶除了TaqDNA聚合酶外，还有_________、_________、_________。这些酶与TaqDNA聚合酶相比不仅具有较高的热稳定性，还具有较高的保真性。6、临床基因扩增检验实验室必须包括四个工作区域：__________________、__________________、__________________、__________________。7、PCR实验系统中的污染主要有________________、________________、________________、其中污染的主要来源是________________。二、名词解释1、聚合酶链式反应2、反转录PCR28 《分子生物学及检验》课程学习指南3、PCR-RFLP4、原位PCR四、问答题1、简述聚合酶链式反应的原理和反应过程。2、简述检测PCR产物的点突变的方法有哪些？参考答案一、选择题1、B2、、E3、D4、D5、C6、D7、E8、E9、C10、B11、C12、B13、A二、填空题1、变性退火延伸2n2、模板引物脱氧核苷三磷酸（dNTP)TaqDNA聚合酶3、长度寡核苷酸4、5’→3’聚合活性3’→5’外切活性5、PwoDNA聚合酶TthDNA聚合酶PfuDNA聚合酶6、试剂贮存与准备区标本制备区扩增反应区产物分析区7、扩增片段的污染（产物污染）试剂污染标本间的交叉污染扩增产物的污染三、名词解释1、聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是一个在体外特异性地复制一段已知序列的DNA片段的过程，这项技术使人们能够很快地从试管中获得大量拷贝的特异核酸片段。2、以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。首先必须将总RNA或mRNA进行反转录反应，以生成与之互补的cDNA，然后再以cDNA作为模板进行PCR扩增，得到所需要的目的基因片段。3、根据PCR产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的。在酶切位点的两侧设计引物，经扩增后，所得PCR产物用相应的内切酶进行水解并作电泳分离，产物能（或不能）被酶水解而产生不同片段长度，根据水解片段的大小和相应电泳位置可区分野生型和突变型靶基因片段。4、以组织固定处理细胞内的DNA或RNA，并以其作为靶序列进行PCR反应的过程称为原位PCR。原位PCR与普通PCR的主要区别在于模板的制备。四、问答题1、PCR技术模拟体内的半保留复制原理，在体外进行扩增的技术。PCR反应重复进行DNA复制的过程，使DNA复制得以扩增。每一次复制包括3个步骤，即变性、退火和延伸。①变性：将被复制片段的DNA在高于其融点温度（Tm）的条件下（94℃～95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板；②退火：将温度降低至引物的融点温度以下（40℃～70℃），使引物与模板互补结合；③延伸：将温度升至72℃左右，反应体系按照模板链的序列以互补的方式依次把dNTP加至引物的3’端，TaqDNA聚合酶使杂交双链不断延伸，直至形成新的DNA双链。上述的3个步骤为PCR的一个循环，每1个循环完成后，1个分子的模板被复制成两个分子。2、①PCR-RFLP：根据PCR产物的突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的，是目前最简单的一种检测点突变的技术。②等位基因特异性寡核苷酸：是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的技术。③单链构象多态性：DNA的空间构象取决于DNA分子本身的碱基组成，即使只有1个碱基的差别也会形成不同的二级结构。突变DNA和野生型DNA的PCR产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，具有不同的电泳迁移率，从而能区别野生型和突变型的靶基因。④变性梯度凝胶电泳：野生序列的PCR产物片段与突变序列的PCR产物片段的Tm不同，它们在电泳过程中被部分解链的先后不同，经过一定时间的电泳后，可以发现这些产物在凝胶中所处的位置也不同。⑤融点曲线法：野生型序列和突变序列因不同的Tm而产生不同的融点曲线。⑥PCR产物的序列分析。28 《分子生物学及检验》课程学习指南第四章核酸分子杂交技术与应用学习要求掌握：核酸分子杂交的基本原理；Southen/Northen印迹杂交熟悉：核酸探针的设计了解：其他杂交技术重点难点剖析重点：核酸分子杂交的基本原理，核酸的变性、复性；Southen/Northen印迹杂交的特点及应用。难点：Southen/Northen印迹杂交的特点及应用，核酸探针的纯化、检测、标记。测试题1、DNA链的Tm主要取决于核酸分子的A.A-T含量B.C-T含量C.A-G含量D.T-G含量E.C-G含量2、研究的最早的核酸分子杂交种类是A.菌落杂交B.Southern杂交C.Northern杂交D.液相杂交E.原位杂交3、Southern杂交通常是指A.DNA与RNA杂交B.DNA与DNA杂交C.RNA与RNA杂交D.蛋白质与蛋白质杂交E.DNA与蛋白质杂交4、寡核苷酸的最大优势是A.杂交分子稳定B.可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列C.易标记D.易合成E.易分解5、硝酸纤维素膜的最大优点是A.脆性大B.本底低C.共价键结合D.非共价键结合E.高结合力6、检测靶序列是RNA的技术是A.Southern杂交B.Western杂交C.Northern杂交D.Eastern杂交E.杂交淋巴瘤7、检测靶序列是DNA的技术是A.Southern杂交B.Western杂交C.Northern杂交D.Eastern杂交E.杂交淋巴瘤8、DNA双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，这一过程称A.变性B.复性C.复杂性D.杂交E.探针9、DNA或RNA样品中不同序列的总长度，称A.变性B.复性C.复杂性D.杂交E.探针10、具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称A.变性B.复性C.复杂性D.杂交E.探针11、一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称28 《分子生物学及检验》课程学习指南A.变性B.复性C.复杂性D.杂交E.探针12、标记的参与杂交反应的核酸分子，称A.变性B.复性C.复杂性D.杂交E.探针13、点/夹缝杂交可以用于A.快速确定是否存在目的基因B.用于基因定位分析C.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息D.阳性菌落的筛选E.蛋白水平的检测14、Southern印迹杂交可以用于A.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B.检测的目标是RNAC.用于基因定位分析D.阳性菌落的筛选E.蛋白水平的检测15、Nouthern印迹杂交可以用于A.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息B.检测的目标是RNAC.用于基因定位分析D.阳性菌落的筛选E.快速确定是否存在目的基因16、菌落杂交可以用于A.快速确定是否存在目的基因B.用于基因定位分析C.不仅可以检测DNA样品中是否存在某一特定的基因，而且还可以获得基因片段的大小及酶切位点分布的信息D.阳性菌落的筛选E.检测目标是RNA17、荧光原位杂交可以用于A.快速确定是否存在目的基因B.检测目标是RNAC.用于基因定位分析D.阳性菌落的筛选E.蛋白水平的检测18、以等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法诊断某常染色体隐性遗传病时，若能与突变探针及正常探针结合，则该样本为A.正常人B.杂合体患者C.纯合体患者D.携带者E.不能确定19、反义核酸的作用是A.封闭DNAB.封闭RNAC.降解DNAD.降解RNAE.封闭核糖体的功能20、一般来说，设计的寡核苷酸探针的长度为A.2～10bpB.17～50bpC.60～100bpD.100～200bpE.200～300bp21、下列关于cDNA探针的描述不正确的是A.利用mRNA通过RT-PCR在体外反转录可制备大量的cDNA探针B.cDNA探针不包含内含子C.cDNA探针不包含大量的高度重复序列D.由于cDNA探针自身携带的poly(dT),有可能产生非特异性杂交的问题E.cDNA探针合成方便，成为探针的重要来源二、填空题28 《分子生物学及检验》课程学习指南1、分子杂交的分类有许多种方法，根据杂交核酸分子的种类，可以分为_________、_________、_________；根据杂交探针的标记的不同可以分为_________和_________；根据杂交介质的不同，可以分为液相杂交、固相杂交和_________，固相杂交又可以分为_________、_________、_________和_________。2、核酸探针根据其来源和性质可分为_________、_________、_________。根据其标记方法可分为_________和_________两种。3、核酸分子中常用的杂交支持介质有_________，_________和带电荷的尼龙膜。从凝胶中把DNA转移到膜上的方法有_________和_________。4、转移到膜上DNA分子与膜的结合是松散结合的，因此需要进一步固定，用于核酸固定的方法有_________、_________和_________，目前最常用的是_________。5、核酸探针的全程标记有_________、_________、_________和_________方法。三、名词解释1、核酸分子杂交2、原位杂交3、探针4、融链温度四、问答题1、根据哪3种不同的分类方法可以将核酸分子杂交分为哪几类？2、简述Nouthern印迹杂交的操作步骤。3、请举例说明杂交技术在临床检验科基因诊断方面的应用。参考答案：一、选择题1、E2、D3、B4、B5、B6、C7、A8、A9、C10、B11、D12、E13、A14、A15、B16、D17、C18、D19、B20、B21、E二、选择题1、DNA与DNA杂交DNA与RNA杂交RNA与RNA杂交同位素杂交非同位素杂交原位杂交菌落杂交Southern杂交Nouthern杂交点与夹缝杂交2、DNA探针RNA探针放射性探针非放射性探针3、硝酸纤维素薄膜尼龙膜毛细转移真空转移4、烘烤紫外光固定碱固定烘烤5、随机引物标记法DNA切口平移标记法全程RNA探针标记法化学全程标记法三、名词解释1、单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称为核酸分子杂交。利用核酸分子杂交技术检测靶序列的技术称为核酸分子杂交技术。2、原位杂交是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基互补配对形成杂交体，然后应用组织化学或免疫化学方法在显微镜下进行细胞内基因定位的检测技术。3、进行分子杂交实验时，需要对参与杂交反应的核酸分子进行标记，这些被标记的核酸分子就称为探针。4、在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA变性会在很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的中点即DNA变性50%时的温度，称作融链温度。四、问答题1、①根据杂交核酸分子的种类，可以分为DNA与DNA杂交，DNA与RNA杂交，RNA与RNA杂交；②根据杂交探针标记的不同，可以分为放射性杂交与非放射性杂交；③根据杂交介质的不同，可以分为液相杂交、固相杂交和原位杂交；其中固相杂交又可分为菌落杂交、Southern杂交、Northern杂交、点杂交和夹缝杂交。2、Southern杂交的步骤为：①RNA的变性琼脂糖凝胶电泳；②28 《分子生物学及检验》课程学习指南将硝酸纤维素膜放在含有RNA电泳条带的凝胶上；③转印盘中的转移缓冲液将逐渐为胶合膜上的吸水纸吸收；④利用毛细作用将胶中的变性RNA分子转移到硝酸纤维素膜上；⑤转印完成后，使RNA分子固定到膜上；⑥膜上的RNA分子与探针杂交；⑦经放射自显影或其他检测技术显示出杂交区带。3、在临床检验科，杂交技术最常用于基因诊断的例子是镰状细胞贫血病的基因诊断。镰状细胞贫血是一种单基因遗传病，病因是编码血红蛋白的基因发生点突变导致β链第六位谷氨酸被缬氨酸取代。在血红蛋白基因的碱基序列上表现为第六位密码子GAA突变为GTA，也就是在这一位点发生了A到T的突变。由于这一突变导致了基因内部1个MstⅡ限制性酶切位点丢失，因而针对这一情况，可以设计与β-珠蛋白杂交的探针。先扩增靶片段，并用MstⅡ消化扩增的DNA片段，电泳分离消化的DNA片段。将DNA片段转印到硝酸纤维素膜上，采用Suothern杂交技术检测DNA片段。以此将正常人、携带者和患者区分开来。此外，还可以用凝血因子Ⅸ基因探针检测B型血友病，凝血因子Ⅷ基因探针检测A型血友病，用胰岛素基因探针检测糖尿病，用苯丙氨酸羟化酶基因探针检测苯丙酮尿症。以上都是杂交技术在临床检验科进行基因诊断的例子。第八章基因工程学习要求掌握：分子克隆的基本步骤，链末端终止法的原理熟悉：分子克隆的工具酶，DNA测序策略了解：分子克隆的载体重点难点剖析重点：分子克隆的工具酶（限制性核酸内切酶、DNA聚合酶）的作用特点；常用克隆载体（质粒DN、噬菌体）的特点。分子克隆技术的五大基本步骤，链末端终止法的原理难点：常用克隆载体（质粒DN、噬菌体）的特点；DNA测序策略；自动化测序的原理。测试题一、选择题1、限制性核酸内切酶切割后产生的DNA双链末端带A.5’磷酸基和3’羟基B.3’磷酸基和5’羟基C.5’磷酸基和3’磷酸基D.3’羟基和5’羟基E．以上都不是2、能识别并切割双链DNA分子特异性序列的酶称A.限制性核酸外切酶B.限制性核酸内切酶C.核酸酶D.核酶E.DNase3、不依赖于ATP的限制性核酸内切酶A.Ⅰ类限制性核酸内切酶B.Ⅱ类限制性核酸内切酶C.Ⅲ类限制性核酸内切酶D.Ⅳ类限制性核酸内切酶E.Ⅴ类限制性核酸内切酶4、识别和切割靶序列不同，而产生相同的粘性末端的酶A.同裂酶B.同工异源酶C.同尾酶D.同工异构酶E.甲基化酶5、与限制性核酸内切酶一起组成Ⅱ类限制-修饰系统28 《分子生物学及检验》课程学习指南A.同裂酶B.同工异源酶C.同尾酶D.同工异构酶E.甲基化酶6、限制性内切酶的反应系统中不应含A.2-巯基乙醇B.二硫苏糖醇C.牛血清清蛋白D.缓冲盐E.酚7、某种限制性内切酶能切割5’-CGG▼AATTCA-3’序列，将产生A.5’突出末端B.3’突出末端C.平末端D.5’或3’突出末端D.不能确定8、在DNA重组技术中，催化重组DNA形成的酶是A.DNA聚合酶ⅠB.Klenow片段C.连接酶D.末端转移酶E.限制性内切酶9、在DNA重组技术中，能给DNA片段3’端加上同聚物尾的酶A.反转录酶B.Klenow片段C.TaqDNA聚合酶D.末端转移酶E.碱性磷酸酶10、DNA重组技术中所谓的分子克隆的目的是A.构建重组DNA分子B.DNA的无性繁殖C.DNA的有性繁殖D.获得大量表达产物E.获得新的遗传特征11、转载容量最大的载体A.质粒载体B.噬菌体载体C.粘粒载体D.腺病毒DNAD.酵母人工染色体12、克隆质粒载体不应具备的特性A.复制子B.筛选标记C.多克隆位点D.较多的拷贝数E.分子量相对较大13、能产生单链DNA分子的载体是A.质粒载体B.粘粒载体C.M13mp噬菌体载体D.λ噬菌体载体E.穿梭载体14、酵母人工染色体装载容量可达A.千万个碱基对水平B.百万个碱基对水平C.十万个碱基对水平D.万个碱基对水平E.千个碱基对水平15、应用α-互补作用筛选时，阳性重组子克隆菌落为A.白色B.蓝色C.蓝白镶嵌D.无色E.溶菌斑16、穿梭载体必定同时带有A.两种细胞的复制起点（如原核和真核）B.两种抗药性标记C.两种不同类型的启动子（如原核和真核）D.两个多克隆位点E.两个拼接信号17、使用时应考虑其安全性的载体A.质粒载体B.粘粒载体C.单链丝状噬菌体载体D.λ噬菌体载体E.反转录病毒载体18、用下列方法进行重组体的筛选，哪一项能说明外源基因进行了表达A.Southern印迹杂交B.Northern杂交C.Western杂交D.原位菌落杂交E.斑点杂交19、有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法（Maxam-Gilbert）和酶学分析（Sanger）。酶学测序法的优点是A.碱基与特殊染料间不同的相互作用B.一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止28 《分子生物学及检验》课程学习指南C.可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序D.限制性位点与DNA末端标记的相关性E.反应是DNA特异的，RNA不会带来干扰。这样即减少纯化步骤，也节约了开支20、关于感受态细胞性质的描述，下列说法错误的是A.具有诱导性B.具有可转移性C.细菌生长的任何时期都可以出现D.不同细菌感受态的比例不同E.细胞处于对数生长期21、分子克隆中的T载体主要是与下列哪种产物连接A.单酶切产物B.双酶切产物C.同裂酶产物D.酶切后形成的平末端产物E.PCR产物22、多数连接酶的最佳温度是A.37℃B.30℃C.25℃D.16℃E.33℃23、Sanger的双脱氧终止法DNA序列测定中不需要下列哪种物质A.ddNTPB.dNTPC.[α-32P]dATPD.[α-32P]ddATPE.DNA聚合酶24、在分子克隆中的克隆指的是A.有性繁殖DNAB.无性繁殖DNAC.构建重组DNA分子D.建立单克隆抗体E.建立多克隆抗体25、Klenow片段具有什么酶的活性A.反转录酶B.RNA聚合酶C.DNA聚合酶D.连接酶E.解链、解旋酶二、填空题1、限制性核酸内切酶大多是从细菌中发现的，可分为三种类型，即_________、_________、_________，在基因工程中常用的是_________。限制性核酸内切酶根据其来源命名，第一个字母表示为_________，第二、第三个字母代表宿主菌的_________，第四个字母是_________，最后的罗马数字表示同株内发现和分离的先后顺序。2、许多细菌有_________，该系统使外来的DNA降解，而对于自身的DNA则加以修饰不被降解。通常是通过甲基化进行修饰，大肠杆菌有两种甲基化酶，即：_________、_________。3、目前已构建成功的载体有_________、_________、__________、_________等多种类型，根据其用途的不同将其分为_________和_________二类。4、YAC主要由_________、_________、_________和外源DNA分子构成的线性DNA分子，具有天然酵母的特征和生物性状。5、DNA连接酶有_________和_________两种，在连接反应中，粘性末端的连接效率比平末端连接效率_________。6、DNA序列测定的基本原理有_________和_________两种，自动化序列分析仪是根据_________设计出来的。三、名词解释1、DNA重组2、分子克隆3、工具酶4、限制性核酸内切酶5、粘性末端6、多克隆位点7、酵母人工染色体8、感受态9、转化10、转染四、问答题1、什么是载体？载体应具备哪些条件？2、DNA连接的方法有哪些？28 《分子生物学及检验》课程学习指南3、重组DNA分子导入宿主细胞的原理有哪些方法？4、CaCl2法的原理是什么？5、基因工程的基本步骤是什么？参考答案一、选择题1、A2、B3、B4、C5、E6、E7、A8、C9、D10、B11、D12、E13、C14、B15、A16、A17、E18、C19、B20、C21、E22、D23、D24、B24、C二、填空题1、限制性核酸内切酶Ⅰ限制性核酸内切酶Ⅱ限制性核酸内切酶Ⅲ限制性核酸内切酶Ⅱ宿主菌的属名宿主菌的种名缩写株或型2、限制修饰系统dam甲基化酶dcm甲基化酶3、质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体克隆载体表达载体4、着丝粒端粒复制子5、大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶高6、化学降解法酶法（双脱氧链终止法）双脱氧链终止法三、名词解释1、不同来源的DNA，通过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DNA分子的过程，称为DNA重组。2、分子克隆是指应用DNA重组技术，在体外对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子再导入宿主细胞，然后从单个细胞开始进行大量扩增，最终获得大量同一的DNA分子，亦称DNA克隆。3、DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对DNA进行切割、连接等操作，这些酶被称为工具酶。4、限制性核酸内切酶是指能识别和切割双链DNA分子特异性序列的核酸水解酶类。5、一些限制性核酸内切酶在对称轴的两侧相似的位置分别切割两条单链，产生带有单链突出的DNA片段，称粘性末端。6、多克隆位点即在载体的外源DNA片段插入区存在多种酶的单一酶切位点，使载体在使用上具有较大的灵活性。7、酵母人工染色体（YAC）是主要由着丝粒、端粒、复制子和外源DNA构成的线状DNA分子，具有天然酵母染色体的许多特征和生物性状。8、细菌在生长过程中，只有具有某一阶段的细菌才能成为转化的接受体，这种细菌称为感受态细菌。9、将重组DNA分子导入细菌，使其在细菌体内扩增和表达的过程称为转化作用。10、将外源DNA直接导入真核细胞的过程称为转染。四、问答题1、载体是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作；④具有合适的选择标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的选择标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等；⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子、前导序列等。2、DNA连接的方法很多，主要有黏端连接法和平端连接法，后者又包括平接法、人工接头法以及同聚物加尾连接法。这些方法主要依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA分子限制性酶切位点的性质来选择。28 《分子生物学及检验》课程学习指南3、将外源DNA直接导入真核细胞的过程称为转染。常用的方法有电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、脂质体法，此外还有DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射法等方法。4、当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，处于感受态，此时转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，DNA在42℃短时间热冲击后进入细胞，在丰富的培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖。该方法的转化效率为每微克DNA可获得105～106转化子。5、基因工程的基本步骤为：①目的基因的获取；②载体的构建与选择；③选择适当的限制性内切酶对载体和目的基因进行切割，用DNA连接酶在体外进行连接，构建成重组DNA分子；④重组DNA分子导入宿主细胞；⑤外源基因在宿主细胞中的表达和重组子的筛选。第九章生物芯片技术学习要求掌握：基因芯片、蛋白质芯片、缩微芯片实验室的基本概念。熟悉：基因芯片、蛋白质芯片、缩微芯片的原理。了解：基因芯片、蛋白质芯片的制备、应用。重点难点剖析重点：基因芯片、蛋白质芯片、缩微芯片实验室的基本概念及原理难点：基因芯片、蛋白质芯片的制备、应用测试题一、选择题1、常见的基因芯片合成方法有A.原位合成和直接点样法B.光引导原位合成和喷墨合成C.原位合成和在片合成D.分子印章压印合成和在片合成E.离片合成直接点样2、关于表达型芯片探针的设计，下列哪项是正确的A.需要知道待测样品中靶基因的精确细节B.序列的特异性要放到首要位置C.对于同一目的基因不可设计多个序列不相重复的探针D.序列一般来自已知基因的cDNA但不能来自EST库E.表达型基因芯片对基因的表达差异不能进行定量检测3、设计检测DNA序列变异的探针时A.检测变化点应该对应于探针的中心B.长度为N个碱基的突变区就需要4N+1个探针C.一组探针包括两个野生型探针和两个突变型探针D.该探针能对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描E.一般采用等长移位设计法4、作为芯片的固相载体主要有28 《分子生物学及检验》课程学习指南A.玻片、硅片等实性材料B.没有硝酸纤维素膜、尼龙膜及聚丙烯等膜性材料C.这些载体材料无需处理，其表面存在活性基团（如羟基或氨基）D.可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E.不需对介质表面进行预处理-活化5、基因芯片的原位合成A.是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针的基因芯片制备技术B.不适用于寡核苷酸探针C.不适用于制作大规模DNA探针芯片D.难以实现高密度芯片的标准化和规模化生产E.也称离片合成6、基因芯片的点样法是A.将预先合成好的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机直接点在芯片基片上B.该方法技术成本高、速度快C.构成方阵的寡核苷酸或cDNA片段不需要事先纯化D.多用小片段DNAE.多用于寡核苷酸和mRNA探针的芯片制备7、基因芯片技术的临床应用不包括A.疾病的诊断B.药物的筛选C.指导个体用药D.基因突变的检测E.用于蛋白质翻译后修饰的改变而引起的疾病的检测8、关于基因芯片说法不正确的是A.具有高效、灵敏的特点B.可大规模平行检测和分析来源于不同发育和分化阶段细胞内的mRNA和cDNA的情况C.可用于分析基因表达时空特征D.可用于检测DNA的差异表达E.具有低通量及平行性的特点9、基因芯片技术的本质是A.核酸分子杂交技术B.蛋白质分子杂交技术C.聚合酶链式反应D.基因重组技术E.酶切技术二、填空题1、生物芯片依据其功能可分为_________、_________、_________。2、基因芯片技术是一种大规模集成的固相核酸分子杂交。基因芯片制备的基本步骤包括_________、_________。基因芯片分析的主要步骤包括_________、_________、_________。三、名词解释1、生物芯片2、基因芯片3、蛋白质芯片四、问答题1、试述基因芯片在医学上的应用。2、简述蛋白质芯片在医学上的应用。28 《分子生物学及检验》课程学习指南参考答案一、选择题1、A2、B3、A4、A5、A6、A7、E8、E9、A二、填空题1、DNA芯片蛋白质芯片缩微芯片2、探针的设计探针在芯片上的布局样品的制备杂交反应信号检测三、名词解释1、生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地监测分析，从而判断样品中靶分子的数量。2、基因芯片又称DNA芯片，是根据核酸分子杂交的原理，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。3、蛋白质芯片是利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理，将蛋白质分子（抗原或抗体）结合到固相支持物上，这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。四、问答题1、基因芯片在医学上的应用主要有：基因表达分析；基因型、基因突变和多态性分析；感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势；药物筛选；指导用药及治疗方案；进行有效的产前筛查和诊断。2、蛋白质芯片主要用于基因表达的筛选；特异性抗原抗体的检测；生化反应的检测；疾病诊断；对疾病分子机制的研究；药物筛选及新药的研制开发。第十章基因诊断学习要求掌握：分子诊断的定义及应用意义，病毒的基因检测，单基因疾病的概念，血红蛋白病的分子诊断，分子诊断在移植配型中的应用熟悉：病原菌的基因检测，肿瘤相关基因的分子诊断，血友病的分子诊断了解：感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤、耐药性的分子诊断策略与方法重点难点剖析重点：分子诊断的定义及应用意义；感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤、耐药性的分子诊断策略与方法难点：各种常规的分子生物学技术在分子诊断中的作用；不同疾病实例的分子诊断基本策略与方法。测试题一、选择题1、目前认为最确切的基因诊断方法是A.核酸分子杂交B.基因测序C.细胞培养D.PCR2、不符合基因诊断特点的是A.特异性强B.灵敏度高C.易于做出早期诊断28 《分子生物学及检验》课程学习指南D.检测对象仅为自体基因E.被检基因不一定处于活化状态3、遗传病基因诊断最重要的前提是A.了解患者的家族史B.疾病的表型与基因型已经阐明C.了解相关基因的染色体定位D.了解相关的基因克隆和功能分析等知识E.进行个体的基因分型4、目前基因诊断常用的分子生物学技术不包括A.Southern杂交B.Western杂交C.Northern杂交D.DNA芯片技术E.等位基因特异性寡核苷酸分子杂交5、SNP的实质是A.碱基缺失B.碱基插入C.碱基替换D.移码突变E.转录异常6、DNA指纹的遗传学基础是A.连锁不平衡B.DNA多态性C.串联重复序列D.HMC的限制性E.MHC的多态性7、生殖细胞若发生基因结构突变可引起哪种疾病A.高血压B.肿瘤C.糖尿病D.遗传病E.传染病8、分子诊断对于下列哪类疾病最具有确切的临床意义A.单基因遗传病B.多基因遗传病C.染色体病D.肿瘤E.畸形9、地中海贫血的原因是A.铁代谢异常B.血红蛋白破坏加速C.血红蛋白生成障碍D.珠蛋白基因碱基突变导致氨基酸序列改变E.两条珠蛋白链生成不平衡10、亲子鉴定中目前应用最广泛的方法是A.基因测序B.多个SNP位点检测C.不同染色体上STR位点基因扫描D.PCR-SSCP技术E.PCR-RFLP技术11、PCR技术检测结核杆菌不常用的基因是A.MPB64蛋白基因B.IS986基因C.结核杆菌rRNAD.IS6110重复序列E.NDS2004重复序列12、HBV检验最常用的方法是A.免疫电镜检查HBV的病毒颗粒B.测定血清中HBVDNA含量C.测定血清中蛋白酶活性D.测定血清中HBV抗原抗体E.测定血清中HBV蛋白含量13、基因诊断对于下列哪类疾病最具有确切的临床诊断意义A.单基因遗传病B.多基因遗传病C.染色体疾病D.感染性疾病E.肿瘤14、关于SNP位点的描述，不正确的是A.单个SNP位点遗传信息含量大，因此具有广泛的应用前景B.被称为第三代DNA遗传标记C.在整个基因组中大约有300万个SNP位点D.生物芯片技术可以提高SNP位点的检测E.SNP位点是单个核苷酸的变异15、卡介苗是结核分枝杆菌发生A.形态结构变异B.毒力变异C.耐药性变异D.抗原性变异E.表型变异28 《分子生物学及检验》课程学习指南16、女性患者，27岁，低热、盗汗、乏力伴咳嗽、咳痰两个月，X线胸片拟诊为肺结核。为尽早明确诊断，应首选的检查是A.取痰标本作抗酸染色B.取痰标本作格兰染色C.结核菌素试验D.取痰标本作一般细菌培养E.取痰标本做动物接种二、填空题1、利用一些生物技术直接探查基因的存在和缺陷，从而对人体状态和疾病作出诊断，就是基因诊断。基因诊断检测的靶物是_________或_________。2、从基因的角度来说，人类疾病的发生，常涉及_________的突变和_________的入侵。3、常用的基因诊断技术有_________、_________、_________、_________。4、产前基因诊断的材料一般取自_________或_________DNA。三、名词解释1、基因诊断2、连锁分析四、问答题1、简述基因诊断的特点。2、简述基因诊断的基本流程。参考答案一、选择题1、B2、D3、B4、B5、C6、C7、D8、A9、E10、C11、E12、D13、A14、A15、B16、A二、填空题1、DNAmRNA2、内源基因外源基因3、PCR技术分子杂交技术基因芯片技术DNA序列分析技术4、羊水细胞绒毛滋养层母细胞三、名词解释1、利用一些生物技术直接探查基因的存在和缺陷，从而对人体状态和疾病做出诊断，就是基因诊断。基因诊断检测的靶物是DNA或mRNA。2、利用与疾病基因相连锁的某些基因，作为遗传标记，通过鉴定遗传标记的存在判断个体是否带有致病基因。本法无需更多了解疾病基因结构及其分子机制，属于间接诊断。四、问答题1、基因诊断的特点是：①高度的特异性；②高度的灵敏性；③早期诊断性：可以为一些重症疾病提供其他医学诊断难于实现的早期诊断；④应用的广泛性：被检基因不一定处于活化状态，可以利用具有组织或细胞特异性的基因进行检测，法医学可以血斑、精液斑中的DNA进行鉴定。2、基因诊断的基本流程包括：（1）样品的核酸提取；（2）目的序列的扩增；（3）核酸分子杂交；（4）杂交信号的检测。28