snt 2965-2011 植物病原真菌分子生物学检测规范

版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２９６５—２０１１植物病原真菌分子生物学检测规范犆狉犻狋犲狉犻狅狀狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犳狌狀犵犻犫狔犿狅犾犲犮狌犾犪狉犫犻狅犾狅犵狔２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学、深圳职业技术学院。本标准主要起草人：彭仁、曾大兴、习平根、李敏慧、姜子德、张卫东、乐海洋、陈德蓉、冯欣。Ⅰ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１植物病原真菌分子生物学检测规范１范围本标准规定了植物病原真菌分子生物学检测规范。本标准适用于植物及其产品中的植物病原真菌、分离纯化的植物病原真菌的分子生物学检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１９４９５．２转基因产品检测实验室技术要求ＧＢ／Ｔ２３６３２进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程ＧＢ／Ｔ２７４０３实验室质量控制规范食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１１２７小麦印度腥黑穗病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ１１５５玉米霜霉病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求ＳＮ／Ｔ２０８０栎树猝死病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ２１２６黑麦草腥黑穗病菌检疫鉴定方法３术语、定义和缩略语３．１术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１．１样品狊犪犿狆犾犲取自某一整体的一个或多个部分，旨在提供该整体的相关信息，通常作为判断该整体的基础。３．１．２聚合酶链式反应狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀；犘犆犚体外酶促合成特异ＤＮＡ片段的一种分子生物学实验方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即模板ＤＮＡ先经高温变性为单链，在ＤＮＡ聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与两条模板ＤＮＡ链上的一段互补序列发生退火，接着在ＤＮＡ聚合酶的催化下以四种脱氧核苷酸三磷酸（ｄＮＴＰｓ）为底物，使退火引物得以延伸。如此反复，使位于两段已知序列之间的ＤＮＡ片段呈几何倍数扩增。３．１．３巢式聚合酶链式反应狀犲狊狋犲犱犘犆犚；狀犘犆犚巢式ＰＣＲ利用两套ＰＣＲ引物对（巢式引物）进行两轮ＰＣＲ扩增反应的一种分子生物学实验技术。在这种技术中，首先用一对外引物进行第一轮ＰＣＲ扩增，然后再使用第一对引物扩增的ＤＮＡ序列内部的一对内引物再次扩增，所以称为巢式ＰＣＲ。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，因此实验的敏１ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１感性和特异性均有所增强。３．１．４多重聚合酶链式反应犿狌犾狋犻狆犾犲狓犘犆犚多重ＰＣＲ在同一反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的ＰＣＲ反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般ＰＣＲ相同。３．１．５实时荧光犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犘犆犚利用荧光信号伴随着ＰＣＲ产物的增加而增强的原理，在ＰＣＲ扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，得出大于平均值的荧光值即阈值，收集荧光信号增强到预定阈值时的ＰＣＲ循环次数，即Ｃｔ值。根据Ｃｔ值判断样品是否带有目标病原真菌。３．１．６目标犇犖犃阴性对照狀犲犵犪狋犻狏犲犇犖犃狋犪狉犵犲狋犮狅狀狋狉狅犾不含外源目标核酸序列的ＤＮＡ片段。该对照用于证明测试样品中不含有目标序列。３．１．７目标犇犖犃阳性对照狆狅狊犻狋犻狏犲犇犖犃狋犪狉犵犲狋犮狅狀狋狉狅犾参照ＤＮＡ、从可溯源的标准物质提取的ＤＮＡ或从含有目标序列的阳性样品中（或生物）中提取的ＤＮＡ序列。该对照用于证明测试样品中的分析结果含有目标序列。３．２缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）：扩增片断长度多态性ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｓｐａｃｅｒ）：基因间隔区ＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒ）：内转录间隔区ｍｔＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）：线粒体ＤＮＡＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）：随机扩增多态性ＤＮＡＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）：限制性片段长度多态性ｒＤＮＡ（ｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ）：核糖体ＤＮＡ４原理根据不同植物病原真菌基因组中的特异序列和突变，利用分子生物学方法对病原真菌进行鉴定。根据植物病原真菌侵染植物的发病程度，检测目标病原真菌的生物学特性，与近缘种区分难易程度不同，选择不同的分子生物学方法进行鉴定。５实验室总体要求及工作人员操作要求植物病原真菌分子生物学检测实验室应划分相对独立的工作区，具体包括：试剂配制和贮存区、样品制备区、核酸制备区以及核酸检测区。进入各工作区域应严格按照单一方向进行，即试剂配制和贮存区→样品制备区→核酸制备区→核酸检测区。实验室应有足够的人力资源满足植物病原真菌分子生物学检测工作及运行管理体系的需求。各个工作区的功能和仪器配置以及工作人员操作要求见２ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１ＧＢ／Ｔ１９４９５．２、ＧＢ／Ｔ２７４０３和ＳＮ／Ｔ１１９３。６安全防护从事植物病原真菌分子生物学检测的工作人员在整个实验操作过程中要戴手套，在强光、有害射线环境工作时要戴防护眼镜，防护服或采用其他安全有效的措施。７样品制备植物病原真菌分子生物学检测对象大致包括真菌培养物（菌丝）、发病组织、孢子、土壤等几类样品，样品处理及样品ＤＮＡ提取方法具体参见已公开发表的植物病原真菌分子检测文献（如：选用商品提取试剂盒则按照试剂盒要求进行，常规方法参见附录Ａ。注意从被真菌侵染的植物组织中抽提的总ＤＮＡ中，包含有两部分ＤＮＡ，一部分是植物基因组ＤＮＡ，另一部分为真菌基因组ＤＮＡ。样品制备时，每个样品都应取２个～３个平行样，进行重复性实验。８样品犇犖犃提取质量检查８．１总则除对少量孢子样品直接用于分子生物学检测外，应对其余样品ＤＮＡ提取质量进行检查。８．２琼脂糖凝胶电泳检测基因组的完整性将提取的基因组ＤＮＡ取２μＬ进行琼脂糖凝胶电泳检测，基因组完整性较好的ＤＮＡ样品电泳后将呈现出一条明显而清晰的条带。如果在指示前沿溴酚蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存在ＲＮＡ杂质，若所提总ＤＮＡ样品在０．５％琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而是弥散一片，则表明总ＤＮＡ样品已严重降解。８．３分光光度（紫外吸收）法检测犇犖犃的浓度和纯度利用紫外分光光度计检测ＤＮＡ样品的纯度及浓度：将待测ＤＮＡ样品按适当倍数进行稀释，在紫外分光光度计上分别读出２６０ｎｍ和２８０ｎｍ的光密度值及其比值，根据ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的值比较所提取的总ＤＮＡ的纯度。ＤＮＡ浓度计算公式：ＤＮＡ浓度（ｎｇ／μＬ）＝ＯＤ２６０×５０×核酸稀释倍数。在紫外分光光度计下检查，纯的总ＤＮＡ样品溶液的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的比值约为１．８。若ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的比值在１．８～２．０时，表明ＤＮＡ的纯度较好。若ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的比值大于２．０时，表明有ＲＮＡ污染；若ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的比值小于１．８时表明有蛋白质或酚污染。通过计算调整ＤＮＡ的浓度，调整后用于ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ模板浓度范围一般为１ｎｇ／μＬ～５０ｎｇ／μＬ；若提取的总ＤＮＡ样品浓度较低，可以在后续过程中通过加大模板量，增加反应次数，或者采用二次ＰＣＲ等方法来完成分子生物学检测。９核酸检测质控实验中应使用内参照对核酸的扩增进行质控，以避免实验过程中出现的假阴性。扩增检测的内参照通常为真菌某个基因ＤＮＡ片段。实验中一般采用能扩增所有供试材料的通用引物预防假阴性现象。实验中还应设有外加阴性对照、空白对照和阳性对照，阴性对照和空白对照用于检验实验过程中是否存在污染，阳性对照则用于检验试剂和实验操作上可能出现的问题。这些质控样本在检测过程中应使用与待测样品相同的反应混合液。３ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１１０污染的分析及处理植物病原真菌分子生物学检测中涉及的污染来源包括：样品间交叉污染、试剂污染、ＰＣＲ扩增产物污染、实验器具污染等，对污染的预防和处理原则见ＧＢ／Ｔ２７４０３。１１植物病原真菌分子生物学检测方法的确定１１．１分子生物学检测方法比较用于植物病原真菌检测的分子生物学方法包括常规ＰＣＲ方法、核酸分子标记方法（包括ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ）、实时荧光ＰＣＲ方法、基因芯片方法、核酸序列测定和分析方法等。上述各种分子生物学检测方法各有其优缺点，其比较参见附录Ｂ。目前较适用的是常规ＰＣＲ方法、实时荧光ＰＣＲ方法以及核酸序列测定和分析方法。以ＰＣＲ为基础的分子生物学检测的关键是从待测真菌ＤＮＡ序列信息中设计并筛选出特异性引物，其中真菌的４种核糖体基因（５Ｓ、５．８Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓ）及间隔区（ＩＴＳ、ＩＧＳ）有不同的进化程度，有的序列比较保守，有的序列进化较快，因此可以根据它们的序列信息，将真菌鉴定到属及属以上、种、亚种、变种、甚至菌株的水平（真菌核糖体不同序列分类等级参见附录Ｃ）。在植物病原真菌ｒＤＮＡＩＴＳ序列研究方面，目前已公开发表了用于扩增ＩＴＳ区域的几对常用引物（见附录Ｄ）。通过对真菌的ＩＴＳ区段进行ＰＣＲ扩增并测序，测序后即获得完整的包含ＩＴＳ１、５．８ＳｒＤＮＡ和ＩＴＳ２的ＩＴＳ序列。将该菌的ＩＴＳ序列在ＮＣＢＩ网站（ｈｔｔｐ：∥ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上进行同源性比较（ＢＬＡＳＴ），分析和确定该序列与之相符的情况，据此鉴定真菌，该方法应用极为广泛。１１．２分子生物学检测方法的确定原则应遵循快速、准确和简便的原则。植物病原真菌分子生物学检测所使用的方法应是公开发表的，并经过相关专家确认和一定数量的实验室验证，同时，这些方法的可操作性（包括操作的难易、花费时间和速度）以及对操作人员所应具备的相关知识和经验都应具有普遍适用性；仪器的选用以及对照样品、试剂等的获取都应具有普遍适用性。现有国家标准或行业标准明确规定的分子生物学检测方法，推荐参照该标准方法。对于待测对象本身，已公开报道或易于筛选出特异性引物的，可选用特异性引物进行常规ＰＣＲ法、巢式ＰＣＲ法完成分子生物学检测；对于带菌量较低（如：少量孢子样品）、病状区别不明显或隐症病害鉴定等，可采用巢式ＰＣＲ法、实时荧光ＰＣＲ法；对于多个病原真菌的同时检测，可采用多重ＰＣＲ方法。上述方法如需定量检测，均可采用实时荧光ＰＣＲ方法。对于难以筛选出特异性引物或较难区分鉴定的病原真菌，可参照以下原则：１）选用核酸序列测定和分析方法，通过对真菌在分类上有价值的序列（主要是ｒＤＮＡＩＴＳ序列和ｍｔＤＮＡ序列）进行测定，将所测定的序列与基因库（ＧｅｎＢａｎｋ）等已报道的序列或已知序列进行比较分析（在已报道序列的选择上，应注意选已有论文发表或权威实验室测定的序列），确定该序列与已报道序列的相符情况，据此鉴定真菌；２）对于较难区分鉴定的病原真菌，可采用ＲＡＰＤＰＣＲ、ＰＣＲＡＦＬＰ等分子标记方法，找出该病菌的特异性条带，然后将该特异性条带进行克隆测序，并根据序列设计特异性引物进行ＰＣＲ检测。１２结果判定１２．１对有国家标准或行业标准规定的病原真菌：直接采用国家标准或行业标准进行结果判定。１２．２对无国家标准或行业标准规定的病原真菌，视所采用的具体方法进行结果判定：１２．２．１普通ＰＣＲ法：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，若待测样品出现预期大４ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１小的特征条带，判定检测结果呈阳性；若待测样品未出现预期大小的扩增条带，判定检测结果呈阴性。１２．２．２巢式ＰＣＲ法：结果判定方法同普通ＰＣＲ法。１２．２．３多重ＰＣＲ法：对于单一病原真菌的检测，阳性对照出现预期数目和大小的目的片段；阴性对照和空白对照均未出现目的片段（若选用了通用扩增引物，则阴性对照只出现通用引物扩增的片段），若待测样品出现预期数目和大小的目的片段，判定检测结果呈阳性；若待测样品未出现预期数目和大小的目的片段，判定检测结果呈阴性。对于多个病原真菌的同时检测，在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下，待测样品ＰＣＲ扩增产物电泳出现的片段与阳性对照中特定菌种相应片段一致的为该菌种检测结果呈阳性，否则为阴性。１２．２．４实时荧光ＰＣＲ法：在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下，根据实时荧光ＰＣＲ的Ｃｔ值进行判定，在进行４０个循环的前提下，Ｃｔ值大于或等于４０，判定样品结果为阴性；Ｃｔ值小于３５，判定为阳性；Ｃｔ值介于３５与４０之间的为可疑阳性，如可疑阳性需要进行重复实验，或采用其他方法进行验证。１２．２．５分子标记法：采用ＰＣＲＲＦＬＰ、ＲＡＰＤＰＣＲ、ＰＣＲＡＦＬＰ等方法，若样品与阳性对照ＰＣＲ结果具有同样的多态性，空白对照无条带内阳性，否则为阴性。１２．２．６核酸序列测定和分析法：将待测样品核甘酸序列与已知序列进行比对，如果与已知的某种真菌相应的特异核酸序列完全一致则判定检测结果呈阳性，不完全一致则根据不同类真菌目前国际上认可的差异程度来判定或采用其他方法进一步检测。１２．２．７基因芯片技术：在阴性对照、阳性对照、空白对照均正常的情况下，如检测样品信噪比值大于或等于阳性质控信噪比值检测结果判定为阳性；如检测样品信噪比值小于阴性对照信噪比值检测结果判定为阴性；如检测样品信噪比值介于阴性对照信噪比值和阳性质控信噪比值之间为可疑阳性，需要采用其他检测方法加以验证。１３废弃物处理及防扩散措施植物病原真菌分子生物学检测完成后的废弃物应进行高温消毒后再做处理，有毒有害废物应经过除害再做处理，处理要符合环保要求。检测后的余样，如涉及检疫性有害生物的则应烧毁，或高压灭菌处理，以防止真菌随余样进行扩散。１４检测结果的复核必要时，应对检测结果进行复核，复核的程序与要求见ＧＢ／Ｔ２３６３２。１５样品保存分子生物学检测结果需保存相关电泳结果照片或待测真菌ＤＮＡ的碱基序列片段。对未发现检疫性真菌的样品应保藏６个月，对发现检疫性真菌的样品应保藏１年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕；保存期满后，需经灭菌后方可处理。５ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１附录犃（资料性附录）植物病原真菌分子生物学检测中样品处理及样品犇犖犃提取方法犃．１总则植物病原真菌分子生物学检测对象大致包括真菌培养物（菌丝）、发病组织、孢子、土壤等几类样品，依据这几类样品的特性，制定相应的样品处理及样品ＤＮＡ提取方法。犃．２真菌菌丝犇犖犃提取真菌分离培养后，通过单孢分离技术获取单孢菌株，将单孢菌株接种到ＰＤＡ平板上在温度２５℃条件下活化培养２ｄ～３ｄ。两种方法收集菌丝：一种是当菌丝长满培养基表面并未产孢时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从平板上挑菌饼到液体ＰＤＡ培养基中，２８℃１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养５ｄ～７ｄ，过滤收集菌丝，经冷冻抽干收集干燥的菌丝，－２０℃保存备用。真菌菌丝ＤＮＡ的提取方法参照ＳＮ／Ｔ１１２７、ＳＮ／Ｔ１１５５、ＳＮ／Ｔ２０８０、ＳＮ／Ｔ２１２６等。一般提取步骤如下：取备用菌丝０．１ｇ于液态氮中研磨至粉末状，置于１．５ｍＬ离心管，加入３００μＬ～５００μＬＣＴＡＢ缓冲液（其中含０．１ｇ蛋白酶Ｋ）混匀，６５℃水浴１ｈ；１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，保留上清液；加５００μＬＴｒｉｓ饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇（体积为２５∶２４∶１）混匀，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，保留上清液；再加５００μＬ三氯甲烷∶异戊醇（体积为２４∶１）混匀，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，保留上清液；加入１ｍＬ异丙醇混匀，－７０℃下放置１ｈ，或－２０℃过夜；１３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，可见ＤＮＡ沉淀；７０％乙醇冲洗ＤＮＡ沉淀，室温干燥；用５０μＬ～１００μＬＴＥ溶解ＤＮＡ，置于－２０℃下保存备用。犃．３病组织犇犖犃提取取一段新发病的植物组织（如：叶片、枝条或果皮等）放于２８℃温箱中湿培２４ｈ～３６ｈ后，一般病组织能表现出相关病状和病征，该发病组织即可用于病组织总ＤＮＡ提取。病组织总ＤＮＡ的提取方法见ＳＮ／Ｔ１１５５、ＳＮ／Ｔ２０８０。一般提取步骤同上。犃．４真菌孢子犇犖犃提取犃．４．１孢子数量较多时（如菌瘿）称取菌瘿约１０ｍｇ放入２ｍＬ离心管中，加入７颗玻璃珠（直径３ｍｍ～４ｍｍ）和２００μＬ预热的ＣＴＡＢ提取缓冲液，放在涡旋仪上以３０００ｒ／ｍｉｎ的速度涡旋３ｍｉｎ使孢子充分破壁；加入３００μＬＣＴＡＢ提取缓冲液和１０μＬ蛋白酶Ｋ（１０ｍｇ／μＬ），６５℃水浴１．５ｈ；加入等体积的三氯甲烷∶异戊醇（体积为２４∶１）混匀，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液（此步骤可根据情况重复）；往上清液中加入三分之二倍体积的－２０℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，－２０℃冰箱内放置至少１ｈ，使其充分沉淀后，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，弃上清液；用７０％乙醇３００μＬ漂洗沉淀两次；真空干燥后溶于３０μＬＴＥ，置６ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１于－２０℃下保存备用。犃．４．２孢子数量较少时（通常为数十个甚至几个，以黑粉菌冬孢子为例）当孢子数量较少时，一般挑取单个孢子，在显微镜下将孢子的壁破碎使其释放出ＤＮＡ，加入ＰＣＲ反应液，置于ＰＣＲ仪中进行反应。具体方法见ＳＮ／Ｔ１１２７、ＳＮ／Ｔ２１２６。一般提取步骤如下：解剖镜２０×～３０×下将单个冬孢子挑至已灭菌的盖玻片小块（１ｍｍ２２）上，用另一块小盖～２ｍｍ玻片盖住冬孢子，用灭菌小镊子轻轻按压小玻片使孢子破裂，用灭菌水冲洗小玻片转移至ＰＣＲ反应管中，直接加入ＰＣＲ混和液进行扩增。犃．５土壤总犇犖犃提取收集土壤样品，室温下晾干后碾碎过筛，剔除石砾等相关杂质，装袋后置于４℃冰箱保存。土壤总ＤＮＡ提取方法如下：称取１０．０ｇ土样，放入盛有１０粒无菌玻璃珠（直径３ｍｍ～５ｍｍ）的三角瓶中，加１５ｍＬ提取缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，１００ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡＮａ２，２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１％ＰＶＰ，２％ＣＴＡＢ，ｐＨ８．０）。在１８０ｒ／ｍｉｎ，３７℃条件下振荡３０ｍｉｎ，加２ｍＬ２０％ＳＤＳ继续振荡１０ｍｉｎ。６５℃水浴１ｈ后６０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液，加０．５倍体积ＰＥＧ（３０％）ＮａＣｌ（１．６ｍｏｌ／Ｌ），混匀后室温下静止２ｈ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，沉淀用２ｍＬＴＥ重新悬浮。加４ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（ｐＨ５．４）至终浓度０．３ｍｏｌ／Ｌ，用酚三氯甲烷异戊醇（体积比为２５∶２４∶１）抽提一次，０．６倍体积异丙醇沉淀２ｈ，?１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，沉淀干燥后，２００μＬＴＥ溶解，再用ＷｉｚａｒｄＤＮＡＣｌｅａｎＵｐＳｙｓｔｅｍ纯化后，置于－２０℃保存备用。７ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１附录犅（资料性附录）植物病原真菌常用分子生物学检测方法比较表表犅．１植物病原真菌常用分子生物学检测方法比较表方法优点缺点快速、灵敏、简便，是分子生物学检测的奠常规ＰＣＲ基性方法。目前已扩展了巢式ＰＣＲ、多重易产生交叉污染和假阳性等问题ＰＣＲ等多种方法减少交叉污染、操作快速、自动化程度高、实时荧光ＰＣＲ检测成本相对较高结果准确、能进行定量检测试验结果重复性高，可靠性强，可检测多对ＤＮＡ质量要求高，需要量大，操作复杂，ＲＦＬＰ分析个遗传位点耗费时间长，通常要接触放射性用量少，鉴定迅速，耗费时间短且不具放易受环境和操作人员的影响，要求试验条件ＲＡＰＤ分析射性较高，试验结果重复性较差，可靠性不高综合了ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ的优点，实验结果对ＤＮＡ模板质量要求高，时间长、步骤多，ＡＦＬＰ分析稳定可靠对操作技术要求较高利用高度保守的区段（如：ＩＴＳ）有时难以区核酸序列测定和操作简单、高效、精确，能准确反映真菌间分不同致病类型的菌株，同时序列分析结果易分析的遗传关系，可用于不同分类水平的研究受比对使用的基因库完善程度的影响高通量检测、自动化程度高，数据客观基因芯片技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低可靠８ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１附录犆（资料性附录）真菌核糖体不同序列分类等级表表犆．１真菌核糖体不同序列分类等级表核糖体序列适合分类水平５ＳｒＤＮＡ科（ｆａｍｉｌｙ）及科以上５．８ＳｒＤＮＡ属（ｇｅｎｕｓ）１８ＳｒＤＮＡ属、种（ｓｐｅｃｉｅｓ）２８ＳｒＤＮＡ属、种、变种（ｖａｒｉｅｔｙ）ＩＴＳ种、近似种（ｓｉｓｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ）、变种ＩＧＳ种、变种、菌株（ｓｔｒａｉｎ）９ 版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜２９６５—２０１１附录犇（规范性附录）真菌狉犇犖犃犐犜犛常用扩增引物及犐犜犛区段犚犆犚扩增引物示意表犇．１真菌狉犇犖犃犐犜犛常用扩增引物引物序列（５’→３’）位置ＩＴＳ１ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ１８ＳＩＴＳ２ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ５．８ＳＩＴＳ３ＧＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣ５．８ＳＩＴＳ４ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ２８ＳＩＴＳ５ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ１８ＳＩＴＳ１ＦＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ１８ＳＩＴＳ４ＢＣＡＧＧＡＧＡＣＴＴＧＴＡＣＡＣＧＧＴＣＣＡＧ２８Ｓ注：ＩＴＳ１、ＩＴＳ４和ＩＴＳ５可应用于大多数担子菌和子囊菌，但这些引物也能扩增一些植物ＩＴＳ区域；而ＩＴＳ１Ｆ和ＩＴＳ４Ｂ分别为真菌和担子菌的特异引物，能显著提高特异性。另外，ＩＴＳ１和ＩＴＳ２用于扩增１８ＳｒＤＮＡ和５．８ＳｒＤＮＡ之间的ＩＴＳ１区，引物ＩＴＳ３和ＩＴＳ４用于扩增５．８ＳｒＤＮＡ和２８ＳｒＤＮＡ之间的ＩＴＳ２区，而引物ＩＴＳ１或ＩＴＳ５和ＩＴＳ４组合被广泛采用用于扩增全部ＩＴＳ区和５．８ＳｒＤＮＡ。图犇．１犐犜犛区段犘犆犚扩增引物示意１０ 版权所有·禁止翻制、电子发售２０１１—２９６５／犜犛犖中华人民共和国出入境检验检疫行业标准植物病原真菌分子生物学检测规范ＳＮ／Ｔ２９６５—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张１字数２１千字２０１１年１１月第一版２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６４９定价１８．００元