溪黄草多酚的提取、纯化、鉴定与生物活性概述

　　溪黄草多酚的提取、纯化、鉴定与生物活性概述第一章绪论1.1溪黄草的研究进展溪黄草主根呈圆柱状，根上稀分枝或者不分枝，有很多纤维状根。其茎直立，茎上有条纹，全株布满白色的长毛和密腺毛。其叶密集，分上、中、下三部分，其中，中部叶和上部叶呈卵形或卵状长圆形，无柄，基部狭窄，然而下部叶则有柄，花期常枯萎。其头状花序呈圆锥状，狭窄而且短，在茎和枝端排列而成。头状花序包含半球状钟形的总苞，中央包含的两性花多达40个，并有一层污白色、糙毛状的在基部连合成环的冠毛。溪黄草属于长日照植物，对环境的适应性极强，只要有充足阳光和疏松土壤，排水良好，都能生长于海拔1500米以下的地区，常野生于溪边湿地、沟边、村边、田边及林下，是一年生草本，在夏、秋时节采收。近几十年来，溪黄草作为一味中草药逐渐被人们认识，主要含酚类、黄酮类、萜类、氨基酸等多种化学成分，具有清热、退黄、利胆、抗菌、保护肝脏、消炎及抗肿瘤等药理作用[4]。多酚为溪黄草的主要活性成分之一，它具有较强的抗氧化性，研究表明其抗氧化性能减缓癌症、冠状动脉硬化以及和年龄相关的退行性脑疾病，另外还具有抗炎、抗菌和舒张血管的作用[5]。因此，对溪黄草多酚的含量及其生物活性进行分析与研究，有利于对其进行进一步的开发和利用[4]。1.2多酚类物质的研究进展目前常用于提取多酚物质的方法一般有溶剂提取法、超声波辅助提取法、碱性稀醇或碱性水提取法、微波提取法、热水提取法和超临界CO2提取法。目前，最常用的多酚浸提方法是有机溶剂提取法，常用的溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、乙酸乙酯等[6-8]，这些有机溶剂对多酚都有着良好的溶解能力，且它们不与多酚物质发生化学反应、浸出杂质少、易于分离。它主要是根据多酚易溶于乙醇和乙酸乙酯等，不溶于苯、氯仿等有机溶剂的特性，利用多酚和溪黄草中其他组分的溶解度在不同溶剂中的差异进行分离[9]。董怡等[10]考察了蒸馏水，甲醇，60%乙醇，无水乙醇，乙酸乙酯，丁醇和氯仿对溪黄草根中可溶出组分的提取效果，7 种不同溶剂提取率按总酚高低排列为：60%乙醇提取物＞丁醇提取物＞甲醇提取物＞无水乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物＞氯仿提取物。温玲蓉等[11]对比了不同溶剂在减压提取法与常压回流提取法下得到的溪黄草提取物的总酚含量，提取物总酚含量的高低为：60%乙醇提取物＞丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提取物。可见，对于提取溪黄草的多酚，乙醇是备受亲睐的提取溶剂。第二章溪黄草多酚的超声提取2.1材料与设备溪黄草，广州万怡药房五山店。DPPH(2,2-Diphenyl-l-picrylhydrazyl)、福林酚试剂(Folin-Ciocalteu)，美国Sigma公司；没食子酸、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、无水碳酸钠均为分析纯。DFY-300型300克摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器，上海亚荣系列化仪器厂；TGL-16B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；LSHZ-300型低温水浴培养箱，常州诺基仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Spectrumlab752S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司。超声在20世纪50年代被应用于提取过程，以提高提取率[32]，也被广泛应用于食品工业中的乳化、结晶化和冷冻等过程[33]。研究表明，超声波在溶剂中的传播产生了一种空穴现象，空化气泡不断产生并被压缩，使得溶剂更容易渗透进入植物原材料中并通过破碎细胞壁作用促进释放细胞内物质[34]，从而显著减少提取时间、增加提取率，促进植物原材料活性成分的提取效率[35-38]。2.2实验方法10g溪黄草→粉碎→乙醇溶液超声提取→滤纸过滤→0.45μm滤膜抽滤→旋转蒸发除乙醇→加水补充溶液至50mL→加入50mL乙酸乙酯→室温振荡过夜→弃去水层→旋转蒸发至干→50%甲醇溶解定容至50mL→稀释后测定通过研究乙醇体积分数、料液比、提取温度、超声功率、提取时间对溪黄草多酚提取率的影响等单因素实验确定较优单因素条件后，设计4因素3水平正交实验[40]，见表2-1，优化溪黄草多酚提取的工艺条件。选取乙醇体积分数、超声温度、超声功率、提取时间四个因素，设计9组不同组合实验，从中筛选出最佳提取条件。根据Folin-Ciocalteu 法[41]对提取液的总酚含量进行测定。标准曲线的绘制：称取0.01g没食子酸于10mL容量瓶，用50%甲醇定容到刻度。分别取60μL、120μL、180μL、240μL、300μL、360μL于6个10mL容量瓶，以50%甲醇定容到刻度，配制成浓度为6、12、18、24、30、36μg/mL的标准液。分别取0.5mL不同浓度的标准液于试管中，加入0.2mLFolin-Ciocalteu试剂，混匀。室温放置10min后加入2mL质量浓度为7%的碳酸钠溶液，混匀，室温放置15min。在波长750nm处测量其吸光度。根据测量结果绘制标准曲线，得到回归方程(2-1)：Y＝0.003X，R2＝0.999(2-1)式(2-1)中，Y为待测样液的吸光度；X为样液总酚含量（μg/mL）。总酚含量测定：将提取液用50%甲醇稀释适当倍数，按上述方法测定各提取物中总酚含量，每组平行测量3次，根据标准曲线以及稀释倍数，计算多酚提取率。第三章大孔树脂对溪黄草多酚吸附分离....143.1材料与设备.....143.1.1材料与试剂.......143.1.2仪器与设备.......143.2实验方法........143.2.1溪黄草多酚粗提液的制备........153.2.2总酚含量的测定.....153.2.3大孔树脂的预处理.......153.2.4大孔树脂的筛选.....153.2.5静态吸附-解吸实验......163.2.6动态吸附-解吸实验......163.3结果与分析.....163.4结论....22第四章溪黄草多酚的抗氧化性研究.........234.1材料与设备.....234.1.1材料与试剂.......234.1.2仪器与设备.......234.2实验方法........234.3结果与分析.....264.4结论....37第五章溪黄草多酚提取液的抑菌性研究.....395.1材料与设备.....395.1.1材料与试剂.......39 5.1.2仪器与设备.......395.2实验方法........395.3结果与分析.....415.4结论....51第六章溪黄草多酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究随着生活水平的提高，近年来糖尿病（尤其是2型）患者数目迅速增加。α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病目的的口服降糖药物。α–葡萄糖苷酶可以水解营养物质中的α–1,4糖苷键，生成能被人体吸收的葡萄糖，因而在人体糖代谢过程中发挥重要作用。α–葡萄糖苷酶抑制剂竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。目前市场上α–葡萄糖苷酶抑制剂的种类较少，且合成步骤繁琐、毒性大、成本低，因此，从中草药中提取天然α–葡萄糖苷酶抑制剂的研究可为降糖药的开发提供理论基础，具有具有很好的研究意义[75]。KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DFY-300型300克摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；DLSB-5L/25型低温冷却液循环泵SHZ-D（Ⅲ），巩义市予华仪器有限公司；循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司；RE-52旋转蒸发器，上海亚荣系列化仪器厂；HHS-11-2型电热恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；SpectrumLab752S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司。结论本论文溪黄草为原料，对超声提取溪黄草多酚的工艺条件进行了优化，确定了超声提取的最佳工艺条件。采用大孔树脂吸附分离的方法，对所提取的溪黄草多酚进行了纯化，研究确定了树脂吸附和解吸的最佳条件。对溪黄草多酚的体外抗氧化性、抑菌性、α-葡萄糖苷酶抑制性等生物活性进行了测定。同时，对溪黄草多酚主要抗氧化活性组分进行了初步鉴定。本文所得主要结论如下：采用正交实验设计对溪黄草多酚的超声提取工艺条件进行优化。通过Folin-Ciocalteu 法对提取液的总酚进行测定，考查了乙醇浓度、料液比、提取温度、超声功率、提取时间等五个因素对溪黄草多酚超声提取率的影响。结果表明：溪黄草多酚超声提取的最佳工艺条件为：乙醇体积分数60%，料液比（g/mL）1:10，提取温度40℃，超声功率225in，在最佳工艺条件下多酚得率达(6.81±0.11)%。以溪黄草多酚为原料，通过静态吸附和解吸实验对10种大孔树脂进行筛选，确定AL-1为最优吸附树脂。通过静态与动态相结合的方法，确立AL-1树脂对溪黄草多酚的最佳吸附/解吸工艺条件。结果表明，溪黄草多酚提取液的最佳吸附条件为：上样总酚质量浓度为520μg/mL，上样液pH为4，吸附流速为0.8mL/min。最佳洗脱条件为：乙醇体积分数80%，洗脱流速0.5mL/min。