基于荧光纳米粒子的一些生物功能成像分析

　　基于荧光纳米粒子的一些生物功能成像分析1绪论1.1引言在过去的一个世纪，以电子信息、生物技术和新材料为支柱的一系列高新技术取得重大突破和飞速发展，极大地改变了世界的面貌和人类的生活。[1]人类生活需要或渴望的几乎每一样东西，包括漂亮的服饰、美味的食物、快捷的交通、方便的沟通途径等，在过去数十年时间里都得到了很大的满足。[2]在物质生活已经非常丰富的今天，科学研究的重点是人类认识自己、改变自己，全面提高身体素质和生活质量，因此人们对于生命科学研究的关注在21世纪达到了前所未有的高度。在生命科学研究中，生物影像信息往往是最重要、最直接的研究证据，有时甚至是唯一的证据。各种先进影像学方法和技术的出现和蓬勃发展，使得生物学家可以获得生命体实时、定量、原位、活体和高灵敏的生物学信息成为可能，奠定了现代生命科学研究快速发展的基础。四百多年前，光学显微镜的出现开启了人们进入微观世界的大门，帮助科学家发现了许多肉眼不可见的微小物种，并逐渐成为医生们诊断和治疗疾病的有力工具。在过去的一百多年，医学诊断技术发生了革命性的变化，各种新型的生物成像技术和方法层出不穷（图1.1)。19世纪末期，德国科学家agicResonanceImaging,简称MRI)技术并将其应用到活体成像，随后MRI技术曰趋成熟，现已成为医学领域常规的检测手段，广泛应用于帕金森氏症、多发性硬化症等脑部与脊推病变以及癌症的治疗和诊断。医学超声成像（Medicalultrasonography)是一种基于超声波的医学影像学诊断技术，从上世纪50年代至今，超声诊断技术经历了从静态成像到动态成像，从黑白成像到彩色图像、从二维图像到三维图像等一次又一次革命性的飞跃，已成为血管和介入成像等方面成像诊断的首选方法。除此之外，包括计算机放射成像（putedRadiography,简称CR)、数字放射成像（DigitalRadiography,简称DR)、正电子发射式计算机断层成像（PositronEmissionTomography,简称PET)、单光子发射式计算机断层成像（SinglePhotonEmissionTomography,简称SPET)等医疗影像技术不断涌现，各种生物成像技术手段相互结合、优势互补，组成了生物学研究以及临床医疗诊断的重要基石。 光学是研究光与物质相互作用的一门历史悠久的学科，随着近代科学技术的发展特别是量子论的提出以后，光学研究进入了薪新的时期，逐渐成为现代物理学和现代科学技术前沿的重要组成部分。特别是20世纪60年代激光器的出现为光学研究提供了理想的高强度光源，极大的拓展了光学技术在生命科学研究领域的应用，形成了一个充满活力的前沿.性研究领域生物光子学。生物光子学研究一方面能够将先进的光学技术应用到生物医学应用，为生命科学的基础研究提供手段和解决方案，另一方面又能够将生命科学领域的最新发现应用到光学设计中，利用先进的生物材料制作新颖的光学介质，已成为国际光学界和生物医学界广泛关注的研究热点。近年来，随着激光技术、光谱技术、显微成像技术等光子学研究的发展，光子学技术在生物医学领域的许多应用研究，如光学相干层析成像技术在生物活检中的应用、利用光动力效应完成的疾病诊断和治疗、利用激光扫描共聚焦显微系统与焚光标记技术相结合观察细胞结构等，都取得了很多可喜的研究成果。以焚光成像技术为例，人们利用焚光蛋白标记技术与双光子荧光成像、活体焚光成像相结合，能够看到生物活体内特定蛋白的表达，原位、动态跟踪细胞内部的分子事件，基于焚光蛋白标记的焚光成像技术为细胞生物学和神经生物学的研究带来了革命性的变化。2基于荧光纳米粒子的细胞成像研究2.1引言 细胞是构成除病毒以外所有生命体的基本单元，对细胞在显微、亚显微和分子水平等多个层次的研究构成了生命科学的四大基础学科之一细胞生物学。典型动物细胞的结构单元有细胞膜、细胞质、细胞液、细胞器、细胞骨架和细胞核。[5'105]细胞生物学的研究包括细胞形态观察、细胞组分和结构分析以及细胞培养等多个方面。光学显微成像技术在细胞学研究中发挥过重要的作用，至今细胞生物学研究仍然离不开光学显微技术。荧光显微镜是在光学显微水平对特异性蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的技术手段。特别是近年来激光扫描共聚焦显微镜的广泛应用和细胞荧光标记方法的发展,人们可以利用荧光成像方法研究细胞骨架、细胞结构和组织行为、细胞内离子活动、测量细胞pH值、监测细胞对药物的反应、确定核酸分布等许多生物学问题。纳米颗粒是指至少有一维的尺寸处于lnm至100iim量级的超微小材料，随着纳米技术和纳米合成工艺的飞速发展，纳米颗粒在生物医学领域的应用越来越得到研究者的重视，一方面是利用纳米颗粒对特定的细胞、组织器官进行标记后作为造影剂实现生物成像的应用，另一方面是利用纳米颗粒作为药物载体实现生物治疗的应用。纳米粒子与癌细胞的相互作用研究，比如纳米粒子进入癌细胞的方式、纳米粒子在癌细胞内部的分布情况、载药纳米粒子对癌细胞的杀伤作用，对于纳来粒子的活体应用有非常重要的指导意义。本章的研究内容包括两个部分。氧化石墨烯是近年来纳米材料界的新星，在药物运输、生物成像、生物治疗等方面表现出的许多独特优势，吸引了众多生物医学研究者的关注。我们釆用化学方法合成了氧化石墨烯纳来粒子，并对这种材料的单光子激发、双光子激发和三光子激发的荧光特性进行了系统的表征。通过在氧化石墨烯表面修饰聚乙二醇分子，有效的提高了这种材料的生物兼容性，我们利用双光子荧光荧光成像技术研究了氧化石墨烯纳米粒子对癌细胞的标记情况，利用商用的细胞器荧光标记物和多光谱荧光成像技术，研究了氧化石墨烯纳米粒子在亚细胞层面的分散情况。3包覆有机荧光染料的纳米粒子..........593.1引言..........593.2包覆近红外染料的二氧化硅纳米小球..........623.2.1研究意义..........623.2.2实验试剂和仪器..........633.2.3纳米小球的..........633.2.4纳米小球用于活体肿瘤诊断..........663.3具有聚集增强荧光特性的染料..........683.3.1研究意义..........683.3.2实验试剂与仪器..........693.3.3包覆St的聚合物纳米胶束的制备及表征..........693.3.4纳米胶束用于活体前哨淋..........763.3.5多肽修饰的纳米胶束用于..........783.4本章小结和展望..........814基于超稳定包覆的近红外PbS量子点..........834.1引言..........834.2近红外PbS量子点的绿色合成与表征..........844.3PbS量子点的表面包覆与表征..........864.4基于PbS硫化铅量子点的活体..........934.5本章小结..........96结论 本论文的研究重点是荧光纳米粒子和荧光成像技术的生物医学应用，设计制备了多种新颖的荧光纳米材料，利用激光共聚焦显微镜、活体荧光成像系统、双光子荧光显微镜等光学工具，完成了包括离体细胞荧光成像、宏观活体荧光成像和显微活体荧光成像等生物医学成像应用研究。我们利用化学方法合成了氧化石墨烯纳米粒子（GO)，对GO的荧光特性进行了较为系统的研究，报道了GO在可见光波段的荧光发射和荧光寿命等光学参数。为了满足生物荧光成像的需求，我们在GO材料表面连接了聚乙二醇（PEG)分子，有效的提高了GO纳来材料的生物兼容性，我们利用GO-PEG纳米材料作为荧光成像探针.研究了这种材料在离体HeLa细胞及亚细胞层面的分布情况，为GO纳米材料更深入的生物医学应用提供了参考。我们制备了包覆有光动力治疗药物PpIX分子的多孔二氧化硅纳米小球，对这种荧光纳米粒子的荧光特性进行了表征，并且利用这种纳米粒子对癌细胞进行标记，采用飞秒脉冲激光激发的方式，实现了对离体癌细胞的双光子荧光成像和双光子激发的光动力治疗。第三章的主要内容是有机荧光染料的宏观活体功能成像应用。我们利用有机修饰的多孔二氧化硅纳米小球包覆一种传统的近红外荧光染料(IR-820)制备了IR-820ORMOSIL纳来探针，通过PEG修饰的方法进一步提高了纳米颗粒的生物兼容性，利用荧光粒子实现了对活体肿瘤非特异性的荧光成像诊断，通过活体荧光成像方法的长期观察，证明了这种荧光纳米材料用作长期成像荧光探针的能力。我们合成了一种具有聚集增强荧光荧光特性的有机染料St，与传统的有机荧光染料在聚集状态是会产生荧光猝灭的性质不同，St独特的分子结构使得它在聚集状态时比在单分散状态具有更强的荧光发射。我们利用DSPE-mPEG聚合物分子包覆St染料分子，制备了具有良好生物兼容性的纳米胶束，我们利用纳米胶束作为荧光探针实现了活体小鼠的前哨淋巴结荧光成像定位和活体小鼠肿瘤非特异性标记的荧光成像诊断。我们在纳米胶束表面连接能够跟肿瘤特异性结合的多肽后.利用多肽修饰的纳来胶束作为荧光探针实现了小鼠活体肿瘤靶向的标记和荧光成像诊断。