snt 2773-2011 国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法 属通用引物基因悬浮芯片法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７３—２０１１国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法属通用引物基因悬浮芯片法犚犪狆犻犱狊犻犿狌犾狋犪狀犲狅狌狊狊犮狉犲犲狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犳犻狏犲犫犻狅狋犲狉狉狅狉犻狊犿犫犪犮狋犲狉犻犪犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋—犌犲狀犲狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔狑犻狋犺狌狀犻狏犲狉狊犪犾狆狉犻犿犲狉狊狅狀犵犲狀狌狊犾犲狏犲犾２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 犛犖／犜２７７３—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。本标准主要起草人：杨宇、张晓龙、孙肖红、王惠兰、张乐、王静、杨永莉。Ⅰ 犛犖／犜２７７３—２０１１国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法属通用引物基因悬浮芯片法１范围本标准规定了用于国境口岸快速筛查炭疽芽孢杆菌（犅犪犮犻犾犾狌狊犪狀狋犺狉犪犮犻狊，犅．犪）、鼠疫耶尔森菌（犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊，犢．狆）、布鲁菌（犅狉狌犮犲犾犾犪ｓｐｐ．，犅狉狌）、土拉弗朗西斯菌（犉狉犪狀犮犻狊犲犾犾犪狋狌犾犪狉犲狀狊犻狊，犉．狋）和类鼻疽伯克霍尔德菌（犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉犻犪狆狊犲狌犱狅犿犪犾犾犲犻，犅．狆）五种重要生物恐怖病原菌的基因悬浮芯片筛查方法。本标准适用于国境口岸发现的可疑物品或环境样品中五种重要生物恐怖病原菌的筛查。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１５５２国境口岸生物因子恐怖事件监测规程ＷＳ２３３微生物和生物医学实验室生物安全通用准则３术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１生物恐怖病原菌犫犻狅狋犲狉狉狅狉犻狊犿犫犪犮狋犲狉犻犪可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低、毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。３．２基因悬浮芯片犵犲狀犲狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸进行大规模测定的一种生物芯片技术。４生物安全防护要求４．１排查前做好个人防护。防护方法和标准见ＳＮ／Ｔ１５５２。４．２实验室应遵循ＧＢ１９４８９和ＷＳ２３３对生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ２）实验室的生物安全要求。４．３使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９的要求，对废弃物应进行无害化处理。１ 犛犖／犜２７７３—２０１１５主要设备与试剂５．１主要设备悬浮芯片系统、荧光显微镜、水平电泳仪、凝胶成像系统、离心机、ＰＣＲ仪、生物安全柜、移液器、核酸蛋白检测仪、真空泵、涡流振荡仪。５．２主要试剂ＬＢ液体培养基（见Ａ．１）、ＬＢ固体培养基（见Ａ．２）、ＤＳＭ芽孢培养基（见Ａ．３）、ＰＣＲ反应预混液（见Ａ．４）、氯化四甲铵（ＴＭＡＣ）、１．５×ＴＭＡＣ杂交液（见Ａ．５）、１×ＴＭＡＣ杂交液（见Ａ．６）、羧基化编码微球、２［犖吗啉］乙磺酸（ＭＥＳ）、１（３二甲氨基丙基）３乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）、ＳＤＳ、犖十二烷基肌氨酸钠、链亲和素藻红蛋白（ＳＡＰＥ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、６ｍｏｌ／Ｌ碘化钠（ＮａＩ）、玻璃粉、７０％乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酚、三氯甲烷、吐温２０。６检测方法６．１样品采集依ＳＮ／Ｔ１５５２执行。６．２细菌犇犖犃提取６．２．１取０．１ｇ样本加５００μＬＰＢＳ（见Ａ．８），１０００犵离心３ｍｉｎ；取上清液，１２０００犵离心１ｍｉｎ，弃去上清液。６．２．２沉淀用ＰＢＳ洗涤３次后，向每管样本中加入６ｍｏｌ／Ｌ碘化钠１００μＬ，振荡混匀３０ｓ，煮沸３０ｍｉｎ，间或混匀。６．２．３将上述煮沸处理的样本于１００００犵离心５ｍｉｎ，将上清转至另一含５００μＬ２０％玻璃粉悬液的１．５ｍＬ离心（ＥＰ）管中。充分混匀，置室温１０ｍｉｎ，期间每２ｍｉｎ混匀１次，使暴露的ＤＮＡ吸附于玻璃粉上。６．２．４８０００犵离心２ｍｉｎ，小心倾去上清液。６．２．５向玻璃粉ＤＮＡ沉淀中加入７５％乙醇１ｍＬ，充分混匀，洗涤玻璃粉，８０００犵离心２ｍｉｎ，小心倾去上清液。６．２．６重复洗涤一次后，８０００犵离心２ｍｉｎ并用吸头尽量吸干漂洗液，然后放置于３７℃恒温箱使彻底干燥。６．２．７向上述晾干的玻璃粉ＤＮＡ沉淀中加２０μＬＴＥ（见Ａ．７），充分混匀，６５℃加热１５ｍｉｎ，期间每５ｍｉｎ混匀一次。６．２．８８０００犵离心２ｍｉｎ，回收上清液。用紫外分光光度法测定ＤＮＡ吸光度值，确定ＤＮＡ的浓度，备用。注：本标准推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同的方法。６．３犘犆犚扩增扩增引物和探针设计方法见Ｂ．１，扩增引物序列见表Ｂ．２，反应体系为５０μＬ，其中ｔａｋａｒａｐｒｅｍｉｘ（见Ａ．４）２５，上游引物（浓度为１０／Ｌ）２，下游引物（浓度为１０／Ｌ）２，样品模板ＤＮＡμＬμｍｏｌμＬμｍｏｌμＬ２μＬ，水１９μＬ。反应条件为预变性９４℃１０ｍｉｎ，３５个循环（９４℃３０ｓ，５８℃３０ｓ，７２℃３０ｓ），延伸２ 犛犖／犜２７７３—２０１１７２℃７ｍｉｎ。同时应设置本底对照以水代替样品模板ＤＮＡ；阴性对照以非目标菌的ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应的模板ＤＮＡ；阳性对照以含有检测序列的ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应模板ＤＮＡ。注：本标准以ｔａｋａｒａ公司ＰＣＲ反应体系为例，也可以使用等效的ＰＣＲ试剂。６．４探针与羧化微球的偶联６．４．１探针（序列见表Ｂ．１）的５’端连上２０个ｐｏｌｙ（Ｔ），氨基化修饰，将氨基化修饰的寡核苷酸探针溶解于蒸馏水中使其终浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ。６．４．２将１ｍＬ包装中的羧基化编码微球振荡３０ｓ，超声３０ｓ，至将微球打散。６．４．３取１００μＬ小球至１．５ｍＬＥＰ管，１４０００犵４ｍｉｎ，小心吸出上清液。６．４．４微球重悬于５０μＬｐＨ４．５的０．１ｍｏｌ／ＬＭＥＳ中，振荡２０ｓ，超声２０ｓ。６．４．５用蒸馏水将１０ｍｍｏｌ／Ｌ的寡核苷酸探针１０倍稀释，将２μＬ１０倍稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀。６．４．６向每个１．５ｍＬＥＰ管中加入２．５μＬ新鲜配制的１０ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＣ溶液，振荡混匀。置涡流振荡器上，室温避光孵育３０ｍｉｎ。６．４．７再加入２．５μＬ新鲜配制的ＥＤＣ溶液，振荡混匀。再次置涡流振荡器上，室温避光孵育３０ｍｉｎ。６．４．８反应结束后，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸弃上清液。６．４．９向各个１．５ｍＬＥＰ管中加入１ｍＬ０．０２％吐温２０，振荡混匀。离心１４０００犵４ｍｉｎ，小心吸弃上清液。６．４．１０向各个１．５ｍＬＥＰ管中加入１ｍＬ０．１％ＳＤＳ，振荡混匀，离心１４０００犵４ｍｉｎ，吸弃上清液。向１．５ｍＬＥＰ管中加入１００μＬｐＨ８．０ＴＥ，振荡１０ｓ，超声１０ｓ，使微球重悬。６．４．１１微球的计数：用血球计数板计数。吸取适量微球，稀释后，用血球计数板（０．１０ｍｍ；２）在普通光学显微镜下计数。计算公式见式（１），记录微球浓度。１／４００ｍｍ微球数量＝每个大格数×１０４×稀释倍数×体积（ｍＬ）………………（１）６．４．１２用血球计数板计数后微球原液４℃保存备用。６．５杂交６．５．１偶联探针的微球各约３５００个～５０００个混于３３μＬ１．５×ＴＭＡＣ杂交液中，置于０．２μＬ离心管中。６．５．２向各管中分别加５μＬ～１７μＬ上述６．３中ＰＣＲ扩增产物使其终体积为５０μＬ，吹打混匀。６．５．３同时一管中加入５μＬ～１７μＬＴＥ使其终体积为５０μＬ，吹打混匀，检测结果作为检测空白对照的荧光值。６．５．４９５℃变性１０ｍｉｎ。５５℃温度下杂交３０ｍｉｎ。转移至滤板抽滤去掉未结合的ＰＣＲ产物。６．５．５向各孔加７５μＬ４ｎｇ／μＬＳＡＰＥ的１×ＴＭＡＣ液，室温避光孵育１０ｍｉｎ，抽滤去掉未结合的ＳＡＰＥ。６．５．６向各孔加入７５μＬ１×ＴＭＡＣ溶液，振荡使微球重悬。６．６测定荧光值把滤板放入悬浮芯片检测仪器中进行荧光值的测定。６．７结果判定６．７．１质控反应结果应同时符合以下四个条件，否则实验结果无效：３ 犛犖／犜２７７３—２０１１ａ）本底对照荧光值应接近于空白对照的荧光值；ｂ）联结探针微球的质控的检测荧光值应远大于空白对照荧光值（１０倍以上）；ｃ）阴性质控为ＰＣＲ扩增时的阴性对照，检测荧光值应接近于本底荧光值；ｄ）阳性质控为ＰＣＲ扩增时的阳性对照，检测荧光值应远远大于阴性质控荧光值。６．７．２结果判定６．７．２．１待检样本荧光值介于本底对照荧光值２倍～３倍时，重复检测一次。６．７．２．２待检样本荧光值大于本底对照荧光值３倍以上时即判为阳性。６．７．２．３待检样本荧光值小于２倍本底对照荧光值时判为阴性。７注意事项７．１检测过程中所有接触或可能接触到可疑污染物的物品（如：棉签、试纸条、手套、吸管等）应彻底消毒处理。７．２对检测后阳性样品应进行封存或现场处置，并采样送相关实验室进一步检测、鉴定。样品的送检按照ＳＮ／Ｔ１５５２执行。４ 犛犖／犜２７７３—２０１１附录犃（规范性附录）培养基和溶液配制犃．１犔犅液体培养基胰蛋白胨１０ｇ，酵母提取物５ｇ，氯化钠１０ｇ，溶于去离子水１０００ｍＬ。制备方法为：将上述成分溶解于水中，调ｐＨ至７．２～７．４，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ后冷藏备用。犃．２犔犅固体培养基液体培养基中每升加１５ｇ琼脂粉，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。犃．３犇犛犕芽孢培养基胰蛋白胨６ｇ，酵母提取物３ｇ，氯化钠１０ｇ，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）０．２５ｇ，硝酸钙［Ｃａ（ＮＯ３）２］０．２３ｇ，氯化锰（ＭｎＣｌ２）０．１９７ｇ，硫酸铁（ＦｅＳＯ４）０．０００２ｇ，琼脂１５ｇ，溶于１０００ｍＬ水中，１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ。犜犕）犃．４犘犆犚反应预混液（犘狉犲犿犻×犜犪狇２＋。ＴａＫａＲａＥｘ犜犪狇１．２５Ｕ／２５μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ各０．４ｍｍｏｌ／Ｌ，ＰＣＲ缓冲液３ｍｍｏｌ／ＬＭｇ犃．５１．５×犜犕犃犆杂交液４．５ｍｏｌ／ＬＴＭＡＣ、０．１５％犖十二烷基肌氨酸钠、７５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、６ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０。犃．６１×犜犕犃犆杂交液３ｍｏｌ／ＬＴＭＡＣ、０．１％犖十二烷基肌氨酸钠、５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０、４ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０。犃．７犜犈缓冲液１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＣｌｐＨ７．５，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０。犃．８犘犅犛（狆犎７．４）氯化钠１３７ｍｍｏｌ／Ｌ；氯化钾２．７ｍｍｏｌ／Ｌ；磷酸氢二钠１０ｍｍｏｌ／Ｌ；磷酸二氢钾２ｍｍｏｌ／Ｌ。用８００ｍＬ蒸馏水溶解８ｇ氯化钠，０．２ｇ氯化钾，１．４４ｇ磷酸氢二钠和０．２４ｇ磷酸二氢钾。用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．４，加水至１Ｌ。分装后在１２１℃高压灭菌２０ｍｉｎ，或过滤除菌，保存于室温。５ 犛犖／犜２７７３—２０１１附录犅（规范性附录）引物及探针根据细菌１６ＳｒＲＮＡ保守区设计通用引物，可变区设计种属分类的探针。见表Ｂ．１引物及探针的序列。表犅．１引物及探针的序列名称序列（５’３’）上游引物ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ下游引物ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣ（Ｔ／Ｇ）ＧＣＴＧ炭疽芽孢杆菌探针ＡＡＧＴＧＣＴＡＧＴＴＧＡＡＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＣ鼠疫耶尔森菌探针ＡＡＧＧＧＧＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＣＡＡ布鲁菌探针ＧＧＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＡＣＣＣＧＡ土拉弗朗西斯菌探针ＧＣＣＴＣＡＡＧＧＴＴＡＡＴＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡ类鼻疽伯克霍尔德菌探针ＡＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＣＧＧＡＧＴ注：其中下游引物５’端生物素修饰。６ １１０—２３７７２／犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法属通用引物基因悬浮芯片法ＳＮ／Ｔ２７７３—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６印张０．７５字数１３千字２０１１年６月第一版２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２０５５定价１６．００元