遗传标记及其在生物技术中的应用论文

　　遗传标记及其在生物技术中的应用论文.freelarkers,particularlymolecularmarkersareincreasinglyentandclassificationofgeicmarkersarker;biotechnology;application遗传和变异作为生物的重要特征之一,决定着生物的生存和进化。在对物种的遗传和变异进行研究的过程中,遗传标记(GeicMarker)是指那些表现变异性,且遵循简单遗传方式的性状或物质,是非常重要的任何遗传分析都不可缺少的工具,其作为遗传物质特殊的易于识别的表现形式,.freel通过研究红色面包酶的生化突变型,提出了“一个基因一个酶”的假说,创立了生化遗传学,这也是第1个将生化标记用于遗传多样性分析的实例。生化标记在50年代末60年代初被大量应用。同工酶标记的兴起,使遗传标记的识别突破了活体形式,但仍然没有突破表达基因的范围。1953年,ullis等发明了聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR),使直接扩增DNA的多态性成为可能,随着PCR的迅速发展,又产生了各种新型的分子标记,从而使遗传标记进入了一个日新月异的发展阶段2。2遗传标记的分类2.1形态学标记形态学标记是最原始的生物性状遗传标记,是指肉眼可见的生物特定的外部特征特性。经过遗传学家的努力,已建立了许多形态标记的遗传图谱,但需要寻找或人工诱变突变体。这就使形态标记构建时间变长,并且这种标记易受环境影响,突变对有利形态标记会产生不利影响3。2.2细胞学标记随着遗传学和细胞学的发展,人们将遗传现象与染色体结合起来。染色体数目及结构的变化常常引起表型的变化,因此染色体的变化可以作为一种遗传标记。2.3生物化学标记1952年Neilands首次结晶出2种类型的乳酸脱氢酶,并证实它们为同工酶,即它们是来源相同、催化反应性质相同而分子结构有差异的酶蛋白分子。不同的同工酶所带的电荷不同,可通过电泳分离,并经与底物反应或染色,检测它们的存在与否和分子质量的大小,因而可作为遗传标记。但在植物的群体研究中,仅有10～20种同工酶表现出位点的多态性4。2.4免疫学标记 免疫学标记是以动物个体的免疫学特征为遗传标记。早在1900年,Ehrlich和Morgenroth指出山羊红细胞表面存在抗原,并证明这些抗原具有个体差异。20世纪80年代初,人们转向白细胞抗原的研究,即主要组织相容性复合体(MHC),根据个体淋巴细胞抗原特异性,研究品种间、个体间的性状差异,并应用于遗传育种5。2.5分子标记生物体之间的差异本质上是DNA水平上的差异。以DNA多态性与性状间的紧密连锁关系为基础遗传标记,是性状基因的真实反映,能在不同发育阶段对不同组织DNA进行检测分析。分子标记具有以下优点:直接以DNA的形式出现,不受环境和其他因素的影响;多态性几乎遍及整个基因组;表现为中性标记;不影响目标性状的表达,与不良性状无必然连锁;有许多分子标记为共显性;部分分子标记可分析微量DNA样品6。3遗传标记检测技术的分类DNA分子标记检测技术大致可分为3类:第1类是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术;第2类是以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术;第3类是以DNA测序为核心的分子标记技术。3.1以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记3.1.1限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)。RFLP是利用放射性同位素标记(如32P)或非放射性标记(如地高辛标记)探针,与转移于支持膜上的总DNA(经过限制性酶消化)杂交,通过显示限制性酶切片段的大小,来检测不同遗传位点变异(多态性)的一种技术。3.1.2DNA指纹(DNAfingerprinting)标记。DNA指纹标记是以重复序列为探针进行分子杂交,由于不同基因型中的重复次数不同而产生多态性的分子标记。目前常用的DNA指纹标记主要有微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)标记和小卫星DNA(MinisatelliteDNA)标记。3.2以电泳技术和PCR技术为核心的分子标记PCR技术问世不久,便以简便、快速和高效等特点迅速成为分子生物学研究的有力工具,尤其是在DNA分子标记技术的发展上更是发挥了巨大作用。根据所用引物的特点,这类分子标记可概括为3种类型:3.2.1单引物PCR标记。是以一个寡核苷酸序列为引物,对基因组DNA进行PCR扩增来鉴别多态性DNA的过程。其代表性技术是RAPD。随机扩增多态性DNA(RandomamplifiedpolymorphismDNA,RAPD)是以寡核苷酸序列(通常为10个核苷酸)为引物,对基因组DNA随机扩增,从而得到多态性图谱作为遗传标记的方法。3.2.23′端具有选择性的双引物PCR标记。该类最典型的技术为扩增片段长度多态性(Amplifiedfragmentlength poly-morphisms,AFLP)。其基本原理是利用一个在基因组DNA中酶切位点少的内切酶和一个内切酶位点多的内切酶组合,对基因组DNA进行完全消化,再使用双链人工接头与酶切片段的粘性末端连接作为反应模板,先进行预扩增,之后再进行选择性PCR扩增,最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳展现其多态性7。3.2.3基于特异双引物的PCR标记。切割的扩增产物多态性序列(Cleavedamplifiedpolymorphismsequence,CAPS)标记是指PCR产物经限制性内切酶消化后所表现出的DNA片段长度的变异,表现为共显性遗传。特异引物序列来自基因数据库、基因组或cDNA克隆以及已克隆的RAPD条带等。3.3以DNA测序技术为核心的分子标记随着人类基因组研究计划的深入和DNA自动测序技术的不断改进,以DNA序列为核心的分子标记也孕育而生,其中最具代表性的是表达序列标定标记(Expressedsequencetags,EST)。EST标记主要是在cDNA文库中随机挑选克隆,并进行单向测序(Singlepasssequencing)生成的250～400bp的核苷酸序列片段。由于ETS来源于cDNA克隆,因此部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式2。4遗传标记的应用4.1遗传图谱的构建一般步骤包括:选择用于作图的遗传标记;根据遗传材料的多态性确定作图群体的亲本和组合;培育具有大量遗传标记处于分离状态的群体或衍生系;作图群体中不同个体和品系标记基因型确定;标记之间的连锁群的构建。4.1.1经典遗传图谱。经典遗传图谱构建理论基础是染色体的交换和重组。用重组率来揭示基因间的遗传图距,其单位用厘摩(centiMorgan,cM)表示,1个cM的大小大致符合1%的重组率8。4.1.2分子遗传图谱。在高等植物中,RFLP最初用于已被经典遗传学比较详细研究的一些作物的遗传图谱的构建,如玉米和番茄9-10。对样品提取所得DNA采用多种限制性内切酶处理,对所有探针在亲本间的多态性进行检测。AFLP能够揭示大量的多态性位点,可以弥补传统的RFLP标记多态性低的缺点,特别是对于没有很多DNA序列的物种来说,利用其近源种的DNA序列(包括EST)而发展的其他分子标记结合AFLP标记,构建高密度的遗传连锁图是非常有效的一种策略11。4.2基因定位 基因定位是遗传学和育种学研究中的重要内容,也是基因克隆的基础工作。目的基因的定位一般要经过初步定位和精细定位2个过程。目的基因的初步定位是利用分子标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基因定位在染色体的一个区域内。在初步定位的基础上,利用高密度的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密度分子标记连锁分析,以便精细定位目的基因。5小结动物遗传标记是随着人类对基因由现象到本质的认识而由形态标记向分子标记逐步发展的过程,技术手段由复杂、高成本向简便、低成本转变。各个阶段的遗传标记方法,各有其优缺点和使用范围。随着分子生物学技术的深入和完善,遗传标记手段必将逐步改进,为遗传学研究和遗传育种起到巨大的推动作用。6