微生物卤代酶研究进展论文

　　微生物卤代酶研究进展论文【摘要】迄今为止，已经发现了近3800种卤化物，其中很多是重要的抗生素。对这些抗生素的卤化机制的研究发现了四类负责生物卤化的卤代酶。本文综述了这四类卤代酶的特点，并介绍利用卤代酶基因为探针发现海洋放线菌中新抗生素生物合成基因簇的研究进展。【关键词】卤代酶；抗生素；生物合成基因；海洋微生物ABSTRACTNearly3,800halogenatedpoundshavebeenidentifiedsofarandmanyofportantantibiotics.Themicrobialhalogenasesinvolvedinantibioticbiosynthesiscouldbeclassifiedintofourcategories.Thisreviemarineactinomycetesbyusingthehalogenasegeneasprobe.KEYarinemicrobe三十年前大约只有200多种天然有机卤化物被发现［1］。当时人们认为这些卤化物大多为人工合成化合物，自然界生成的卤化物很少。随着分离纯化技术的改进及人们对新药研究热情的不断增加，迄今为止已经从各种生物(包括细菌、真菌、各类动植物)中分离出3800多种卤化物，其中大部分由海洋生物产生［2］。约95%的卤化物为氯化和溴化物，氟化和碘化物很少.freelphenicol)、7氯四环素(7chlorotetracycline)、万古霉素(vanycin)等都是重要的抗生素(Fig.1)。虽然卤素原子的类型、数量以及位置对化合物生物活性的影响没有特定的规律［4］，但某些卤化物与相应的非卤化物相比，卤化可以增强其生物活性。如，2氯硝吡咯菌素的抗真菌活性只有硝吡咯菌素(含有2个氯原子)的10%［5］；与其含氯衍生物相比，不含氯的rebeccamycin没有抗菌活性［6］。虽然到目前为止对有卤素原子参与的有机化合物的合成机制还有待深入研究，但至少已经发现了四类负责生物卤化的卤代酶。1卤代酶的分类1.1卤过氧化物酶(haloperoxidases)(1)含有血红素的卤过氧化物酶(hemecontaininghaloperoxidases)第一个参与抗生素生物合成的卤代酶是从产生化合物caldariomycin的真菌Caldariomycesfumago中分离到的。这个酶需要过氧化氢及卤素离子(氯、溴或碘，不包括氟)来催化卤代反应，因此被称为卤过氧化物酶［7］。早期的研究主要是利用36Cl来检测卤过氧化物酶的活性，后来Hager等基于Fig.1Chemicalstructureofhalogenatedpoundscaldariomycin生物合成的中间体单氯双甲酮(mono chlorodimedone，MCD)建立了一种光谱分析方法，这种方法后来发展成为检测卤代酶活性的标准方法。由于卤过氧化物酶是胞外酶而caldariomycin是在真菌细胞内合成的，尽管在体外卤过氧化物酶能催化其中间体的氯化，却一直无法证明卤过氧化物酶确实参与了caldariomycin的生物合成［4］。进一步的研究表明该酶具有催化P450型反应的催化活性，在H2O2和卤离子存在时能产生自由酸作为卤化剂，从而解释了这种酶为什么缺乏底物特异性和区域选择性［8］。(2)含有钒的卤过氧化物酶(vanadiumcontaininghaloperoxidases)人们从藻类、苔藓和真菌中发现了另一种卤过氧化物酶——含有钒的卤过氧化物酶，这种酶的活性依赖于钒与其活性位点结合。与含有血红素的卤过氧化物酶相似，这种酶在H2O2存在时氧化卤素原子(氯、溴或碘，不包括氟)产生自由酸作为卤化剂，因此也缺乏底物特异性和区域选择性［9］。(3)过氧水解酶(perhydrolases)利用MCD光谱分析法，vanPée等［10］从产卤化物的假单胞菌和链霉菌中分离到了一种具有卤化活性的酶。这种酶既不包含血红素也不需要钒，由于其催化卤代反应的过程需要H2O2，因此这类酶曾经归为卤过氧化物酶。进一步的结构研究表明，这类酶属于α/β水解酶，生化研究表明其活性依赖于短链羧酸［11］。与含有血红素及钒的卤过氧化物酶相似，这类酶同样缺乏底物特异性和区域选择性。1.2FADH2依赖型卤代酶(FADH2dependenthalogenases)第一个FADH2依赖型卤代酶是Dairi等［12］在研究7氯四环素的生物合成途径过程中发现的。他们在用源于7氯四环素合成基因簇的一个2.6kb的基因对只产生不含氯的四环素突变株进行功能互补后发现这个基因编码一个卤代酶，该酶的核苷酸序列及氨基酸序列与已知卤过氧化物酶、过氧化物酶或过氧水解酶都没有相似性。Hammer等［13］在研究荧光假单胞菌BL915中硝吡咯菌素(pyrrolnitrin)的生物合成基因簇时(Fig.2)，发现此基因簇由4个基因prnABCD组成，它们催化了色氨酸到硝吡咯菌素的转化。在荧光假单胞菌突变体中prnA和prnC表达时发现其产物在有NADH、O2和氯离子存在的条件下分别催化了色氨酸和单去氯氨基硝吡咯菌素的氯化。将PrnA纯化后发现其活性依赖于FADH2，而且NADH对于一非特异性的黄素还原酶是必需的。进一步的研究表明这种黄素还原酶能从FAD和NADH产生卤代酶所必需的FADH2，因此这种新型卤代酶被称为FADH2依赖型的卤代酶［14］这类酶具有底物特异性和很强的区域选择性。对这类卤代酶基因进行研究发现其包括两个保守区，一个是FAD结合位点(GGGXXG)，另一个含有两个色氨酸残基(Gicrobialbiosynthesisofhalometabolites［J］.ArchMicrobiol,2001,175(4):250～258. ［5］HamillR,ElanderR,MabeJ,.freeloftryptophansbyPseudomonasaureofaciensV.Conversionoftryptophantopyrrolnitrin［J］.AntimicrobAgentsChemother,1967,7:388～396.［6］PereiraER,BelinL,SancelmeM,etal.Structureactivityrelationshipsinaseriesofsubstitutedindolocarbazoles:topoisomeraseIandproteinkinaseCinhibitionandantitumoralandantimicrobialproperties［J］.JMedChem,1996,39(22):4471～4477.［7］HagerLP,MorrisDR,Bro,1966,241(8):1769～1777.［8］SundaramoorthyM,TernerJ,PoulosTL.Stereochemistryofthechloroperoxidaseactivesite:crystallographicandmolecularmodelingstudies［J］.ChemBiol,1998,5(9):461～473.［9］Hemrikaicrobiol,1996,50:375～399.［11］PicardM,GrossJ,LubbertE,etal.Metalfreebacterialhaloperoxidasesasunusualhydrolases:activationofH2O2bytheformationofperaceticacid［J］.AngeIntEdEngl,1997,36(11):1196～1199.［12］DairiT,NakanoT,AisakaK,etal.Cloningandnucleotidesequenceofthegeneresponsibleforchlorinationoftetracycline［J］.BiosciBiotechnolBiochem,1995,59(6):1099～1106.［13］HammerPE,HillDS,LamST,etal.FourgenesfromPseudomonasfluorescensthatencodethebiosynthesisofpyrrolnitrin［J］.ApplEnvironMicrobiol,1997,63(6):2147～2154.［14］KellerS,urphyCD.Recentdevelopmentsinenzymaticchlorination［J］.NatProdRep,2006,23(2):147～152.［16］DongC,FlecksS,UnversuchtS,etal.Tryptophan7halogenase(PrnA)structuresuggestsamechanismforregioselectivechlorination［J］.Science,2005,309(5744):2216～2219.［17］ChangZ,FlattP,Geridebiosyntheticgenecluster:anovelmarinecyanobacterialsystemofmixedpolyketidesynthase(PKS)non ribosomalpeptidesynthetase(NRPS)origininvolvinganunusualtrichloroleucylstarterunit［J］.Gene,2002,296(1～2):235～247.［18］GuenziE,GalliG,GrgurinaI,etal.Characterizationofthesyringomycinsynthetasegenecluster.Alinkbet,1998,273(49):32857～32863.［19］VaillancourtFH,YinJ,dependentchlorinase［J］.NatChemBiol,2008,4(1):69～74.［22］SánchezC,ZhuL,BranaAF,etal.binatorialbiosynthesisofantitumorindolocarbazolepounds［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(2):461～466.［23］HornungA,BertazzoM,Dziarnoicscreeningapproachtothestructureguidedidentificationofdrugcandidatesfromnaturalsources［J］.Chembiochemistry,2007,8(7):757～766.