微生物学实验指导

微生物学实验技术教学大纲课程编号：课程中英文名称：微生物学实验技术授课教师及职称：李增波开课院系、教研室/研究室：授课对象：课程类别：选修课学时：20学分：2.0预修课程/相关知识要求：微生物学授课目的及内容简介：微生物学实验课是与微生物学理论课同学期开设的一门重要的技术基础课。通过本课程的教学，使学生较熟练的掌握微生物学实验的基本操作技术和初步掌握研究微生物的基本方法。通过对具体微生物材料的观察、分析，进一步加深和巩固对微生物学理论课所学知识的理解并提高学生分析和解决实际问题的能力。本课程的基本内容：1.掌握显微镜的构造、使用技术及保养方法；2.掌握干热灭菌箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱的使用；3.掌握基本染色原理和方法以及制片技术；4.掌握细菌、酵母菌、霉菌的基本形态结构、生理生化特征和血清学特性，具有菌种初步鉴定的基本技能；5.掌握无菌操作方法，熟悉微生物分离、筛选和育种的基本知识和技能；6.熟悉菌种保藏的一般方法。教材及主要参考书目及文献：1.杜连祥，路福平主编。《微生物学实验技术》，中国轻工业出版社，2005，8.2.杜连祥等主编。《工业微生物实验技术》，天津市科学技术出版社，1992，10.主要内容与安排：实验一学习显微镜的结构及使用实验二培养基的制备与灭菌实验三细菌的简单染色和革兰氏染色实验四细菌的荚膜染色实验五放线菌和真菌形态观察实验六微生物细胞大小测定和微生物显微镜直接计数法实验七土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术实验八生素效价的生物测定微生物综合实验柠檬酸发酵及提取39 实验一学显微镜的结构及使用一、实验目的：人的眼睛只能识别大小为0.1㎜的物体。显微镜是精密的放大仪器，是生物学研究不可缺少的工具。我们用它可以观察肉眼看不见的微小生物的结构。中学最常用的是光学显微镜，为了正确操作、妥善保管和维护显微镜，使之延长使用年限，我们必须首先了解显微镜的结构和功能。1、了解普通光学显微镜的基本构造，能够规范和较熟练地使用。2、了解几种特殊光学显微镜的构造、工作原理和用途。二显微镜的结构：一台显微镜包括机械装置和光学系统两大部分，注意比较和识别。1.机械部分（1）镜筒为显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装目镜，下端与物镜转换器相连。作用是保护成像的光路与亮度。（2）转换器固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜。（3）粗准焦螺旋位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距。39 （4）细准焦螺旋位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距。（5）镜座是位于镜臂的下方，显微镜的底部，呈马蹄形的金属座。用以稳固和支持镜身。（6）镜柱从镜座向上直立的短柱。上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。）（7)倾斜关节镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°）便于观察。但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体。（8)载物台从镜臂向前方伸出的金属平台。呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片。较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移动。2.光学部分（1)目镜它是安装在镜筒上端的镜头。是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如5×、10×、15×、20×。（2)物镜是决定显微镜质量的关键部件。安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。一般有三个放大倍数不同的物镜，即：低倍物镜（8×或10×）、高倍物镜（40×或45×）和油浸物镜（90×或100×），根据需要可选择一个使用。显微镜的放大倍数是目镜倍数乘以物镜的倍数。（3)反光镜在聚光器的下面有一个一面平另一面凹的双面圆镜。可作各种方向的翻转，光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜。（4)聚光器（学生用显微镜一般没有这个装置）是由凹透镜组成的，它可以集中反光镜投射来的光线。在镜柱前面有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强。（5)虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成（学生用显微镜一般没有这个装置），在较高级的显微镜上具有此装置。使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度。虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调。39 （6)遮光器简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而装有遮光器。遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）。光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱。3.显微镜的成像原理（放大原理）光线→反光镜→遮光器→通光孔→标本（一定要透明）→物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）→镜筒→目镜（再放大成虚像）→眼。三、显微镜的使用方法（1）取镜安放取镜右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立。（特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜筒中滑脱）。安放放置桌边时动作要轻。一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂向后，距桌边7～10㎝处，以便观察和防止掉落。安放目镜和物镜。（2）对光转动转换器，使低倍物镜正对通光孔。左眼注视目镜内，右眼同时睁开，用手转动反光镜，面向光源。在目镜里看见一个圆形、明亮的视野（一定要用非直射光）。把一个较大的光圈对准通光孔。（3）低倍镜的使用观察任何标本都必须先用低倍镜。①放置切片升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用压片夹压住载玻片的两端。②调焦两眼从侧面注视物镜，转动粗准焦螺旋，让镜筒徐徐下降，至物镜距玻片2～5㎜处。然后用左眼注视目镜，右眼同时睁开，（以便绘图），同时用手反方向（逆时针方向）转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。如果不够清楚，可用细准焦螺旋调节。（不可以在调焦时边观察边使镜筒下降，以免压碎装片和镜头。③低倍镜的观察由所用的目镜放大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数。如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节。4）高倍镜的使用39 ①选好目标先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央。转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜。（用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片）。②调焦在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像。在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度，可升高聚光器或利用凹面反光镜。（5）油镜的使用（中学生一般不使用，在这里不做详述）（6）使用后的整理观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作。清洁完毕，再下降镜筒，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，呈“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩，仍用右手握住镜臂，左手平托镜座，按号放回镜箱中。四讨论：1．降低镜筒时，操作者最关键的姿势应该是什么？其重要性是什么？2．当视野太明亮，光线刺眼时，这样的光线会使人眼的视网膜永久性损坏。其原因和解决的方法是什么？39 实验二培养基的制备与灭菌一、实验目的（1）熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。（2）学习微生物培养基和无菌水的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用。（3）学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。二、实验原理培养基的制备原理：培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃)不会融化而保持固体状态。高压蒸气灭菌原理：39 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。表Ⅴ-2蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵自蛋白含水量(%)30分钟内凝固所需温度(℃)502518605674-8080-90145160-170表Ⅴ-3干热与湿热穿透力及灭菌效果比较温度(℃)时间(小时)透过布层的温度(℃)灭菌20层40层100层干热130-1404867270.5不完全湿热105.3310l10l10l完全在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低(表Ⅴ-2)，二是湿热的穿透力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/英寸2)，112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃39 ，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度(℃)2/3空气排出时的温度(℃)l/2空气排出时的温度(℃)1/3空气排出时的温度(℃)空气全不排出时的温度(℃)千克(公斤/厘米2)(kg/cm2)磅/英寸2(1b/in2)0.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2)，它与1b/in2(磅/英寸2)和温度的换算关系见表Ⅴ-5。表Ⅴ-5蒸汽压力与蒸汽温度换算关系蒸汽压力大气压压力表读数蒸汽温度kg/cm21b/in21.001.251.501.752.002.503.000.000.250.500.751.001.502.000.003.757.5011.2515.0022.5030.00100.0107.0112.0115.0121.0128.0134.5三、实验器材1．药品琼脂三种典型微生物的配方药品；39 2．材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅，电子称，10×200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿。3．设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等四、实验步骤1、称取药品放在大烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化，等药品溶解后用pH试纸调节pH至7.4-7.6，如有沉淀应过滤后分装，每支试管约加入9ml。每组分装30支，加上棉塞，包上牛皮纸，准备灭菌。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。2、无菌水准备在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水O．85％NaCl)，盖好棉塞，包上牛皮纸使其灭菌后，其水量恰为9ml。每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架上，以一大张牛皮纸包扎写上姓名。准备灭菌。3、高压灭菌手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。39 （5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、讨论1、棉塞的作用？附录培养基的配制　　一、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)　　牛肉膏3g　　蛋白胨10g　　NaCl5g　　琼脂15—20g　　水1000ml　　pH7．0—7．2　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　二、淀粉琼脂培养基(高氏1号培养基，培养放线菌用)　　可溶性淀粉20g　　KNO3　1g　　NaCl0．5g　　K2　HPO4　0．5g　　MgSO4　0．5g　　FeSO4　0．01g　　琼脂20g　　水1000ml　　pH7．2—7．4　　配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。39 　　三、查氏培养基(培养霉菌用，实验16)　　NaNO3　2g　　K2　HPO4　1g　　KCl0．5g　　MgSO4　0．5g　　FeSO4　0．01g　　蔗糖30g　　琼脂15—20g　　水1000ml　　pH自然　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　四、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用)　　葡萄糖10g　　蛋白胨5g　　KH2　PO4　1g　　MgSO4　·7H2　O0．5g　　1/3000孟加拉红(rosebengal，玫瑰红水溶液)　　100ml　　琼脂15—20g　　pH自然　　蒸馏水800ml　　0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。　　临用前加入0．03%链霉素稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。　　五、马铃薯培养基(培养真菌用)　　马铃薯200g　　蔗糖(或葡萄糖)20g　　琼脂15—20g　　水1000ml39 　　pH自然　　马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　六、麦芽汁琼脂培养基　　1．取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，置15℃阴暗处发芽，上盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。　　2．将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。　　3．将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20ml，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。　　4．将滤液稀释到5—6波美度，pH约6．4，加入2%琼脂即成。　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　七、葡萄糖-醋酸盐培养基　　葡萄糖1g　　酵母浸膏2．5g　　醋酸钠8．2g　　琼脂15g　　蒸馏水1000ml　　pH4．8　　分装试管，0．70kg/cm2　(10磅/英寸2　)，115．2℃灭菌20分钟后制成斜面。　　八、半固体肉膏蛋白胨培养基　　肉膏蛋白胨液体培养基100ml　　琼脂0．35—0．4g　　pH7．6　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　九、合成培养基39 　　(NH4　)2　PO4　1g　　KCl0．2g　　MgSO4　·7H2　O0．2g　　豆芽汁10ml　　琼脂20g　　蒸馏水1000ml　　pH7．0　　加12ml0．04%的溴甲酚紫(pH5．2—6．8，颜色由黄色变紫色，作指示剂)。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　十、豆芽汁蔗糖(或葡萄糖)培养基　　黄豆芽100g　　蔗糖(或葡萄糖)50g　　水1000ml　　pH自然　　称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水1000ml，煮沸约半小时，用纱布过滤。用水补足原量，再加入蔗糖(或葡萄糖)50g，煮沸溶化。1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　十一、油脂培养基　　蛋白胨10g　　牛肉膏5g　　NaCl5g　　香油或花生油10g　　1．6%中性红水溶液1ml　　琼脂15—20g　　蒸馏水1000ml　　pH7．2　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　注：1．不能使用变质油。　　2．油和琼脂及水先加热。39 　　3．调好pH后，再加入中性红。　　4．分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。　　十二、淀粉培养基　　蛋白胨10g　　NaCl5克　　牛肉膏5克　　可溶性淀粉2g　　蒸馏水1000ml　　琼脂15—20g　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　十三、明胶培养基　　牛肉膏蛋白胨液100ml　　明胶12—18g　　pH7．2—7．4　　在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。溶化后调pH7．2—7．4。　　0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。　　十四、蛋白胨水培养基(实验42)　　蛋白胨10g　　NaCl5克　　水1000ml　　pH7．6　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　十五、糖发酵培养基(实验41)　　蛋白胨水培养基1000ml　　酸性复红水溶液①2—5ml　　pH7．6　　另配20%糖溶液(葡萄糖、乳糖、蔗糖等)各10ml。　　制法：39 　　1．将上述含指示剂的蛋白胨水培养基(pH7．6)分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使充满培养液。　　2．将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟；糖溶液0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。　　3．灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0．5ml(按每10ml培养基中加入20%的糖液0．5ml，则成1%的浓度)。　　配制用的试管必须洗干净，避免结果混乱。　　①0．5%酸性复红水溶液100ml加1mol/LNaOH16ml即成。　　十六、葡萄糖蛋白胨水培养基(实验42)　　蛋白胨5g　　葡萄糖5g　　K2　HPO4　2g　　蒸馏水1000ml　　将上述各成分溶于1000ml水中，调pH7．0—7．2，过滤。分装试管，每管10ml，0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。　　十七、H2S试验用培养基(实验42)　　蛋白胨20g　　NaCl5g　　柠檬酸铁铵0．5g　　Na2　S2　O3　0．5g　　琼脂15—20g　　蒸馏水1000ml　　pH7．2　　先将琼脂、蛋白胨溶化，冷至60℃加入其他成分。分装试管，0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌15分钟，备用。　　十八、柠檬酸盐培养基(实验42)　　NH4　H2　PO4　1g　　K2　HPO4　1g39 　　NaCl5g　　MgSO4　0．2g　　柠檬酸钠2g　　琼脂15—20g　　蒸馏水1000ml　　1%溴麝香草酚蓝酒精液10ml　　将上述各成分加热溶解后，调pH6．8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管，1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟后制成斜面。　　十九、土霉素效价测定用培养基(实验44)　　培养基Ⅰ(供培养试验菌用)　　蛋白胨5g　　酵母膏3g　　牛肉膏1．5g　　NaCl3．5g　　葡萄糖1g　　K2　HPO4　3．68g　　KH2　PO4　1．32g　　琼脂20—25g　　蒸馏水1000ml　　pH7．2　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　培养基Ⅱ(供摊布双碟的上，下层用)　　蛋白胨6g　　酵母膏6g　　牛肉膏1．5g　　葡萄糖1g　　琼脂15—18g　　蒸馏水1000ml39 　　pH6．8　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　　二十、酪蛋白培养基　　KH2　PO4　0．36g　　Na2　HPO4　·12H2　O1．3g　　NaCl0．1g　　ZnSO4　·7H2　O0．02g　　CaCl2　·2H2　O0．002g　　酪素4g　　酪素水解氨基酸0．05g　　琼脂15—20g　　蒸馏水1000ml　　pH7．0—7．2　　先称取4g酪素，再加入0．5mol/LNaOH约2ml，将酪素溶解；然后依次加入其他药品，最后调pH7．0—7．2。0．56kg/cm2　(8磅/英寸2　)，112．6℃灭菌30分钟。　　二十一、完全培养基(TYEG培养基)　　胰蛋白胨10g　　酵母浸膏5g　　K2　HPO4　3g　　葡萄糖1g　　琼脂15—20g　　蒸馏水1000ml　　pH7．0　　1．05kg/cm2　，121．3℃灭菌20分钟。　39 实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。二、实验原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验材料1、活材料：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillussubtilis），培养24小时的大肠杆菌（Escherichiacoli）2、染色液和试剂：结晶紫（附二、（一）、3）、卢哥氏碘液（附二、（一）、4）、95%酒精、蕃红（附二、（一）、5）、复红（附二（一）、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜39 四、实验方法1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂芽孢杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染5min。（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。39 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。五、讨论给出Bacillusthuringiensis和Escherichiacoli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。六、注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。39 实验四细菌的荚膜染色一、实验目的和内容目的：了解荚膜染色的原理、学会并掌握负染色法内容：细菌的荚膜染色法二、实验原理围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色。因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不用热固定，以免荚膜皱缩变形。三、实验材料和用具菌种：自生固氮菌的斜面试管菌种试剂：绘图墨水（用滤纸过滤后备用）、6%葡萄糖、甲醇、1%甲基紫溶液器材：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环、滴管、滤纸三、操作步骤1．湿墨水法（1）菌液：先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量菌体与其充分混匀。（2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。（3）镜检：用低倍镜或高倍镜观察结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。2．干墨水法（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净玻片一端，挑少量菌体与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。（2）制片：左手执玻片，右手另拿一光滑的载玻片（作推片用），将推片一端的边缘置于菌液前方，然后稍向后拉，当与菌液接触后，轻轻地向左右移动，使菌液沿推片接触后缘散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液铺成一层膜。（3）干燥：空气中自然干燥。（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1分钟，立即倾去甲醇。（5）干燥：在煤气灯上方，用文火干燥。39 （6）染色：用甲基紫染1~2分钟。（7）水轻：用自来水轻洗，自然干燥。（8）镜检：用低倍镜或高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。3．Tyler法（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌苔与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。（2）干燥：在空气中自然干燥。（3）染色：用Tyler法染色液染5~7分钟。（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（约冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1~2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。（5）镜检：用低倍镜或高倍镜观察。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。四、注意事项1．加盖片时不可有气泡，否则会影响观察。2．应用干墨水法时，涂片要放在离火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。3．在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。39 实验五放线菌和真菌形态观察一、实验目的和内容（1）目的：1．掌握观察放线菌的方法，辨认放线菌的菌丝孢子。2．掌握观察酵母菌，霉菌的方法，观察酵母菌和霉菌形态。（2）内容：1．放线菌印片法观察2．观察自然状态下的酵母菌（酱油白膜）3．区分死活酵母菌细胞4．制水浸片观察菌.5．粘片观察菌.二、实验材料放线菌，酱油上的白膜，酵母菌，根菌，曲霉0．05%美蓝，棉蓝，结晶紫，水及洗瓶，香柏油，二甲苯，檫镜纸，载玻片，解剖刀，废液缸，吸水纸，接种环，酒精灯，火柴，盖玻片，透明胶，显微镜三、原理及方法步骤，1．放线菌印片观察取菌落→印片→火焰固定→结晶紫染色→水洗→自然晾干→镜检（油镜）（不用洗水纸）2．观察酵母菌（1）区分酵母菌死活细胞①原理：利用美蓝染液区分，美蓝色具有着色慢，染色时间长，但效果清晰的特点活细胞由于新陈代谢作用，使活细胞内氧化还原电位底而且还原能力强，当无菌的染料进入死细胞及新陈代谢缓慢的老细胞后这些细胞因无还原能力或还原能力差而被着色，这样死细胞着色，活细胞无色。②步骤用无菌水洗下PDA斜面培养的酵母菌苔，制成菌悬液，取0.05%美蓝染1液滴于载玻片上→取酵母菌液与染料混匀→→→加盖玻片→染2-3min镜检结果：活细胞无色，死细胞蓝色，（2）观察自然状态下的酵母菌.取美蓝染液1滴于载玻片上→取酱油上白膜于染液中→加盖玻片→镜检或酸菜白膜（假菌丝）39 3．观察霉菌.1制水浸片观察霉菌，无菌取菌.取水1滴于载玻片上→取霉菌菌丝孢子于水滴中→加盖玻片→镜检2粘片观察霉菌取美蓝染液1滴于载玻片上→用透明胶带粘取霉菌→面朝下放在染液上→镜检（粘面）3看曲霉装片，青霉四、实验报告.绘出你所观察的放线菌，酵母菌，霉菌形态图。39 实验六微生物细胞大小测定和微生物显微镜直接计数法一、实验目的：1．了解目镜测微计和镜台测微计的构造。2．掌握用显微测微计测量微生物细胞大小的方法。3．了解血球计数板的构造、原理和使用方法。4．掌握应用血球计数板测定青霉菌孢子浓度的方法。二、实验材料：1．菌种啤酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）24h液体培养物；青霉菌（Saccharomycescerevisiae）斜面培养物2．其它普通光学显微镜、镜台测微计、接目测微计、盖玻片、载玻片、香柏油、滴管、血球计数板、滴管、擦镜纸。三、实验原理：在一定条件下，各种微生物细胞的大小，是微生物形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于微生物细胞很小，只能在显微镜下测量，一般采用显微测微计来测量。显微测微计有镜台测微计和接目测微计两个部件。镜台测微计是在中央部分刻有精度等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格，每格长度为10mm，用于校正接目测微计。接目测微计可直接用于测量细胞的大小。它是一块可放在目镜内的圆形玻片，其中央一般有100等分的小格，每小格代表的长度随目镜、物镜放大倍数的大小而改变。通常必须以镜台测微计来校准，从而计算出在一定的接物镜和接目镜的光学系统中，接目测微计每格的实际代表长度，最后方可利用接目测微计直接测量被测对象的长度和宽度。显微直接计数法，即利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法，各种单细胞菌体的纯培养悬浮液、菌体较大的酵母菌、霉菌孢子、放线菌和真菌的原生质体等均可采用血球计数板计数。将孢子悬液（或菌悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室内，由于载玻片上的计数室盖上盖玻片后的容积（0.1mm339 ）是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目换算为单位体积内的微生物数目。样品中菌（或孢子）数（个/ml）＝每小格的平均数´´稀释倍数在这一公式中，1000代表1ml的容积（即1000mm3），0.00025为每一小格的容积（即0.00025mm3），上面公式可进一步改写为：样品中菌（或孢子）数（个/ml）＝每小格的平均数´稀释倍数´4´106实验内容：四、实验步骤1．微生物细胞大小测定（一）目镜测微计的校正1．放置目镜测微计取出接目镜，旋开接目透镜，将接目测微计放在目镜的隔板上（有刻度的一面向下），然后旋上接目镜，最后将此接目镜插入目镜镜筒内。2．放置镜台测微计把镜台测微计放在显微镜载物台上（有刻度的一面向上）。3．校正接目测微计用低倍物镜观察，对准焦距，通过调焦能看清镜台测微计的刻度；移动镜台测微计和转动接目测微计使两者刻度平行；转动推进器从而使两测微计某段起、止线完全重合，数出两条重合线之间的格数。用同法分别校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。4.计算接目测微计每格的相对长度接目测微计每格的长度（mm）＝（二）测定啤酒酵母细胞的大小取下镜台测微计，将用压滴法制成的啤酒酵母水浸片放在显微镜载物台上，用高倍镜观察，调至物象清晰后，转动接目测微计，测量酵母菌细胞的长度和宽度分别占有几个格数，再将测得的格数乘以接目测微计每格的相对长度即可求出酵母菌细胞的大小。要求在同一张片上测定10~20个酵母细胞并求出平均值，这样才能代表酵母细胞的平均大小。39 最后取出目镜测微计，将接目测微计和镜台测微计分别用擦镜纸擦拭后放回干燥处保存。1.微生物显微镜直接计数法（一）青霉菌孢子悬液的制备1．取一支孢子成熟的青霉菌斜面培养物，用无菌移液管吸取5ml无菌水加入菌管中。2．采用无菌操作技术，用接种环将菌管内斜面上的孢子轻轻刮下，注入到盛有玻璃珠的三角瓶中，同样方法将另15ml无菌水分三次再加入菌管中，将剩余的孢子全部刮干净，将孢子液全部合并于三角瓶中，水平旋转振荡30min，然后倒入含有脱脂棉的无菌漏斗中过滤，得单孢子悬浮液。（二）显微镜下孢子浓度测定1．稀释定量取出孢子悬液，加到无菌干燥的试管中，按照一定倍数将其稀释，稀释的程度一般以血球计数板每小格内含有5~10个菌或孢子最为合适。2．加样取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管从盖玻片的边缘滴一滴孢子稀释液，则孢子稀释液自行渗入，注意不要产生气泡。3．计数静止5min，使孢子沉降不再流动，然后即可在显微镜下观察计数。先在低倍镜下找到计数室的位置，然后换成高倍镜计数。如发现孢子悬液太浓或太稀释，应重新稀释并计数。计数一个样品要从两个计数室中的计算结果取平均值，以减少实验误差。4．清洗血球计数板计数完毕，将血球计数板取下，在水龙头上用水柱冲洗，切忌用硬物洗刷，然后自然吹干，镜检观察是否有孢子或其他沉积物，直至洗刷干净。五、实验作业1．计算出目镜测微尺在低、高倍镜下校正结果。2．记载测定10-20个菌体大小，然后用平均值来表示菌体大小。菌体大小表示：长（μm）×（μm）。3．计算出啤酒母每毫升菌体的数量。39 实验七土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术一、实验目的1．掌握倒平板的技术和分离纯化微生物的基本操作技术。2．设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。二、实验内容：1．用稀释法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。2．用平板划线法分离纯化微生物。3．学习斜宜接种、穿刺接种、平板接种、液体接种等接种方法。三、实验步骤及方法（一）微生物分离的方法有很多种，但常用的有两种：1.平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，二获得单个菌落，从而达到分离的目的，具体方法如下：1)倒制平板：将固体培养基熔化，冷却至50-55℃，然后在酒精灯火焰旁，以右手持培养基，左手拿培养皿，以无菌操作将培养基注入培养皿内，约15ml，轻微转动培养基，使培养基均匀分布，然后静置于水平位置，凝固即成平板，并在皿该边贴上标签。2.稀释平板分离法稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种记数方法。（1）备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品10g，加入装有90ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成10-1土壤稀释液，然后用无菌移液管吸取9ml无菌水的试管内，制成10-2的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次，然后取出移液管，并将其通过火焰，再插入原来包移液管的纸套内，以备再用，振荡10-3的稀释液试管，再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内，再吹洗三次，然后吸出1ml10-4的稀释液至另一支装有9ml无菌水的试管中，制成10-5稀释液。用同样方法再制成10-6、10-7的稀释液，稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的10-7的稀释液开始吸取1ml10-7稀释液，加到相应编号10-7的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-6、10-5的稀释液加到相应编号为10-6、10-5的无菌培养皿内，其他浓度与此类同。整个分离过程见下图。39 （2）平板的制作：将固体培养基融化，待冷却至45-50℃左右，分别倾入到已盛有10-7、10-6、10-5稀释液的无菌培养皿内，迅速轻轻摇匀，静置凝固。凝固后将平板倒置于30℃恒箱中，培养24-48小时，细菌即在所固定的位置长成肉眼能见的菌落。（二）接种方法1.固体接种将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。微生物的接种方法，因使用不同的容器，不同的培养基以及不同的培养方法二有所不同，常用的几种方法如下：1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面话曲线或直线，勿使菌体沾污管壁，灼烧试管口，塞回棉塞（不要将试管去迎棉塞以免进入杂菌），灼烧接种环将接种后的斜面拿去培养。此法用于好气性微生物的接种。2.液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。3.穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种： （1）接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。 （2）39 斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。 四、讨论1.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？2.接种时，为何要尽量使试管平放？3.根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、霉菌？39 实验八抗生素效价的生物测定一、实验目的学习了解抗生素效价的生物测定（管碟法）的基本原理和方法。二、基本原理某些微生物在代谢过程中所产生的次级代谢产物能在低浓度的情况下抑制或杀死某些微生物，这种物质称为抗生素。抗生素效价的生物测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法中的一种，本法是利用抗生素在琼脂培养基的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定抗生素的浓度。在一定范围内，浓度与抑菌圈直径在双周半对数表上（浓度为对数值，抑菌圈直径为数字值）成直线函数的关系，由此绘制成标准曲线，从样品的抑菌圈大小可在标准曲线上求得其效价。由于本法是利用抗生素抑制敏感细菌的特点，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度也很高，不需特殊设备，故一般实验室及生产上多采用此法。但此法也有缺点，即操作步骤多，手续繁杂，培养时间长、得出结果慢。尽管如此，由于它有上述的独特优点而被世界各国所公认，成为国际通用的方法被列入各国药典法规的范围内。本实验以龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus）产生的土霉素效价测定为例。三、实验材料黄色八叠球菌（Sarcinaflava）；（土霉素效价测定用）培养基，（供培养试验菌用）培养基Ⅰ，（供摊布双碟的上、下层用）培养基Ⅱ；培养皿，牛津杯（或不锈小钢管），陶瓦圆盖，50ml、250ml、1000ml容量瓶，0．1mol/LHCl，土霉素标准品等。四、操作步骤1．pH6．0磷酸缓冲液的配制准确称取KH2PO40．8g和K2HPO40．2g，置100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，灭菌备用。39 2．标准土霉素溶液的配制精确称取20mg土霉素标准品，每毫克含880单位（880r/mg），先用0．1mol/LHCl溶解（按称量每10mg加酸1ml），然后加入无菌蒸馏水稀释成每毫升含1000单位（1000r/ml）的溶液，此液在5℃以下保存。3．被测样品溶液的制备精确称取样品20mg左右，先用0．1mol/LHCl2ml溶解，然后再用无菌蒸馏水稀释成估计每毫升含1000单位，再吸取1ml至50ml容量瓶中加pH6．0磷酸缓冲液至刻度，稀释成估计每毫升含20单位的样品溶液。4．黄色八叠球菌菌液的制备取每周接种一次、用普通琼脂斜面保存的黄色八叠球菌菌种，在试验前一日，将细菌接种于盛有培养基Ⅱ的试管斜面上，于28℃培养24小时后，用培养基Ⅰ约5ml将菌洗下，即得。5．双碟的制备取直径90mm，高15mm的双碟27个，分别注入已溶解的培养基Ⅱ20ml，摇匀，置水平位置使凝固，作为底层。另取培养基Ⅱ，溶解后冷至48—50℃，加入上述黄色八叠球菌菌液适量（以能得清晰的抑菌圈，使每1ml含土霉素20单位的标准液所致的抑菌圈直径在15—18mm为合适），迅速摇匀，在每个双碟中分别加入5ml此含菌培养基，使在底层上均匀摊布，作为菌层，置水平位置待凝固后，在每双碟中以等距离均匀放置牛津杯6个，用陶瓦圆盖覆盖备用。6．标准曲线的制备取50ml容量瓶9只编号，并向各瓶内分别加入不同量的每毫升含1000单位的标准品溶液，用磷酸缓冲液释稀至刻度，使成每毫升含土霉素8、10、12、16、20、24、28、32、36单位9种浓度的标准品稀释液（表Ⅹ-3）。取上述制备的双碟24个，每碟的6个牛津杯间隔的3杯中各装每毫升含20单位的标准品稀释液，将每3个双碟组成一组，共分8组。在第一组的3个双碟的空杯中各装入每毫升含8单位的标准品稀释液；第二组的空杯中各装入每毫升含10单位的标准品稀释液，依次将8种浓度的标准品稀释液装毕。如图X-6。共得每毫升含20单位的标准品稀释液72杯，其他各种稀释度的标准品各得9杯，全部双碟盖上陶瓦圆盖后置37℃39 培养16—18小时。测量各抑菌圈的直径，分别求得每组3个双碟中的每毫升中含20单位标准品抑菌圈直径与其他各种浓度标准品抑菌圈直径的平均值，再求出8组中每毫升含20单位标准品的抑菌圈直径总平均值，总平均值与各组中每毫升含20单位的抑菌圈直径平均值的差数，即为各组的校正数，根据各组校正数将8种浓度的抑菌圈平均值校正。例如：如果8组每毫升含20单位的标准品的抑菌圈直径总平均值为17．0mm，而每毫升含12单位的一组中9个每毫升含20单位标准品的抑菌圈直径平均为16．8mm，则其校正数应为17．0-16．8=0．2，如果9个每毫升含12单位标准品的抑菌圈直径平均为16．4mm，则校正后应为16．4+0．2=16．6（mm）。以浓度为纵坐标，校正后的抑菌圈直径为横坐标，在双周半对数图纸上绘制标准曲线。7．测定法取上述已制备好的双碟3个，在每碟6个牛津杯间隔的3杯中各装入每毫升含20单位的标准品稀释液，其他3杯中各装入估计每毫升含20单位的样品溶液，盖上陶瓦圆盖，置37℃培养16—18小时，测量各抑菌圈的直径，分别求得标准品稀释液和样品溶液所致的9个抑菌圈直径的平均值，照上述标准曲线的制备方法求得校正数后，将样品溶液所致的抑菌圈直径的平均值校正，再从标准曲线中查得样品溶液的效价，并换算成被测样品每毫克所含的单位数。五、讨论1．结果被测样品的效价是每毫升含多少单位？2．思考题（1）什么叫抗生素？它对微生物的作用机制有几种？举例说明之。（2）抗生素效价测定中，为什么常用管碟法测定？39 微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一、实验目的1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。2．了解水源水的平板菌落计数的原则。3．学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。三、实验材料和用具：1．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。2．试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。3．器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。四、实验步骤第一周1．备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。39 2．制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3．以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。第二周（周一）水样的采集：1．自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟，以排除管道内积存的死水，随后用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以供检测。2．池水、河水或湖水：应取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入4℃冰箱中保存。（周二）1．水中细菌总数测定（1）自来水：用无菌移液管吸取0.2ml水样，涂布到倒好的牛肉膏蛋白胨培养基上。然后将其倒置于37℃恒温箱内培养24小时。此水样重复两个培养皿。（2）池水、河水或湖水：①水样稀释：取4支无菌试管，依次编号为10-1、10-2、10-3、10-4，然后在上述每支试管中加入9ml无菌水。接着取1ml水样加入到10-1试管中，摇匀；另取1ml无菌移液管从10-1试管中吸1ml水样至10-2试管中（注意点同上），如此稀释至10-3、10-4管（稀释倍数视水样污染程度而定，取在平板上能长出30~300个菌落的稀释倍数为宜）。②涂平板：每个稀释度的试管中各取0.2ml稀释水样加入到牛肉膏蛋白胨培养基上进行涂布，每个稀释度重复两个培养皿。③将所有培养皿倒置于37℃恒温箱内培养24小时。2．水中大肠菌群的检测：初发酵试验（1）自来水：在2个装有50ml339 倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的三角瓶中，各加入100ml水样。另在10支各装有5ml3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基的试管中，各加入10ml水样，混匀后37℃恒温箱内培养24h。（2）池水、河水或湖水：在装有5ml和50ml3倍浓缩乳糖蛋白胨培养基试管或三角瓶中分别加入10ml和100ml的原水样。然后在装有10ml乳糖蛋白胨培养基试管中分别加入1ml10-1、10-2和10-3的稀释水样和1ml原水样，混匀后，37℃培养24h（每个稀释度重复两个试管）。3、配制伊红美兰培养基（蛋白胨10g，K2HPO42g，乳糖10g,2%伊红Y溶液20ml,0.65%美蓝溶液10ml，琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH7.1），然后进行灭菌处理。（周三）1．水中细菌总数测定：计菌落数将培养24h的平板取出，用肉眼观察，计平板上的细菌菌落数。2．水中大肠菌群的检测：将产气产酸的阳性管放入4℃冰箱中保存，记下阳性管数；将不产气产酸的阴性管继续放入37℃恒温箱内培养24h。（周四）将37℃恒温箱内产气产酸的阳性管也放入4℃冰箱中保存，记下阳性管数。第三周（周一）水中大肠菌群的检测：将经24h或48h培养后产酸产气或仅产酸的试管中菌液分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，于37℃培养24h。（周二）1．水中大肠菌群的检测（确定性试验用平板分离）：将出现以下3种特征的菌落进行涂片、革兰氏染色和镜检。①深紫黑色，具有金属光泽的菌落。②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落。③淡紫红色，中心颜色较深的菌落。将革兰氏阴性菌挑选出进行复发酵试验。并且标记出阳性菌落的培养皿继续放入4℃冰箱中保存。2．配制乳糖蛋白胨培养基并灭菌（配方同上）。第四周（周一）39 水中大肠菌群的检测（复发酵试验）：将选择出的菌落，经涂片、染色镜检后，若为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则用接种环挑取此菌落的一部分转接含乳糖蛋白胨培养基试管，37℃培养24h。（周二）观察实验结果，若呈现产酸产气即证实存在有大肠菌群。整个实验结束，完成实验报告。五、实验结果及分析1、水中细菌总数的测定（菌落数）水样类型1号平皿菌落数2号平皿菌落数平均数1ml不同稀释度水样的平均菌落数自来水10-110-210-310-42.数据分析39 毕业综合实验：柠檬酸发酵及提取一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉Co8272．山芋粉（二）主要仪器设备1．旋转式摇床2．显生镜三、操作步骤1．种子培养基制备：称取山芋干粉100g、（NH4）2SO45g，加水至1000ml，pH自然。分装后于121℃灭菌30min，三角瓶内装液量为20%。2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面或麸曲孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。4．发酵培养基制备：称取山芋干粉200g，加入0.2克液化酶，加水至1000ml，pH自然。分装后（装液量为20%）于121℃灭菌30min冷却备用。5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的10%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、250r.p.m条件下发酵4~5天。（二）柠檬酸的提取——柠檬酸钙的制备一、实验原理在成熟的柠檬发酵液中大部分是柠檬酸，但还含有部分山芋粉渣、菌丝体以及其它的代谢产物的杂质。柠檬酸的提取是柠檬酸生产中极为重要的工序，柠檬酸的提取方法有钙盐沉淀法、离子交换法、电渗折法及萃取法等，目前广泛用于国内生产的是钙盐沉淀法，其原理是利用柠檬酸与碳酸钙反应形成不溶性的柠檬酸钙而将柠檬酸从发酵液中分离出来，并利和硫酸酸解从而获得柠檬酸粗液，经活性炭、离子交换树脂的脱色及脱盐，再经浓缩，结晶干燥等精制后获得柠檬酸成品，其中和及酸解反应式如下：中和：2C6H8O7·H2O+3CaCO3→Ca3（C6H5O7）2·4H2O↓+3CO2↑+H2O酸解：Ca3（C6H5O7）2·4H2O+3H2SO4+4H2O→2C6H8O7·H2O+3CaSO4·2H2O↓本实验以提取柠檬酸钙盐为主。二、实验器材39 （一）实验材料1．柠檬酸发酵液、轻质碳酸钙（200目）、0.1429N氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂（二）仪器设备1．制备式离心分离机、滴定管、烘箱三、实验步骤1．发酵液预处理：将成熟的柠檬酸发酵液加热至80℃，保温10~20分钟，趁热进行离心分离，取滤液备用并记录滤液总体积。2．发酵液总酸的测定：取滤液1ml，加5ml蒸馏水于洁净三角瓶人加入1滴酚酞指示剂用0.1429NNaoH滴定于初显红色为止，记下NaOH的消耗量。3．中和：将发酵滤液加热至70℃，同时加入发酵液总酸量72%的轻质碳酸钙进行中和至pH5.8，残酸0.2%~0.3%，并于85℃条件下搅拌并保温30min。4．离心及洗糖：将中和液趁热离心，倾去上清液后加入滤液总量1/2的80℃热水洗糖，再次离心所得固体即为柠檬酸钙盐。5．将所得柠檬酸钙置于干燥洁净的表面皿中，于105℃烘干称重。39