16s rrna靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群

最近看到一本书《环境基因组学实验指南》其中第十七章题目为“16SrRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群”，它作为一个实验技术写进实验书里，比看期刊，论文更有所帮助。我将这一章编写的内容全部敲下来给你，希望对你的实验有所启示和帮助。第十七章16SrRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群概论过去几十年中，利用所谓的生物标记物来检测环境样本中的微生物菌群的分子微生物生态学（molecularmicrobialecology）得到了快速的发展。许多分子可以作为生物标记物，包括细胞壁成分、蛋白质、脂类、DNA或RNA，尤其是核糖体RNA（rRNA）小亚基和相应基因的应用在微生物生态学的发展中发挥了重要的作用。目前已经建立了几种应用于环境样本中的微生物群落的指纹特征分析方法，其中最常用的方法是PCR扩增片段的变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE），DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开，分离的原理使基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性融点不同实现的。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较，利用DGGE可使组成的多样性一目了然，其中每一条带原则上代表一种细菌系群，染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带，理论生，DGGE指纹图谱可以区分一个碱基对的差别。关键词：食本芽孢杆菌（Bacillusbenzoevorans）；DGGE；指纹图谱；16SrRNA基因；土壤微生物1.引言微生物菌群对于地球上甚至地球外的几乎所有环境的发展和功能是至关重要的，而针对一系列细胞生物标记物的分子微生物生态学方法的长足发展，使得对微生物群落组成和功能的检测可以不依赖于微生物的培养（1，2）。靶向生物标记物可以是在不同的分类水平表明特定微生物种存在的任何生物成分，包括细胞成分如细胞壁成分、蛋白质、脂类、DAN或RNA。即使细胞死亡后这些分子仍可以被检测到。这使得我们可以研究微生物群落并追踪其在不断变化的环境条件下的发展过程，所以包括历史标本，储存的样本（风干保存用于后续分析的样本）甚至考古样本这些不可能用培养的方法获得微生物的材料都可以得到研究（3-5）。微生物生态学可以很方便的应用核糖体RNA小亚基（SSUrRNA；细菌和古细菌的16SrRNA，真核生物的18SrRNA）和对应的基因作为生物标记物。以这些分子作为靶点，可以利用很多互为补充的分子技术来检测不同环境下总的细菌、古细菌和真核生物群落，以及特定的感兴趣的微生物种类。多以SSUrRNA基因检测作为普遍的系统发育标记物的分子指纹图谱方法，常被用于在分子微生物生态学中快速检测不同时间或空间中微生物群落组分的变化，结合数理统计分析，这些技术是研究不断变化的环境因子如何影响微生物群落构成的有力工具（6,7）。几种类型的梯度凝胶电泳已经被有效地应用于环境样本中微生物群落的观察。最常用的是变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE），而最新出现的是结合了DGGE和TGGE的主要原理的时间温度梯度凝胶电泳。DGGE在微生物生态系统的首次应用是在对海洋生态系统中的细菌多样性分析（9）。凝胶电泳技术在快速比较不同环境中个微生物群落和检测某一特定的群落在不同时间多个成员内的组成变化的研究中非常有效。 DGGE是一种利用序列差异来分离同样长度DNA片段混合物的技术（10）。分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝胶澳中的序列特异性融点不同实现的，在5’端引入GC夹（GC-Clamp）可保护DNA片段不会完全变性。这个GC夹有30~50bp长，是在进行DGGE分析之前加到对靶基因进行PCR扩增的一个引物上的，理论上，在不长于500bp的PCR扩增产物上的单个碱基对差异都可以被鉴定出来，在变性梯度中，不同序列的片段将停留在不同的位置。1.材料2.1利用试剂盒（FastDNASPINKit）分离DNAFastDNASPINKit（用于土壤）（QBIOgene，Cambs，UnitedKingdom）是商品话的DNA分离试剂盒，在实验室中常用于广泛的环境介质检测，包括土壤、沉积物、排泄物。也可用于其它DNA分离方法。2.2PCRPCR可以用Taq聚合酶在PCR仪上进行。不加模板DNA，先准备基本组分按照实验室现有的试剂需要准备的基本组分就是Mix和上、下游引物及超纯水。根据大多数文献采用的量和浓度去加。：1、5μL10×PCR缓冲液（10×缓冲液：200mmol/LTris-HCl，pH8.4，500mmol/LKCl）2、3μLMgCl2（50mmol/L）3、1μL上游引物（10mmol/L）4、1μL下游引物（10mmol/L）5、1μLdNTP（10mmol/L）6、0.25μLTaqDNA聚合酶（5U/μL）7、37.75μLMilliQ水共49μL的反应体积。配制时将上面的每一组份乘以需要的反应次数，多加一份。分装在0.2mLPCR管（每管49μL）中，最后加入模板DNA（1μL）.每一反应中最终模板的量在10~100ng之间。将离心管放入PCR仪中，开始按设定的反应扩增。2.3DGGE2.3.1DGGE仪器设备部分1、大小玻璃板2、Gelbond（胶贴）3、Bio-RadDGGE设备，包括：a．温度控制模块包括加热器、搅拌器、泵和电泳导线。b．电泳槽c．三明治芯d．三明治夹e．分隔条f．梳子4、电源5、泵和混合槽2.3.2DGGE电泳1、变性剂（100%变性剂、0%变性剂）根据实验要求选择合适的变性剂浓度（一般为30%~60%），实验所用试剂均用超纯水进行配制，需过滤或灭菌的应按照要求进行。有些药品的保存期也是有限制的，尽量用新配制的溶液。试剂保证不能配错。2、50×TAE缓冲液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA，pH8.0。2.3.3DGGE染色溶液根据自己的选择用染色液对凝胶进行染色。2.方法 DGGE是在分子微生物生态学中建立的较完善的分子指纹图谱技术（11,12）。DGGE技术可以迅速地分析微生物群落。复杂的微生物群落可以利用DGGE达到可视化，理论上其中每一条带代表一细菌种系型，然而，此技术的缺陷在于只利用了非常有限的遗传信息（16SrRNA）。DGGE的原理使利用序列特异性将同样长度的PCR扩增产物分开。双链DNA在变性作用下解离。DNA在电场中向正极移动，在特意向序列（两条核苷酸链解离）决定的特定位置溶解。在扩增过程中，PCR产物的5’或者3’端引入了GC夹，以避免完全变性，最终形成的叉状结构实质上发挥了阻止迁移的作用。染色后，可以在DNA分子在凝胶中停留迁移的位置观察到条带。理论上，DGGE指纹图谱可以区分单个碱基对的差异。3.1DNA分离DNA可用FastDNASPINKit（用于土壤）（QBIOgene，Cambs，UnitedKingdom）直接从土壤中（或其他样本）按照说明书进行分离。这种试剂盒可高效裂解所有的微生物，包括原来比较难处理的如细菌芽孢和内孢子、革兰氏阳性细菌、酵母、藻类、线虫和真菌。3.2PCR程序下面是针对表1的引物优化后的PCR循环参数，选择专门对应你处理的物种适合的程序。1.细菌群落DGGE-PCR：预变性2min95℃变性30s95℃35个循环杂交40s56℃延伸1min72℃后延伸5min72℃2.古细菌DGGE-PCR：预变性5min94℃变性30s94℃35个循环杂交40s52℃延伸1min68℃后延伸5min68℃3.原核菌群DGGE-PCR：预变性5min94℃变性30s94℃35个循环杂交45s56℃延伸130s72℃后延伸10min72℃3.3DGGE-PCR引物表1提供了一组普遍的和种群特异性的DGGE-PCR引物（见注释3）。表1不同微生物菌群常用的DGGE-PCR引物引物序列参考文献细菌（17）Bact-968-GC-F5’-cgcccggggggcgccccgggcggggcgggggcacggggggaacgcgaaccttac3’（17） L1401-R5’-gcgtgtgtacaagaccc-3’（18）Bact-0357-F-GC5’-ccgggggcgcgccccgggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3’（18）Bact-0158-R5’-attaccgcggctgctgct-3’（18）Bact-0954-F-GC5’-cgccgggggcgcgccccgggcggggcgggggcacgggggggcacaagcggtggagcatgtgg-3’（18）Bact-1369-R5’-gcccgggaacgtattcaccg-3’（18）古细菌Arch-109-F5’-actgctcagtaacacgt-3’（19）Uni-515-GC-R5’-cgcccggggcgcgccccgggcggggcgggggcacggggggatcgtattaccgcggctgctggcac-3’（20）真核生物Euk1A5’-ctggttgatcctgccag-3’（21）Euk516r-GC5’-cgcccggggcgcgccccgggcggggcgggggcacggggggaccagacttgccctcc-3’（21）3.4DGGE3.4.1凝胶“三明治”制备（见注释4）1.用肥皂清洗大、小玻璃板，干燥后用95%乙醇清洗（见注释5）。2.切除大小和大玻璃搅拌一样的胶贴（见注释6）。3.在大玻板表面上加一些水。4.将胶贴的疏水面放在玻板上（你可以滴一滴水在胶贴上来方便地检查疏水面，疏水面的水将滑落）。5.用滚筒固定胶贴后移去纸保护层。6.用纸巾轻轻吸干胶贴。7.用95%乙醇清洗分隔条，并放于胶贴的左右两侧。8.将小玻板放在上方。9.用夹子夹住玻板“三明治”，并放入“三明治支架”10.按下衬垫，并拧紧压板的螺丝。11.将玻璃“三明治”放在橡胶密封垫上，并按下手柄。12.用移液器加入凝胶“塞”。3.4.2凝胶“塞”制备在制备主要的分析梯度凝胶前，需在DGGE玻板盒底部做一个0%变性剂PAG凝胶“塞”——防治底部泄露。制备凝胶“塞”的主要方法如下：1.确保凝胶架处于水平；必要时调节底部的螺丝。2.如下制备“塞”溶液（一块凝胶体积）：1.5mL0%变性剂，8%PAG溶液4.5μLTEMED15μL10%APS3.通过橡胶密封垫一边加入1mL“塞”溶液（见注释7）。4.“塞”溶液放置10min。5.灌入梯度凝胶和浓缩胶。3.4.3制备凝胶1.从低到高浓度梯度宁骄傲和浓缩胶按表2混合配制，操作在冰上进行（见注释8）。2.用软化水清洗梯度制备仪和连接管道，打开泵（流速为19mL/min），抽干系统。 3.关闭梯度植被以各室之间的开关。4.用纸巾吸干各室。5.当凝胶溶液冷却后，加入10%APS至高浓度和低浓度的变性剂溶液。6.在右室加入高浓度溶液，在左室加入低浓度溶液。7.开始搅拌，打开开关，并立即启动泵保持流速4.5mL/min。8.将针头放于两块玻璃板间。9.当凝胶灌注结束后，关掉泵，转移至Erlenmeyer烧瓶。10.用软化水清洗各室，启动泵抽干系统。11.加10%APS到浓缩胶中。12.关掉各室间的开关，在右室加入浓缩胶。13.将针头放于两块玻璃板间，启动泵，保持流速为3mL/min。14.灌完浓缩胶后，插入梳子，让其凝固形成加样孔。避免气泡产生，否则会在条带中出现凹陷。15.凝胶放置聚合1h。表2DGGE梯度混合比例表梯度/%0%(mL)100%(mL)终体积(mL)TEMED(μL)APS(μL)09-91350309.13.9131350318.974.03131350328.844.16131350338.714.29131350348,.584.42131350358.454.55131350368.324.68131350378.194.81131350388.064.94131350397.935.07131350407.85.2131350417.675.33131350427.545.46131350437.415.59131350447.285.72131350457.155.85131350467.025.98131350476.896.11131350486.766.24131350496.636.37131350506.56.5131350516.376.63131350526.246.76131350536.116.89131350545.987.02131350555.857.15131350 565.727.28131350575.597.41131350585.467.54131350595.337.67131350605.27.81313503.4.4电泳1.在电泳槽中加入0.5TAE缓冲液。2.在电泳前至少90min打开Dcode，以便缓冲液在60达到平衡。3.在1h的聚合后，轻轻拔出梳子。4.用软化水清洗孔内和孔上未聚合的凝胶，并轻敲“三明治”。5.关掉Dcode，打开盖子。6.拿出“三明治”，放入电泳槽中。7.打开Dcode，直至上缓冲室充满缓冲液。8.关掉Dcode，打开盖子。9.用充满缓冲液的注射器和针头清洗所有加样孔。10.在加样孔中加入样品（见注释10）。11.盖上盖子，后打开Dcode。12.打开电源，200V电泳10min，调至85V再电泳16h。3.5凝胶染色（见注释11和12）1.关闭电源。2.从板上移出凝胶，放入托盘中进行染色观察和干燥。3.6DGGE凝胶的统计分析DGGE凝胶经过染色和过夜干燥后用400DPI分辨率扫描，并用软件如Bionumerics4.0（AppliedMathsBVBA，比利时）进行分析。有很多方法用于评价DGGE图谱之间的相似性，主要是通过计算条带的有无或者用Pearson积差相关法比较图谱的光密度曲线等方法得到相似相指标（13,14）。UPGMA算法可以在绘制聚类树状图分析软件中应用。多变量数据分析（如CANOCO软件）也可用于DGGE图谱分析，关于其他用于分析微生物群落指纹图谱的数据分析方法在Fromin等的文章中有所讨论。1.注释1.其他公司的聚合酶和PCR仪也可使用。2.2.只有在银染的时候才家甘油，其他染色无需加入。3.GC夹可以连到上游和下游引物，但是通常连到5’端。4.注意：在DGGE凝胶的电泳和显影过程中所用的是高毒和致癌物质，使用时，请佩戴手套，而且当被污染时，及时更换。5.玻板的仔细清洗对凝胶配制非常关键，油脂点会导致聚丙烯酰胺凝胶表面扭曲。6.胶贴如果比大玻璃板还大则无法制备凝胶。7.避免出现气泡。8.使用通风柜。9.将空的三明治放在盒架的另一边，构成一个封闭上缓冲室。10.记住上样是按照镜面方向。11.按照Snaguinetti等（16）稍作修改。12.凝胶也可以用SYBRGOLD或EB及其他染液染色。13.步骤5~8的溶液按化学废弃物处理。参考文献（略）