生物介质中mn9202检测方法的建立及其应用论文

　　生物介质中MN9202检测方法的建立及其应用论文冉玉华，周四元，刘新友，滕增辉，杨润涛，杨志福，梅其炳【关键词】MN9202；反相高效液相色谱；生物介质EstablishmentofamethodofdeterminingMN9202inbiomediumanditsapplication【Abstract】AIM:Toestablishamethodtodetermine2,6Dimethyl4(3nitropheny1)1,4dihydropyridine3carboxylicaciddimethylester5carboxylicacidpentylester(MN9202)inbiologicalmediumbyreversephasehighperformanceliquidchromatography(RTHPLC).METHODS:ThespecimencontainingthelysateofCaco2cellsandratplasmaovedintothetubesandthenevaporatedinventilationcabi.Theresidueethanol,then20μLsolutioninterferenceinthecertainmobilephrases,theregressionequationofthestandardcurvetodetectthecellsamplesg/L;ThestandardcurvetodetectMN9202intheplasmag/L.CONCLUSION:TheanalyticalmethodinationofMN9202inbiologicalmedium.【Keyedium【摘要】目的：建立生物介质中1，4二氢2.freelg/L.测定血浆样品的工作曲线回归方程为Y=0.0058X+0.1468，r=0.9998,n=7(P0.01),线性范围为20~500mg/L.结论：所建立的分析方法简便、稳定、灵敏、准确，可用于生物介质中MN9202的浓度检测.【关键词】MN9202；反相高效液相色谱；生物介质0引言1，4二氢2，6二甲基4(3硝基苯基)3，5吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）是一种二氢吡啶类钙离子阻滞剂，也是目前研究报道的具有较好的药理效应的二氢吡啶类药物之一.MN9202具有明显的扩血管效应，其作用与其抑制电压依赖性钙通道，减少Ca2+内流有关.MN9202也具有对抗血小板聚集诱导剂角叉菜胶引起血栓的作用，作用机制可能与共抑制红细胞，血小板聚集，保护血管内皮，舒张痉挛血管有关［1］.二氢吡啶类药物口服剂量小、有效血药浓度低，目前国内外所用的检测方法包括LC,LCMS等，为了有效检测其血药浓度及便于进行相关的研究，必须建立灵敏度较高的检测方法.我们通过优化色谱条件，选择具有强吸收的237nm处作为二氢吡啶类药物的检测波长，从而提高了灵敏度，可用于生物介质中MN9202的浓度检测.1材料和方法1.1材料选用大鼠血浆作为生物介质之一［2］，大鼠［（200±15) g］由第四军医大学实验动物中心提供.实验中选用的另外一种生物介质是Caco2细胞，它来源于人结肠癌细胞，在体外培养条件下，能够分化形成单层的细胞的膜，与小肠上皮细胞结构和生理状况相似，是目前国内外公认的体外药代动力学研究的理想模型［3］.Caco2细胞接种于24孔板（Costar，美国），培养10~14d，用于实验［4］.高效液相色谱仪（美国Beckman公司），高速离心机(日本HitachiCR21F)，色谱分析柱为C18柱(250mm×4.6mm,5μm,phenomenex).MN9202和MN9203(内标)为本教研室合成，纯度大于98%，乙腈(色谱纯，TEDIA公司)，甲醇（色谱纯，TEDIA公司），碱化液50mmol/L的磷酸氢二钠(用NaOH调节pH到12)，其他试剂均为分析纯.1.2方法1.2.1色谱条件色谱分析柱为C18柱(250mm×4.6mm，5μm，phenomenex),流动相：乙腈/水（82/18,V/V），流速:1mL/min，检测波长为237nm.1.2.2生物样品预处理①细胞给药后反复冻融成为细胞裂解液；取0.5mL细胞裂解液（其中药物的浓度为500mg/L），加入0.1mL的MN9203（内标，终浓度为200mg/L），再加入1mL的碱化液，用1mL的乙醚提取两次，收集提取液于尖底试管中，于通风橱中由空气流自然挥干.残留物用50μL的甲醇溶解后进行高效液相分析.②大鼠腹腔静脉取血，肝素抗凝，离心得血浆［5］.取0.5mL血浆，加入0.5mL含有内标的药物（药物浓度和内标的浓度分别为500mg/L和200mg/L）,混匀，其余步骤同①.1.2.3分析方法培育10~14d的Caco2细胞，呈单层细胞膜的形式，可以用于药物的摄取实验.将MN9202配制成一定的浓度，在每孔细胞上加入相同体积的药物，并将药物与细胞一起孵育5，10，20，30，40，60min，弃去培养液，用PBS冲洗细胞3次，细胞反复冻融成为细胞裂解液，用1.2.2中的方法分析细胞裂解液中药物的浓度，观察Caco2细胞对药物的摄取情况.2结果2.1提取溶剂的选择选用乙醚作为提取溶剂，对细胞和血浆等生物样本中药物，具有提取率高，挥发速度快，杂质干扰较少的优点［4］.2.2流动相和检测波长选用药物具有强吸收的237nm作为检测波长，将曾用的甲醇和水优化设计成乙腈和水（82/18，V/V）为流动相.干扰物质，内标以及药物能够实现基线分离,见色谱图.2.3工作曲线回归方程、线性范围以MN9202与内标（MN9203）的峰面积比为纵坐标，以MN9202的浓度为横坐标制作工作曲线. 应用Excel软件采用最小二乘法得到细胞样品的工作曲线回归方程：Y=0.0048X+0.0592,r=0.9997，n=7(P0.01),线性范围为20~500mg/L；测定血浆样品的工作曲线回归方程（方法同上）：Y=0.0058X+0.1468,r=0.9998,n=7(P0.01),线性范围为20~500mg/L.2.4回收率和精密度当细胞中的MN9202的浓度为20,100,500mg/L的时候，方法回收率分别为（94.75±7.03）%,（100.35±2.97）%和（107.20±5.01）%.其日间精密度RSD为11.28%，6.25%，9.23%；日内精密度RSD为14.09%，4.62%，3.22%（P0.01）.当血浆中的MN9202的浓度为20,100,500mg/L的时，方法的回收率为（88.75±9.82）%,（98.09±8.58）%,（98.26±6.22）%,其日间精密度RSD为13.65%,5.88%,3.89%（P0.01）；日内精密度RSD为11.40%,4.64%,3.89%（P0.01，图1）.a:MN9202出峰，b:MN9203出峰.①空白细胞；②不含内标的标准品；（MN9202）；③测定细胞样本MN9202；④大鼠血浆浆样本MN9202测定.图1测定不同生物样本中MN9202（略）2.5不同孵育时间下MN9202在Caco2细胞中的摄取Caco2细胞对药物的摄取表明，MN9202在胃肠道容易被吸收，但其首过效应显著，从而可能对其生物利用度产生影响（图2）.图2MN9202在Caco2细胞中的摄取（略）3讨论选择细胞中MN9202的提取方法时，参考了文献所报道过的血浆中药物的提取方法［3］，因为细胞和血浆样本均存在着成分复杂，干扰较多的特点，故对细胞和血浆中的样品的提取是在分别比较了乙酸乙酯、正丁醇、甲基叔丁醚、环己烷等提取样品的情况，得出应用环己烷和正丁醇提取，所得提取液不容易挥干；用乙酸乙酯和甲基叔丁醚提取，提取溶剂中杂质太多，干扰样品的测定［2］.本文选用了乙醚作为提取溶剂，对细胞和血浆等生物样本中药物，具有提取率高，挥发速度快，杂质干扰较少的优点.二氢吡啶类药物在用分光光度计进行扫描时发现它在237nm和350nm两个波长处均存在吸收现象，并且在237nm波长处吸收更强.在本实验条件下，237nm处的吸光度值几乎为350nm处吸光度值的4倍，但血浆内源性物质等对测定有明显干扰，以往的实验都选择350nm作为检测波长，但是对于药物含量较低的生物样本而言，采用以往的方法无法实现在350nm处的信号检测.本实验选用药物具有强吸收的237nm作为检测波长，提高了检测方法的灵敏度.将流动相优化设计为乙腈和水（82/18，V/V）.实现了干扰物质、内标以及药物的基线分离. 本文建立的测定生物介质中MN9202的RPHPLC方法，经回收率、精密度及标准曲线考察，表明此分析方法具有灵敏、准确、迅速的特点.与以往对于该类药物的检测方法相比，具有明显的优点，可用于生物介质中MN9202的测定及该类药物的药代动力学研究.【