生物阴极强化氯霉素还原降解及电极微生物功能机制解析

　　生物阴极强化氯霉素还原降解及电极微生物功能机制解析第1章绪论1.1课题长期的抗生素毒性压力选择，可以诱发形成抗生素抗性细菌（ARB）并在环境生态系统中通过水平基因转移机制传播分散抗生素抗性基因（ARG）,因此增加了形成多重耐药性细菌的风险，这对于人类健康将是一个巨大的威胁[1,2]。实际上许多种抗生素在污水处理厂废水处理过程中不能被完全去除，因此污水处理厂是低浓度抗生素进入环境的重要点源[3-5]，最终增加了低残留难降解抗生素对人类和环境生态系统的暴露风险[6]。氯代硝基芳香类抗生素氯霉素（CAP）（结构式如图1-1所示）其作为有效的广谱抗生素在全球范围内已广泛的用于处理许多种致病菌，包括需氧的和厌氧的革兰氏阳性和阴性细菌。然而，由于氯霉素对于人类可以引起致命的毒性，比如再生障碍性贫血[7]，潜在的致癌性和遗传毒性[8,9]，美国食品与药物管理局（USFPA）已经禁止在食品产生的动物上使用氯霉素。虽然早在1994年就建议禁止氯霉素在食品动物中使用，但由于氯霉素的廉价性和可获得性，其在我国水产[10]、畜禽和蜜蜂等养殖业中仍然被广泛用于传染性疾病的控制，导致氯霉素在花粉、蜂蜜、养殖鱼、鲜猪肉和牛奶等检出率为31%（浓度范围为0.03-33.1g/kg）[11]。在不同国家和地区的污水处理厂的进水（26-2430ng/L）和出水（3-1050ng/L）中都可以检测出低浓度的氯霉素残留[3,12-15]。而且在我国贵阳的城市污水中可以检测到高达5.8-47.4μg/L的氯霉素残留[16]，在养猪场废水中可以检测到1.49-11.5μg/L氯霉素[17]（表1-1）。而且令人担忧的是在全世界范围内，在不同的污水处理厂，饮用水处理厂，自来水和水源水中，均可以频繁检测到氯霉素抗性基因和其它抗生素抗性基因[17-20]。这些由于抗生素残留引起的环境污染问题已经引起全球的广泛关注。因此在废水处理过程中，如何消除氯霉素的抗细菌活性和进一步降低环境生态系统进化氯霉素抗性细菌和抗性基因的可能性显得十分重要。..1.2氯霉素降解研究进展 在水溶液中使用n-型氧化物半导体作为光催化剂研究了光催化降解氯霉素。根据Langmuir–Hinshelin光催化处理完全丧失了氯霉素抗细菌活性[31]。低压汞灯作为UV照射源，Zuorro等人研究了UV/H2O2体系对氯霉素降解，当氯霉素初始浓度为20mg/L和150mg/L时，TOC降解率分别是50%和41.5%，使用细菌Escherichiacoli和Staphylococcusaureus评估降解产物毒性发现，降解过程移除了氯霉素抗细菌活性[32]。零价态双金属铁银纳米颗粒降解氯霉素研究发现，合成金属纳米颗粒可以还原氯霉素硝基基团至芳香胺产物，而且进一步发生完全还原脱氯反应；另外也可以发生脱氮发应，进一步脱掉一个氯[33]。合成银掺杂的TiO2（Ag/TiO2）纳米颗粒（煅烧温度是300℃）降解氯霉素发现，最优反应条件下20min可以完全移除20mg/L氯霉素，120min照射时间可以矿化88%的TOC[34]。21nmTiO2可以光催化氧化降解氯霉素，UV灯（254nm，0.7kI-7000，MembranesInternational，U.S.）隔开。阴阳极格室工作体积均为85mL。阳极电极材料是碳刷（直径4cm，3cm长，TOHOTENAXCo.，Ltd.，Japan），阴极电极材料是碳布（直径5cm，YB-20，YiBangTechnologyCo.，Ltd.，China）。使用碳布前先经过预处理，在1M盐酸中浸泡24小时，然后在去离子水中浸泡额外的24小时。直径为1毫米的钛丝（宝鸡力兴钛业有限公司，中国）与阴极紧密接触用于连接外电路。10精密电阻串联于电路中。除非特殊说明，阴阳极两端外加0.5V外电压，用于非生物阴极和生物阴极还原降解抗生素氯霉素实验。饱和甘汞电极（SCE,0.247V对标准氢电极（SHE），model-217，雷磁，上海精密科学仪器有限公司，中国）插入阴极室来收集阴极电位以及电阻两端的电压通过数据记录仪计数获得（model-2700，KeithleyInstru.Inc.,U.S）。本论文中报道的电极电位数据都已换算成对SHE。..2.2BES生物阴极反应器的启动与运行具有氯霉素还原能力的富集液采用哈尔滨太平污水处理厂或者美国Norman污水处理厂活性污泥进行驯化培养。10g厌氧污泥接种于200mL厌氧基础盐培养基。25℃摇床在160rpm培养一周，然后转接富集液20mL到新鲜灭菌的培养基（180mL）中，这个转接过程重复四次。最终富集液的氯霉素还原效率通过高效液相色谱（HPLC）测定培养基里剩余氯霉素浓度来确定。生物阴极是通过接种预富集的具有还原氯霉素能力的富集液接种形成。本研究的阳极都为生物阳极（生物阳极可以提供-0.2V左右对SHE电压）。为了启动生物阴极反应器，阴极室以1:3体积比接种具有氯霉素还原能力的富集液与新鲜配制的阴极液，并在外加电压为0.5 V下运行4天。随后阴极室接种同样的混合液（富集液和新鲜阴极液），这个接种过程重复5次以确保在阴极表面形成生物膜。对于生物阴极强化还原降解氯霉素途径研究中生物阴极反应器的运行，其中2个生物阴极反应器（电极和葡萄糖分别作为氯霉素还原的胞外和胞内电子供体）运行5个序批式循环，用来收集生物阴极还原降解氯霉素的数据，另外2个非生物阴极反应器（阴极没有接种富集液，阳极为生物阳极），运行5个序批式循环，用来收集非生物阴极还原降解氯霉素的数据。当生物阴极运行完成后，将BES电路断开为单纯的厌氧微生物还原模式，运行2个循环（称为开路生物阴极，葡萄糖作为电子供体），开路生物阴极实验持续120h，因此应该对阴极生物膜的微生物群落结构影响微弱。..第3章生物阴极强化还原降解氯霉素及转化途径..........363.1引言.......363.2BES还原降解氯霉素特性........363.3无机碳源供给下生物阴极还原氯霉素效率..........453.4BES阴极还原降解氯霉素途径.......473.5阴极微生物在氯霉素还原催化中的电化学证据..........493.6阴极生物膜微生物群落分析.....523.7本章小结......54第4章生物阴极还原氯霉素群落结构与功能解析..........564.1引言.......564.2生物阴极启动及其氯霉素还原效率.......564.3阴极环境对还原氯霉素生物阴极微生物群落结构的影响.........594.4不同分类水平上微生物群落结构差异分析..........664.5电子传递细胞色素C基因丰度分析........714.6其它可能参与电子传递过程基因....744.7硝基芳香烃还原相关基因丰度及多样性.......784.8抗生素抗性基因丰度........814.9本章小结......82第5章生物阴极还原氯霉素响应温度改变机制.......835.1引言.......835.2常温切换至低温下生物阴极还原氯霉素特性.......835.3常温切换至低温下阴极微生物催化活性.......895.4低温运行生物阴极稳定降解氯霉素及响应温度升高机制.........905.5低温切换至常温下阴极微生物群落结构解析.......92 5.6低温切换至常温下生物阴极功能基因解析..........995.7本章小结....106第5章生物阴极还原氯霉素响应温度改变机制5.1引言在前面两章的研究工作中，将BES生物阴极与非生物阴极系统和单纯厌氧生物膜系统相比较发现，生物阴极具有显著高的氯霉素还原降解效率和抗细菌活性丧失产物AMCl的形成效率，证实生物阴极可以强化氯霉素还原降解。基于高通量宏基因组学手段研究对比了阴极生物膜与单纯厌氧生物膜还原氯霉素微生物群落结构与功能基因组成、丰度以及微生物多样性，发现持续阴极提供电子环境显著富集能够分泌电子传递中介体乳酸球菌，参与加速阴极电子传递和氯霉素还原降解过程。虽然生物阴极可以强化还原催化氯霉素和通过阴极刺激选择性富集优势功能菌群加速阴极电子传递过程，但由于北方寒冷地区环境温度变化大，截止目前还没有研究揭示大幅度环境温度变化下（比如10℃提升到25℃或25℃降低到10℃）对于BES生物阴极还原降解抗生素催化效能影响。一般来讲，低温环境会明显降低传统厌氧生物转化效率[272]。不过最近一些研究发现BES阳极生物膜在低温比如4-15℃时仍然能够高效地产电[273,274]和产能源气体氢气[275,276]。基于生物阳极的一些低温启动研究，开展低温下启动生物阴极和研究大幅度环境温度变化对生物阴极催化降解抗生素比如氯霉素效能影响以及揭示生物阴极应激环境温度变化作用机制具有重要意义，这为在北方寒冷地区处理难降解抗生素微污染物提供理论指导。本章在常温（25℃）和低温（10℃）条件下分别启动还原氯霉素生物阴极反应器，大幅度温度变化即温度从25℃降至10℃或者从10℃升高至25℃两种温度切换后，从氯霉素还原降解水平和还原产物形成效率上对生物阴极反应器还原降解氯霉素的稳定性影响进行评估。运用功能基因芯片GeoChipv4.6和基于16SrRNA基因Illumina测序，系统研究低温启动及温度提升对于氯霉素还原生物阴极微生物群落结构以及功能基因组成、丰度、代谢潜力及微生物多样性的影响，通过对比温度切换前后阴极生物膜优势菌群差异和电子传递蛋白编码基因丰度差异，最终揭示生物阴极应激环境温度变化的作用机制。..结论 本研究证实了BES生物阴极可以强化还原降解氯霉素为脱氯芳香胺产物AMCl，对应的硝基还原和脱氯还原解除了氯霉素抗细菌活性，同时增加了生物好氧可降解性，提出了难降解抗生素废水处理技术新思路；基于高通量宏基因组学分析揭示了加速阴极电子传递还原氯霉素的核心微生物群落与关键功能基因组成。另外针对北方寒冷地区环境温度变化大特点，对比研究了低温和常温下启动生物阴极还原降解氯霉素效能，揭示了低温启动生物阴极更能应激环境温度变化和维持氯霉素稳定催化活性作用机制。本论文具体结论如下：（1）生物阴极还原氯霉素速率常数比非生物阴极和厌氧生物膜分别快10倍和1.6倍，而且产物AMCl生成效率提高，表明生物阴极可以强化还原降解氯霉素。共基质葡萄糖被无机的碳酸氢钠取代后，生物阴极还原氯霉素效率虽然低于葡萄糖存在时，但是快于非生物阴极还原过程。生物阴极与非生物阴极还原氯霉素硝基和脱氯途径有所不同，生物阴极可以定向还原硝基到芳香胺产物AMCl2，而非生物阴极还原氯霉素明显积累毒性较大的亚硝基（NO）和羟基胺基（HOAM）中间产物，然后被进一步还原为AMCl2。阴极微生物中还原脱氯酶可能参与还原脱氯反应，而非生物阴极通过阴极析氢后加氢还原脱氯。生物催化过程短暂积累独特的乙酰化氯霉素产物。生物阴极还原氯霉素过程丧失其抗细菌活性。（2）电化学分析表明生物阴极明显降低氯霉素还原过电位，暗示阴极微生物促进阴极电子传递。阴极生物膜和初始接种液中占优势的多个菌属来自α，β和γ-变形菌门，其中包括具有硝基芳香烃类还原能力（Salmonella、Enterobacter、Stenotrophomonas、Clavibacter和Pseudomonas）和阴极电化学催化活性（Enterobacter、Pseudomonas和Dechloromonas），说明阴极给电子环境选择富集到的嗜阴极微生物参与氯霉素还原降解过程。