腊梅花挥发油成分分析及生物活性初探论文

　　腊梅花挥发油成分分析及生物活性初探论文【摘要】目的研究腊梅花的挥发油成分及其抗氧化、抑菌活性。方法用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)结合Kovats保留指数(KI)对比的方法分离和鉴定腊梅花挥发油的组成和含量，通过β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系和DPPH自由基清除体系评价其抗氧化活性，滤纸片法检测其对常见细菌的抑制活性。结果共鉴定出31种成分，主要为β-石竹烯(16.06%)，Elixene(14.65%)，β-榄香烯(9.26%)和β-荜澄茄油烯(6.42%);腊梅花挥发油具有较强的抗脂质过氧化物的能力(反应180min后对亚油酸氧化的抑制率仍为52.08%)，但是对DPPH自由基的清除能力一般(反应18h后清除率仅为16.38%);抑菌实验显示其对常见的6种革兰氏阳性细菌和3种革兰氏阴性细菌均有抑制作用。结论腊梅花挥发油含有大量的活性成分，具有较强的生物学活性。【关键词】腊梅花;挥发油;气相色谱-质谱联用;抗氧化活性;抑菌活性Abstract：ObjectiveTostudythemainchemicalponentsoftheessentialoilfromthefloonanthuspraecox(L.)Linkandtheirantioxidantandantimicrobialactivites.MethodsThechemicalconstituentsoftheessentialoilfromthefloonanthuspraecox(L.)Linkethods:the1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicalscavengerandtheβ-carotene/linoleicacidbleachingtest.Theantimicrobialactivityene(9.26%)andβ-Cubebene(6.42%)respectively.Theresultsofantioxidantactivityshoin),butountofchemicalponentsthefloonanthuspraecox(L.)Linkandexhibithighbiologicalactivities.Keyonanthuspraecox(L.)Link;Essentialoil;GC-MS;Antioxidantactivity;Antimicrobialactivity腊梅Chimonanthuspraecox(L.)Link是腊梅科腊梅属落叶灌木,为我国特有,生长于亚热带湿润的常绿落叶阔叶混交林地带。腊梅属植物的叶、花都散发香气.freelonanthuspraecox(L.)Link。1.2试剂DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl)由日本东京化成工业株式会社提供;BHT由Applichem公司提供;亚油酸由Researchorganics公司提供;β-胡萝卜素购自Biochemika公司、Ta公司;甲醇、氯仿、丙酮、无水乙醇等由西安化学试剂厂提供，均为分析纯;超纯水;牛肉膏蛋白胨培养基。1.3菌种白色葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)A113，大肠杆菌(Escherichiacoli)A70，凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)A89，藤黄八迭球菌(Sarcinaluteu)A119，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)26003，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)A20，购自西安微生物研究所。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)1.1736，普通变形菌(Proteusvulgaris)1.1208，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)1.2429，购自北京微生物研究所。1.4仪器GC-MS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪，日本SHIMADZU公司产品;FZ102微型植物粉碎机，黄骅市中兴有限责任公司产品;RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品;Q/BKYY31-2000型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂产品;SL202N型药物电子天平，上海明桥精密科学仪器有限公司产品;HH-6B数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品;恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂产品;MLS-3250高压蒸气灭菌锅，SANYO公司产品;万用电炉，上海树立仪器仪表有限公司产品;共水蒸馏装置;超净工作台。2方法2.1挥发油的提取称取新鲜腊梅花830.00g，按《中国药典》2005年版Ⅰ部附录方法提取挥发油，得到浅黄色挥发油约0.89ml，密封，4℃保存，备用。2.2GC-MS分析2.2.1GC条件RTX-5MS型弹性石英毛细管(0.25mm×30m，0.25μm);柱前压75.40kPa;载气为高纯度氦气(99.999%);柱内载气流量1.26ml/min;分流比为20∶1;升温程序：从50℃开始，以15℃/min升至90℃，再以5℃/min升至280℃，保留1min;汽化室温度为250℃。MS条件：EI源，离子源温度200℃;接口温度250℃;电子能量70eV;倍增器电压0.9kV;溶剂延时4min;扫描范围40～600amu。样品稀释1000倍进样，进样量2μl。2.2.2定性定量方法各色谱峰相应的质谱图经人工解析、NIST27和NIST147谱库检索定性，利用同型分离柱(RTX-5)测定的标准物质的KI值计算各峰的KI值，同时与KI的标准文献值进行对比来确定挥发油的组分，文献中没有KI值的组分则采用质谱库检索的结果4。定量分析采用峰面积归一法计算各成分的相对百分含量。利用同型分离柱(RTX-5)测定的标准物质的KI值计算各峰的KI值4，5：KI=100n+100(tx-tn)/(tn+1-tn)式中，tx为测定物质的保留时间，n为相应正烷烃的碳原子数，tn、tn+1分别为碳原子数相差为1的正烷烃(tntxt)流出峰的保留时间(min)。2.3抗氧化活性测定β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系：取6ml0.1mg/ml的β-胡萝卜素的氯仿溶液，加入40μl亚油酸和400μ lTl去离子水，超声溶解，得乳状液A。取5ml乳状液A加入200μl2mg/mL样品腊梅花挥发油甲醇溶液，50℃孵育，检测波长470nm，180min内每隔20min测定一次吸光度。以BHT为阳性对照，每组实验均平行3次。以测定的吸光度值计算腊梅花挥发油以及阳性对照BHT在β-胡萝卜素所建立的乳化体系中的抑制率4～6。抑制率(I%)的计算可依照下面的公式。I%=(1-Rsample/Rcontrol)×100%式中，Rsample为样品腊梅花挥发油以及阳性对照BHT的降解速率，Rcontrol为实验阴性对照甲醇的降解速率;R=ln(a/b)×(1/t)，其中，t为时间(min)，a为t=0min时的吸光度，b为t=20,40,…180min时的吸光度。DPPH自由基清除体系：将2mg/ml的样品腊梅花挥发油2ml加入2×104mol/L的DPPH1ml的甲醇溶液中，50℃水浴18h后，在517nm波长测定吸光度值。以0.2mg/mlBHT为阳性对照，每组实验均平行3次。对DPPH的清除率(I%)可用下式计算3,.freelple/Acontrol)×100%式中，Acontrol为1mlDPPH溶液+2ml甲醇的吸光度，Asample为1mlDPPH溶液+2ml样品溶液、BHT溶液的吸光度。2.4抑菌活性的测定将各菌种8接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养18～24h后，制备成菌悬液，菌悬液浓度调在106～107cfu/ml。取0.lml菌液于培养基表面并涂布均匀。将直径为6mm已灭菌的滤纸片，浸于15μl的挥发油，贴于平板上，以0.5mg/ml盐酸四环素作为阳性对照。4℃放置2h后，移至恒温恒湿培养箱中37℃下培养24～36h。测量抑菌圈的直径9～11，实验重复3次。3结果3.1挥发油成分鉴定及分析GC-MS技术是植物挥发油成分鉴定的常用方法，GC-MS结合分离峰Kovats保留指数(KI)匹配的方法可大大提高化合物鉴定的准确性4～7。从表1可以看出，腊梅花挥发油以单萜和倍半萜类物质为主，占总量的78.72%，其中单萜类物质含量较少为2.82%，倍半萜类物质占总量的75.9%。β-石竹烯(16.06%)、Elixene(14.65%)、β-榄香烯(9.26%)、β-荜澄茄油烯(6.42%)、大牛儿烯B(4.53%)、α-香柠檬烯(3.93%)、δ-杜松烯(3.66%)、法呢烯(3.51%)和胡萝卜醇(2.42%)是其特征组分。并检测出的4种成分：Elixene(14.65%)、9-十八烯醇(0.60%)、9-二十六碳烯(0.30%)和土青木香烯(0.52%)在前人研究的文献中尚未见报道。表1腊梅花挥发油成分组分及其相对含量3.2抗氧化活性检测结果3.2.1β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系β -胡萝卜素/亚油酸漂白体系主要评价的是抗氧化物质在乳化脂质体系中的抗氧化能力5，6。从图1可以清晰地看出吸光度值随时间变化的规律，样品的吸光度值的下降速率要明显快于阳性对照BHT。样品腊梅花挥发油的降解速率从刚开始的61.00%下降至52.08%，吸光度值下降了0.304;而阳性对照BHT的降解速率则从开始的83.41%下降至70.76%，吸光度值下降了0.204。也就是说，通过β-胡萝卜素/亚油酸检测，样品腊梅花挥发油具有较强的抗氧化活性，但是要低于阳性对照BHT，因为它是天然的抗氧化物质，也具有进一步开发利用的价值。图1腊梅花挥发油的抗氧化活性(β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系)3.2.2DPPH自由基清除体系DPPH自由基在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其甲醇溶液在517nm附近有强吸收(显深紫色)。当有自由基清除剂存在时，孤对电子被配对，该物质颜色由紫色变为黄色，通过测定517nm处吸收的变化或观察其颜色的变化可评价自由基清除剂抗氧化活性的大小12。抑制率(I%)可以反映出对自由基的清除作用，抑制率越大，抗氧化活性越强，反之则弱。如图2所示，用β-胡萝卜素漂白法检测，样品的抗氧化能力较强，180min后样品仍具有较高的抑制率为52.08%，BHT的抑制率为70.76%。但是经DPPH自由基清除体系检测，样品在18h后抑制率从31.62%下降至16.38%，下降了15.24%;阳性对照BHT却从86.57%下降至79.89%，下降了6.68%。以上结果表明，腊梅花挥发油具有较强的脂质过氧化抑制能力，但是对自由基的清除能力一般，这可能与其挥发油的成分组成是相关的4，12。图2腊梅花挥发油的抗氧化活性(DPPH自由基清除体系与β-胡萝卜素/亚油酸漂白体系的比较)3.3抑菌活性检测结果如表2所示，腊梅花挥发油对所实验的9种常见细菌表现出不同强度的抑菌活性。其中对于白色葡萄球菌的抑制效果最明显，抑菌圈直径为23.59mm，与盐酸四环素(25.59mm)相当。对于普通变形菌的抑制能力最低，抑菌圈直径为9.28mm，远远小于盐酸四环素(18.58mm)，而对其他7种细菌的抑制能力表现适中。表2滤纸片法测定结果4讨论采用共水蒸馏装置提取腊梅花中的挥发油，并用GC-MS结合分离峰Kovats保留指数(KI)匹配的方法，准确、快速鉴定了腊梅花挥发油中的31种主要成分。腊梅花挥发油成分以单萜和倍半萜类化合物为主,占总量的78.72%;其中β-石竹烯(16.06%)、Elixene(14.65%)、β-榄香烯(9.26%)、β-荜澄茄油烯(6.42%)、大牛儿烯B(4.53%)、α-香柠檬烯(3.93%)、δ -杜松烯(3.66%)、法呢烯(3.51%)和胡萝卜醇(2.42%)是其特征组分。并且检测出4种新的成分：Elixene(14.65%)、9-十八烯醇(0.60%)、9-二十六碳烯(0.30%)和土青木香烯(0.52%)。已报道的江婷等13分析的腊梅花挥发油的主要成分为α-法呢烯(9.833%)，大香叶烯D(9.693%)，石竹烯(8.757%)和β-榄香烯(7.252%)，本实验所鉴定出的组分与结果与其在含量和组成上有一定差异，二者的特征组分也不尽相同，这可能是由于研究测试的材料来源、提取及检测方法不同所致。在β-胡萝卜素/亚油酸体系中，腊梅花挥发油在180min后仍然具有很高的抑制率(52.08%)，说明样品具有很高的抗脂质氧化物的活性。在DPPH自由基清除体系中，腊梅花挥发油的抑制率数值较低而且下降很快，表明样品对于DPPH自由基的清除能力不是很强。这可能与样品的化学组分有关，β-石竹烯(16.06%)和δ-杜松烯(3.66%)，这2个倍半萜烯具有一定的自由基清除能力，但反应速度缓慢;橙花叔醇(0.21%)的羟基属于烯丙基上的叔醇基，不但没有提供质子的能力，甚至还表现出一定的氧化性质3，12。腊梅花挥发油对革兰氏阳性、阴性细菌都具有抑制作用，通过抑制细菌的生长，就可以预防相应疾病的发生。它对于白色葡萄球菌的抑制能力最强，对于普通变形菌的抑制能力最低。抑菌活性的强弱与其化学组分有关，α-松油醇(0.67%)对很多细菌、真菌具有抑制作用，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌11;氧化丁香烯(1.95%)尽管在此油中含量较少，被认为具有很有效的抗菌特性10;另一个含量较少的单萜类物质沉香醇(0.78%)被报道它对很多种细菌、真菌具有抑制活性14，总之但是其抑菌机理还不是很清楚，有待进一步的研究8，11。总的来说，在腊梅花的挥发油中,有许多具有生物活性的物质。腊梅花具有较强的抗氧化活性，对常见的致病菌具有很明显的抑菌效果，具有较广的抗菌谱，提示了腊梅具有良好的药用价值和开发前景。本文对其抗氧化、抗菌活性进行了初步研究，不仅为阐明其作用机制提供了研究思路，也为该资源的开发提供了一定的理论依据。【