天然牛角材料之生物相容性初步概述

　　天然牛角材料之生物相容性初步概述前言生物材料是用于人体组织和器官的诊断、增进其功能的一类天然或人造材料高技术材料，它能执行、增进或替换因疾病、损伤等失去的某种功能，其作用药物不可替代[1]。生物材料在临床中的重要性日益突出，已大量应用于骨科、心血管内科、伤口护理及整形外科等多个领域。天然牛角材料属于生物衍生材料，其主要成分为含有17种氨基酸及无机元素的紧密排列的角蛋白，具有成本低、易于制备、理化性质良好等特点。曾有多位学者对天然牛角材料进行过实验研究，如韩俊艳、檀德宏等[2]证实了天然牛角材料水解物具有止血作用；郭琛琨、杨汝明等[3-4]曾将天然牛角材料作为骨移植物应用于临床。然而，评价天然牛角材料生物相容性方面的研究在国内外文献中尚无明确记载。评价生物材料生物相容性的方法众多，但其遵循的核心原则为生物安全性及功能性原则[5]。GB/T16886《医疗器械生物学评价》系列标准,是我国评价生物材料生物相容性的重要指南[6]。本实验拟通过对天然牛角材料的生物相容性进行初步研究，从而为其临床应用打下实验基础，同时探讨天然牛角材料在临床应用方面的前景。..材料与方法1实验材料、仪器、实验动物及实验地点。1.1实验材料1.1.1细胞株L-929细胞株（小鼠结缔组织成纤维细胞）：北京翠竹生物科技有限公司。1.1.2天然牛角材料浸提液：制备方法见实验方法。1.1.3实验试剂1）无水乙醇：分析纯，南京盛庆和化工有限公司。2）RPMI1640培养液：石家庄市宏伟生物技术有限公司。3）胎牛血清：浙江天航生物科技有限公司。4）0.25%胰蛋白酶：AMRESCO。5）二甲基亚砜（DMSO）：石家庄伟天科学仪器设备有限公司。 6）MTT：Sigma。7）草酸钾:郑州博轩化工产品有限公司。8)5%甲醛:徐州美尔佳环保科技有限公司。1.2主要实验仪器1)高压蒸汽灭菌器（MLS-3780）:SANYO。2)恒温水浴箱（PHB-02）：天津艾维欧科技发展有限公司。3)二氧化碳培养箱（MCO-18AIC）:SANYO。4)酶标仪（JY-14-12010型）：奥地利Thermo公司。5)倒置相差显微镜（TS100）:日本尼康。6)离心机：SANYO。7)游标卡尺：上海申韩量具有限公司。8)生物安全柜（BSC-1500IIA）：济南鑫贝西。9)CQ50超声波清洗器：上海超声波仪器厂。10)-70℃冰箱：SANYO。11)SHZ-22水浴恒温震荡器：江苏太仓医疗器械厂。12)96孔培养板:Corning。2.3急性毒实验实验动物为昆明小鼠（20只，18-25g，雌雄各半，普通级），随机分组，每组10只。实验分为2组：①实验组：天然牛角材料浸提液组，②阴性对照组：生理盐水组。进行实验前都必须将小鼠腹部用碘伏反复消毒3次。实验组每只小鼠腹腔内注入天然牛角材料浸提液（注射剂量标准为50ml/Kg），阴性对照组每只小鼠腹腔内注射与实验组小鼠同等剂量标准的生理盐水。观察指标：注射后立刻观察两组小鼠状态,注意是否出现呼吸困难、休克甚至死亡等毒性表现并称量其体重（Table5），并分别于24小时、48小时及72h后重复观察、称重。实验动物为白色豚鼠（36只，250-300g,雌雄各半，普通级），随机分组，每组12只。实验分为3组：①实验组：天然牛角材料浸提液组，②阴性对照组：生理盐水组，③阳性对照组：5%甲醛组。采用封闭斑贴法(Buechler法)进行实验：实验前24小时应剃去豚鼠背部的被毛(剔除面积约30mm30mm),诱导阶段:分别将20mm20mm敷料浸透天然牛角材料浸提液、生理盐水及5%甲醛后局部贴覆在两组动物体上,固定6小时,间隔1周重复该步骤,连续操作3周，激发阶段:最后一次贴覆14天后，再用20mm20mm敷料浸透相应溶液局部贴覆于动物去毛未试部位,6小时后去除。动物观察：观察指标（Table6-7）。.. 材料与方法.........8结果.........12附图.........15附表.........20讨论.........25结论..........28讨论在评价生物材料生物相容性方面，我国的评价标准与国际上并不完全相同，可选用的实验类型繁多，每一种实验类型又可有多种具体的实验方法。因此，国内外不同学者在研究不同生物材料时采用的实验方法不尽相同。在选择实验方法时，应首先选择以动物体外实验为主的实验（如体外细胞毒性实验），这类实验实验具有实验条件易于控制、实验周期短、能够得到可观且准确的实验数据等优点，然后在此基础上进一步选择动物体内实验（如动物体内植入实验）。本研究是参照GB/T16886《医疗器械生物学评价》系列标准来设计的，以下分别对所选实验及其结果加以讨论。20世纪40年代，就曾有学者在研究生物材料生物相容性是用到了细胞毒性实验。至今，细胞毒性实验凭借其操作简便、结果可靠等优点，成为了评价生物材料生物相容性方面的重要实验指标。Johson曾研究指出，在评价生物材料的细胞毒性方面，体外实验比体内实验更有优势[10]。进行细胞毒性实验可选择的细胞有多种，如L-929、CCL1、CCL171、V-79等，本研究选用的L-929细胞株。L-929细胞由Earle等学者于1948年从小鼠的结缔组织中分离出来的，具有易于体外培养传代、易于储存等优点，曾于1982年ASO就将其列为在细胞毒性实验中应用的标准细胞[8]。细胞毒性实验种类繁多，可分为细胞形态学观察实验、细胞膜效应实验、细胞代谢活性实验、细胞增殖率实验等。..结论 本实验结果表明天然牛角材料无细胞毒性、无溶血作用、无毒性、无明显致敏作用，初步证实了：在本实验条件下，天然牛角材料具有良好的生物相容性。做为修补骨缺损替代材料、骨折内固定材料必须具备的条件为：(l)具有良好的生物相容性；(2)无不良的免疫反应；(3)具有稳定的理化性质，植入体内后不被腐蚀、不易变形；(4)具有良好的骨功能性；(5)术后X检查不受影响；(6)材料充裕、成本低，容易制备。目前常用的替代材料临床效果均存在不满意之处，天然牛角材料有可能成新型的替代材料。