第八章 生物碱类药物的分析

第八章生物碱类药物的分析PharmaceuticalAnalysisofalkaloids一、概述（一）定义：生物碱是一类存在于生物体内的含氮有机化合物。（二）分类1.芳烃胺类硫酸苯丙胺，精神振奋药pKb=9.9盐酸麻黄碱，肾上腺受体激动药pKb=9.62.异喹啉类盐酸吗啡，镇痛药pKb1=8.0，pKb2=9.9磷酸可待因，镇痛镇咳药；盐酸黄连素，抗菌药；度冷丁等3.喹啉类硫酸奎宁，抗疟药；异构体硫酸喹尼丁，抗心率失常药；pKb1=5.07，pKb2=9.74.托烷类硫酸阿托品，抗胆碱药pKb=9.9氢溴酸东莨菪碱，抗胆碱药pKb=7.6；5.黄嘌呤类咖啡因，pKb=14.15（碱性极弱）；茶碱，平滑肌松弛药，含活泼氢酸性；6.吲哚类硝酸士的宁，中枢神经兴奋药pKb1=6.0，pKb2=11.7（酰胺）硫酸长春新碱，抗肿瘤药；利血平，抗高血压药；7.其他类硝酸毛果芸香碱，缩瞳药。由上可知，生物碱类药物有如下特点。（三）特点1.数量多，绝大多数存在于植物体内；已发现3000多种，100多种有效，中成药中富含生物碱。2.生理活性强，但大都有毒性 因此，质量控制和临床应用尤应慎重，许多为特殊管制药物，并已超出药物分析的范畴，体育运动中的兴奋剂问题，世界关注的毒品问题，许多是生物碱类成分。该类药物的质量应严格控制，以保证用药的安全和有效。我们药物分析学所关注的是其结构特征和利用这些特征，建立相应的鉴别、检查和含量测定。（四）结构特征和分析方法间的关系1.碱性：N原子的存在，强弱从N上的取代基是供电子还是吸电子基团，空间位阻两方面考虑。1）一般情况：季铵>仲铵>伯铵>叔铵>NH3>环酰铵2）脂肪铵>脂环铵>芳铵3）个别两性化合物如吗啡有酸性（酚羟基），茶碱只有酸性（活泼氢）2.存在状态多数以盐的形式存在1）植物中多与有机酸成盐如吗啡罂粟酸盐，鞣酸奎宁盐；2）药用多为多为无机酸盐如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸盐。含量测定应考虑上述2个因素，碱性强弱选择滴定溶液和指示剂，成盐的情况在非水滴定时要考虑对滴定的干扰。3.溶解性1）共性：游离生物碱易溶于CHCl3等中等极性有机溶剂，难或不溶于水，溶于稀酸溶液；成盐易溶于水；2）个性：两性和酸性化合物易溶于稀碱溶液（吗啡和茶碱）；麻黄碱和咖啡因能溶于水；咖啡因和利血平碱性极弱，不能与酸结合成稳定的盐。溶解性可以用于提取分离和鉴别时的重要依据。4.光谱特点1）旋光性多含不对称碳原子，故有旋光性，药效学研究表明许多手性药物一般效用不同，或药效有强弱、或效价低、或无效，甚至有毒副作用。如今手性合成和分离是药学研究的热点和难点之一；2）紫外吸收多含不饱和双键。5.与生物碱沉淀试剂和显色试剂反应上述是生物碱类药物的一般共性。6.取代基的性质（个性） 1）氨基醇（苯丙胺、伪麻黄碱）（1）还原性：可与高锰酸钾等氧化剂反应生成甲胺，有碱性；（2）双缩脲反应：硫酸铜和氢氧化钠试液反应生成蓝紫色配位化合物；2）酚羟基（吗啡）Marquis反应硫酸-甲醛氧化成醌，显色；3）酯的结构（托烷类）Vitaili反应如阿托品水解成莨菪酸，可与发烟硝酸共热，生成黄色硝基衍生物。4）奎宁类（喹啉类）绿奎宁反应，微酸性水溶液，滴加Br2或Cl2水，加过量氨水，呈翠绿色；5）异喹啉类（黄连素）热碱（NaOH）作用，转变为季铵盐碱性及其互变异构体，呈橙红色，与丙酮作用，生成黄色沉淀；6）黄嘌呤类（咖啡因）紫脲酸铵反应，HCl，KClO3，加热放出氨气呈紫色，加碱消失；7）吲哚类生物碱（士的宁、利血平和长春新碱）呈吲哚颜色反应，如与香草醛试剂反应。二、鉴别（一）熔点鉴别法熔点测定是一种常用初步鉴别药物的方法，在药典附录中都规定有详细的测定方法。所测熔点受结晶和测定条件影响大，有许多化合物的熔点相近，易混淆，所以，利用反应生成难溶于水的衍生物，测熔点，增加专属性，来帮助判断。生物碱类常用四苯硼钠和芳磺酸类与之反应，测熔点。方法：供试品水和冰醋酸酸化过量四苯硼钠水浴70℃沉淀过滤干燥测熔点。（二）旋光鉴别手性碳原子旋光测定鉴别（旋光度）方法：供试品水一定浓度测旋光度α，计算比旋度，与标准对比对照鉴别。旋光度随温度、光源、波长、溶液浓度和厚度、溶剂等影响。中国药典95版规定，用钠光谱的D线（589.3nm），管长度2dm，温度20℃，测旋光度，计算的供试品的比旋度。[α]tD=100α/l·Cl：长度单位，dm；C：浓度单位，g/100ml；D：钠光谱D线；t：温度。 比旋度的定义：测定管长度为1分米，每ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定波长与温度下测定的旋光度。该法可用于鉴别、检查和含量测定。小结：物理方法我们已学习了紫外-可见分光光度法、熔点法，旋光法，TLC，IR，HPLC等。（三）沉淀反应和显色反应常用生物碱沉淀试剂：KI-I2，KBiI4，KhgI3和苦味酸（三硝基苯酚）试液，其他还有磷钨酸、磷钨酸钼、鞣酸、HgCl2等试液，通过沉淀颜色和结晶情况，用于鉴别或互相区别；显色试剂：甲醛硫酸试液，浓硝酸、浓硫酸等等，通过氧化，脱水，缩合等反应显色，用于鉴别，也可用于TLC的显色剂。三、含量测定我们已知，多数生物碱类药物均以成盐的形式作为原料，简写为BH+·A-，游离生物碱的碱性较弱，而所用酸为无机酸，酸性强，从广义酸碱理论可以认为是个强酸弱减性的两性药物，从化学分析角度，可用强碱置换弱减滴定，即置换滴定，课后自学；同时，生物碱盐的弱减性一般为pKb8~10，可以用非水HClO4直接滴定。利用游离生物碱溶于有机溶剂，盐溶于水的性质，我们可用萃取方法，经分离后测定，即提取中和法。利用生物碱盐在一定的pH条件下，与酸性染料定量反应形成离子对，且离子对易溶于有机溶剂的性质，进行酸性染料比色法测定。（一）非水溶液滴定法各国药典大部分采用此方法，使滴定突跃明显，并能溶解游离生物碱。1.原理：BH+·A-+HClO4=BH+·ClO4-+HA2.方法：供试品精密称定（≈消耗标准液6~8ml）冰醋酸10~30ml溶液，0.1mol/LHClO4滴定至终点。（指示剂或电位法指示终点）3.讨论1）适用范围：pKb在8~10之间，小于8可用水溶液滴定，大于10用醋酸作溶剂无明显突跃，一般不能滴定，绝大多数生物碱在8~10；若要滴定pKb大于10 的生物碱，需加入醋酐作溶剂，咖啡因pKb为14.5，BP、USP和ChP均采用醋酐作溶剂进行非水滴定测含量；2）酸根的影响生物碱盐中被置换出的无机酸，只有在HAc溶液中为弱酸，才能使反应定量完全，或说反应到底，才不影响HClO4的滴定，若不是弱酸，怎么办？我们先看一下在冰醋酸中，酸性的强弱情况高氯酸>氢溴酸>硫酸>盐酸>硝酸>硫氢酸根>磷酸以下醋酸中为弱酸（1）硝酸在冰醋酸中为弱酸，能使反应完全，不影响滴定，但硝酸要氧化指示剂，干扰滴定，且突跃不明显，用电位指示终点（2）氢溴酸和盐酸为强酸，存在使反应无法定量进行，可加入醋酸汞冰醋酸溶液，形成难以解离的HgX2，而使反应完全，排除干扰。（3）硫酸一级电离是强酸，二级电离是弱酸，在冰醋酸中显示为一元酸，滴定至硫氢酸盐，因此，要注意滴定度的计算，一元生物碱的硫酸盐用高氯酸滴定时是1：1mol反应；若是二元生物碱时是1：3mol反应，计算滴定度时要除以3；也有人用氯化钡除去硫酸根，在滴定，以1：2mol反应。3）方法评价（1）简便、快速，尤其适合原料；（2）专一性差，实际上是置换滴定，滴定阴离子；（3）硝酸要注意氧化性，用电位法。（二）提取中和法1.原理和方法：供试品水溶液氨水、氯仿氯仿层，蒸干，测定1）提取：加氨试液等使生物碱游离，用有机溶剂氯仿等定量提取，蒸干后；2）直接滴定；3）剩余酸量法加过量酸溶解，碱回滴。2.讨论1）碱的选择：多用NH3·H2O，太弱，游离不完全；太强有影响（1）若是两性生物碱（吗啡），强碱溶于水；（2）有些生物碱中有酯的结构，易水解；（3）萃取使易乳化，不易分层。 2）提取溶剂应与水互溶性小，易溶解形成的离子对，不易乳化，常用氯仿为提取溶剂；3）指示剂的选择等电点的pH值应在指示剂的变色范围内；3.方法评价1）专一性经分离后测定生物碱，有一定专一性；2）缺点费时，繁琐。（三）置换滴定（课后自学）1.原理生物碱水溶液用0.01mol/LNaOH直接滴定强碱置换出生物碱，由于生物碱的碱性在pH8~10，常用酚酞作指示剂。2.影响因素1）生物碱的碱性强，干扰指示剂终点的变色范围；2）游离生物碱不溶于水，使溶液混浊，影响终点的观察；3.解决方法1）加乙醇使生物碱碱性减弱；2）加氯仿等有机溶剂，提取溶解生物碱；此种方法由于存在两相，所以，又称双相滴定。（四）酸性染料比色法1.原理在一定pH值条件下，生物碱盐的阳离子和酸性染料的阴离子定量结合生成配位化合物，即离子对，此离子对易溶于有机溶剂，经有机溶剂（氯仿等）提取后，比色测定含量。（BH+）W+（ln-）W（BH+·ln-）W（BH+·ln-）O2.方法中国药典95版，氢溴酸东莨菪碱的含量测定3.讨论1）pH值的选择是本法至关重要的条件（依据原理的反应式讲解）（1）pH值过低抑制酸性染料的解离，使ln-浓度太低，影响离子对的形成；（2）pH值过高生物碱呈游离状态，不利离子对的形成。2）酸性染料的选择1.能定量完全反应；2.形成的离子对在有机溶剂中有较好的溶解度；（3）常用溴麝香草酚蓝和溴甲酚绿。 3）有机溶剂的选择氯仿常用1.与水难混溶；2.离子对提取率高，难溶酸性染料；（3）离子对溶液的吸收率高。4）水分的影响严防水分混入有机溶剂中，水相中有有色的有机染料，并能是氯仿浑浊，影响比色。5）酸性染料的浓度只要不产生乳化，增加浓度可提高测定灵敏度；6）有色杂质的排除可先用有机溶剂提取酸性染料中有色杂质。（五）色谱分析生物碱类药物可用GC和HPLC法测定。四、近几年生物碱类药物的研究进展近几年来，生物碱类药物分析的研究文章，主要集中在2各方面，药典药品主要是体内药物分析，包括尿、血液等；另一类是生药或中（成）药中生物碱的分析。研究的方法主要为紫外可见分光光度法（包括新技术）、HPLC、TLC、GC等，容量分析方法只有表面活性剂滴定法，此外，还有荧光分析，电化学分析，旋光法，流动注射分析，近3年，有CE分析的文章。分光光度法91-93年：28篇；93-95：27篇；95-97：20篇；HPLC91-93年：20篇；93-95：36篇；95-97：43篇；GC91-93年：8篇；93-95：4篇；95-97：5篇；TLC91-93年：60篇；93-95：19篇；95-97：18篇；其他91-93年：15篇；93-95：6篇；95-97：11篇。从上可见，生物碱类药物的分析，和近年来药物分析的发展一致，对象集中在复杂介质的分析，方法中HPLC越来越占有重要的地位，TLC应用减少，因此，对我们药物分析工作要求越来越高。同时，必须注意，各种新技术新方法在药物分析中得到成功应用，毛细管电泳法的应用呈上升趋势。本章小结summaryInthischapter,welearnedpharmaceuticalanalysisofalkaloids.Afterlearningmoreabouttherelationshipbetweenthestracturecharateristicsandanalyticalmethods,wehavemainlystudiedthemethodofidentificationsuchasmeltingpointofderivativesandpolarimetry,andthemethodofassaysuchastitration methodofnonaqueoussolution,extraction-neutralizationandcolorimetryofacidcolor.Thelasttwomethodsbelongtothetypeofassayingbyseparating.Theyaremorespecificity,butunconvenience.Throuthhavingknowntheadvantageandshortageofabovemethod,weshouldusecorrectlymethodaccrodingtothedemandofanalysisinourjobinthefuture.