生物物质分离工程实验 - 生命科学学院- 湖北大学

湖北大学生物物质分离工程实验（0704300793）实验教学大纲（第2版）生命科学学院生物学实验教学中心2010年8月前言 课程名称：生物物质分离工程实验实验学时：30学时适用专业：生物工程；生物技术；课程性质：专业基础必修一、实验课程简介植物生物学实验主要包括植物的形态解剖，系统分类及与环境的关系实验内容学习，以及相关的实验仪器设备使用操作；植物结构层次包含有细胞.组织.器官.个体.种群.群落.系统类群，植物分类阶元涉及界.门.纲.目.科.属.种。技能方面主要包括解剖观察，分类鉴定，相关仪器设备用具的操作使用实训。二、课程目的生物物质分离实验课是生物技术、生物工程专业本科教学中的一门重要专业基础实验课，通过实验教学可以加强学生对专业基础知识和基本理论的理解，了解和掌握生物物质分离纯化的原理、方法及应用，培养学生正确记录实验数据和现象、正确处理实验数据和分析实验结果的能力。实验要求学生独立操作，仔细记录观察并完成实验报告。三、考核方式及成绩评定标准考核方式：设计性实验报告和操作成绩评定标准：设计性实验报告和操作（占50%）+其它实验报告（占30%）+实验表现（占20%）。四、实验指导书及主要参考书1、生物分离工程实验刘叶青主编高等教育出版社2007.82、酶制剂生产与应用杨昌鹏主编中国环境科学出版社2006.83、自编部分实验内容五、实验项目实验项目一览表 序号实验项目名称实验类型实验学时必做/选做实验一鸡蛋清中溶菌酶的提取及纯度鉴定综合性3必做实验二鸡蛋黄中卵磷脂的分离纯化和鉴定综合性3必做实验三双水相萃取系统中聚合物分子量对相图的影响综合性3必做实验四影响双水相萃取系统相体积比因素综合性3必做实验五双水相萃取系统中蛋白质分配系数的测定-1综合性3必做实验六双水相萃取系统中蛋白质分配系数的测定-2综合性3必做实验七离子交换树脂的预处理及交换容量的测定综合性3必做实验八有机溶液萃取法中pH对表观分配系数的影响综合性3必做实验九离子交换法提取抗生素的工艺研究-1设计性3必做实验十离子交换法提取抗生素的工艺研究-2设计性3必做实验一鸡蛋清中溶菌酶的提取及纯度鉴定（3课时）实验类型：综合性实验目的：掌握从蛋清制备溶菌酶的原理和方法（等电点沉淀和盐析法）。实验内容：由于蛋白质在等电点时溶解度最低，所以蛋白质的沉降在等电点附近最为显著。若控制溶液的pH在等电点附近，并增加盐的离子强度，使蛋白质处于沉降前的“临界状态”，在适当的温度下，静置若干时间，蛋白质会以结晶的形式从溶液中析出。加入晶种，能控制晶体的形状、大小和均匀度，若结晶液浓度太低而结晶发生困难时，可适当加入些晶种，能使结晶顺利进行。实验要求：1、溶菌酶晶种的制备：2、实验器材的准备：组织捣碎机（或电动搅拌机）、纱布、大烧杯、玻璃棒、冰箱、pH试纸、真空干燥器、多用循环水真空泵、布氏漏斗等。3、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。实验二鸡蛋黄中卵磷脂的分离纯化和鉴定（3课时）实验类型：综合性实验目的：1、了解卵磷脂的性质。2、学习提取卵磷脂粗品的方法。实验内容： 机体的各种组织和细胞均含卵磷脂。在蛋黄（约10％）、神经、精液、脑髓、骨髓、肾上腺、心脏、蘑菇和酵母等组织内含量很高。卵磷脂分子中具有亲水基团和疏水基团，卵磷脂具有降低表面张力的作用；卵磷脂被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，蛋黄卵磷脂可将胆固醇乳化为极细的颗粒，这种微细的乳化胆固醇颗粒可透过血管壁被组织利用，而不会使血浆中的胆固醇增加，可作为药物用于动脉粥样硬化等疾病的综合治疗。实验要求：1、实验药品的准备：（1）试剂：新鲜蛋黄、95％乙醇、10％的NaOH溶液、丙酮、乙醚。2、实验器材的准备：磁力搅拌机（或玻棒）、减压真空浓缩装置、恒温水浴锅、冰箱、多用循环水真空泵、布氏漏斗、玻璃漏斗、玻璃棒、小烧杯等。3、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。实验三双水相萃取系统中聚合物分子量对相图的影响（3课时）实验类型：综合性实验目的：掌握用浊点法制作双水相系统相图的方法，加深对相图的认识。实验内容：两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，相图是研究双相萃取的基础。相图是一条双节线，当成相组分的配比取在曲线下方时，系统为均匀的单相，混合后溶液澄清透明，称为均相区；在曲线的上方时，能自动分成两相，称为两相区；若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。而聚合物分子量的大小会影响相图的位置和形状，通过改变聚合物PEG分子量的大小，来绘制相图。实验要求：1、实验器材及试剂：（NH4）2SO4溶液、PEG400、PEG6000、蒸馏水、漩涡振荡器、微量滴管装置、电子天平、微量注射器、大试管、移液管等。2、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。实验四影响双水相萃取系统相体积比的因素（3课时）实验类型：综合性实验目的：1、了解双水相系统形成的机理及常用的双水相系统2、掌握双水相系统中相比的测定方法，巩固离心机的操作方法及注意事项。实验内容：双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成,与一般分离纯化技术相比,双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点，在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离纯化等方面受到广泛重视，是一种有发展潜力的易于工业化应用的生物分离技术。常用的双水相系统有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。分成两相后，上下相体积比称为相比，相比增加，上相和下相相对组成的差别就增大，这将会极大地影响产物如酶在两相中的分配系数，使酶富集于上相。通过改变聚合物的分子量和无机盐的比例，来测定相体积比，探讨影响相体积比的因素。 实验要求：1、实验器材及试剂：（NH4）2SO4固体、PEG400液体、PEG600固体、糖化酶滤液、电子天平（或台秤）、台式离心机等。2、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。实验五、六双水相萃取系统中蛋白质分配系数的测定（6课时）实验类型：综合性实验目的：1、掌握蛋白质在双水相系统中分配系数的测定方法2、了解蛋白质与考马斯亮蓝的显色反应原理及应用，进一步巩固可见分光光度计的操作及制作标准曲线。实验内容：双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物质在两相中不同的分配，可以实现它们的分离；生物大分子在双水相中上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Ct/Cb）；分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素影响。考马斯亮蓝与蛋白质可结合形成蓝色复合物，在595nm有最大光吸收，并且在低浓度时，吸光值与蛋白质浓度服从比尔定律。将上述实验四种得到的不同相体积比，分别取上相和下相溶液，测定其中蛋白质的含量，并计算分配系数。实验要求：1、实验器材及试剂：牛血清蛋白溶液、考马斯亮蓝染色液、蒸馏水、实验三中分离得到的上下相、可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、试管及试管架等。2、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。实验七离子交换树脂的预处理及交换容量的测定（3课时）实验类型：综合性实验目的：1、通过实验加深对离子交换树脂的重要性能之一总交换容量的认识。2、掌握离子交换树脂的作用原理。3、学会离子交换树脂的预处理方法。4、熟悉静态法、动态法测定离子交换树脂总交换容量的操作方法以及四种离子交换树脂总交换容量的操作方法。实验内容：交换容量是离子交换树脂质量的重要标志，本实验测定的是离子交换树脂的总交换量也叫最大或极限交换量，它是指树脂经过100℃/105℃干燥至恒重后，每克或水中每ml树脂的具有的可交换离子的总数，单位为毫克当量／克（干树脂）或ml （温树脂）即（meq/g或mL）。离子交换树脂交换量最简单的测定方法是酸碱滴定法。氢型阳离子交换树脂与碱作用时生成水，为一不可逆反应、故可用于静态法测定交换容量。RH+→RNa+H2O阴离子交换树脂不能采用类似的方法测定，应用氯型树脂，当它与Na2SO4作用时，生成NaCl，这一反应为可逆反应，故宜采用动态法测定树脂交换容量。R（=NHCl）2＋Na2SO4=R（=NH）2SO4＋2NaCl。滴定流出液中Ｃｌ－含量来测定其总交换容量。实验要求：1、实验器材及试剂：5%NaOH、5%HCl、0.1MNaCl标准溶液、1MHCl标准溶液、1MNa2SO4溶液、甲基橙指示剂、K2CrO4指标剂、蒸馏水、强碱（717）和弱碱阴离子交换树脂、强酸（732）和弱酸阳离子交换树脂、0.1MAgNO3标准溶液、恒流泵、层析柱、滴定管、精密天平、烘箱、容量瓶、三角瓶2、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。实验八有机溶液萃取法中pH对表观分配系数的影响（3课时）实验类型：综合性实验目的：1、通过实验，加深对表观分配系数的理解并掌握其测定方法。2、以螺旋霉素为实验对象，了解pH在萃取工艺中的重要性。实验内容：1、螺旋霉素为大环内酯类抗生素，分子结构中有2个碱性基团，其pK1=7.1，pK2=8.4，呈弱碱性，在不同pH条件下，在水溶液和有机溶液中溶解度不同，故能达到不同程度的分配。表观分配系数是指在一定温度和压力下，当分配达到平衡时溶质在萃取相和萃余相中总浓度之比，可通过实验方法测定。对于弱电解质，溶液的pH对表观分配系数影响很大。一元弱碱性物质溶液pH对表观分配系数K的关系式见式（1-6-4）式中：K0——热力学分配系数，在一定的温度和压力下是常数pk——化合物电离平衡常数的负对数由上式可知，随溶液pH升高，K值增大，有利于螺旋霉素萃取到有机溶剂中。反之，K值减小，可将螺旋霉素从有机相反萃取到水相。2、利用螺旋霉素经硫酸水解后，生成紫红色，并在480nm波长处有最大吸收值的特性，可测定其化学效价，从而计算出表现分配系数。实验要求：1、实验器材及试剂：精密电子天平，60ml分液漏斗，分光光度计，恒温水浴锅，pH酸度计，移液管，烧杯，量筒，试管，50ml容量瓶，称量瓶和温度计等。螺旋霉素成品和标准品，乙酸乙酯，乙酸丁酯，氯化铵，氨水，95%乙醇和硫酸等。2、二人一小组，独立操作，并完成实验报告。 实验九、十离子交换法提取抗生素的工艺研究（6课时）实验类型：设计性实验目的：1、了解离子交换树脂的工作原理和工艺条件的选择。2、掌握旋光仪工作原理和操作方法3、以庆大霉素为实验对象，研究pH对交换容量的影响，并作树脂的吸附流出曲线和解吸曲线。最后计算离子交换树脂的工作交换容量。实验内容：1、了解和掌握庆大霉素的理化性质。庆大霉素为中等强度的五元碱性抗生素，分子结构中有5个氨基C1组分的pK值分别为6.65、7.55、8.31、9.22、9.95，在不同pH的水溶液中可以6种电化学状态存在，当pH﹤4.5时，庆大霉素电离成5价正离子；当pH﹥12时，以游离分子状态存在，故可采用离子交换法进行提取。2、掌握离子交换法分离抗生素的原理。3、选择合适的离子交换树脂：庆大霉素的碱性性质决定了它应该采用阳离子交换树脂。本实验选择大孔弱酸DK110阳离子交换树脂（丙烯酸型），树脂的pK值为5.7左右。它对庆大霉素的交换容量大，解吸容易，洗脱峰集中。4、交换条件的选择：料液由恒流泵打入离子交换柱，调节泵的转速使达到所要求的料液流速，经离子交换后的流出液由自动部分收集器分段收集，设定每管收集时间，使每根试管中的体积达到预定的数植（或者利用部分收集器的计滴程序，使每根试管达到预定的体积）。实验要求：1、实验器材及试剂：离子交换层析柱，恒流泵（蠕动泵），自动部分收集器，pH酸度计，自动旋光仪，烧杯和量筒等。庆大霉素成品和标准品，DK110树脂，浓氨水，NaOH、HCl和旋光仪等。2、设计实验方案，提交实验药品清单，自己安排时间完成。3、二人一小组，独立操作，并对结果进行分析和讨论同时完成实验报告。