吉他霉素生物合成基因簇克隆与基因工程菌株创建

　　吉他霉素生物合成基因簇克隆与基因工程菌株创建第一章文献综述1.链霉菌简介在b大小,约为大肠杆菌的两倍[3]。链霉菌的G+C含量高达70-74%，是已知自然界中G+C百分比最高的生物之一[4]。链霉菌的模式菌株之一天蓝色链霉菌A3（2）（StreptomycescelocorA3(2)）的基因组测序已经完成，经过分析，天蓝色链霉菌A3（2）的整个基因组共包括8667507个碱基，编码7825个基因，是迄今为止含有基因数目最多的微生物，这其中又含有近20个已知或可能的与链霉菌次级代谢有关的基因簇，而且，调节基因在所有基因中所占的比重也是最高的[4]。目前已经完成的链霉菌基因组计划已经有50种。随着越来越多的链霉菌基因组的测序工作完成，人们对链霉菌的认识也将更加清晰，链霉菌也将更好的被人类所利用。人们对链霉菌的研究包括化学生物学、分子生物学和遗传学的兴趣主要因为以下几个方面：1.链霉菌作为一种放线菌的主要类群是研究细菌基础遗传学，特别是研究基因表达在时间和空间上分化调节的重要材料：有些基因组在生长早期就开启，有些很晚才启动；有些在营养菌丝阶段起作用，而有些在孢子发育时起作用。正如前面所述，放线菌在很长一段时间被认为是介于细菌和真菌之间的物种是因为它同时具有细菌的单细胞特征，同时又具备高等真核的真菌在发育和分化方面的特征，比较真菌，对它的分化调节方面的研究更为容易和直观。2.链霉菌染色体的结构特点也具有代表性，通过对链霉菌的染色体和染色体外基因组的研究也获得了重要发现，链霉菌染色体DNA的某些特定片段可发生异常的大型扩增，并伴随着碱基对的缺失和性状的改变，它的端粒的特殊结构等。3.链霉菌及其近似的生物物种在人类生活方面的重要贡献，包括应用在医疗，兽医，植物保护等方面的抗生素以及工业生产酶制剂等。研究链霉菌的天然活性产物的生物合成可以使得生产产量的提高和通过遗传改造来产生新抗生素成为可能[4]。2．聚酮类化合物（polyketides）的生物合成 聚酮化合物一般指的是由细菌、真菌和植物等生物利用初级代谢所产生的多种低级的羧酸单元，活化后利用连续的醇醛缩合反应而形成具有一定长度的聚酮碳骨架，并进行多种修饰反应，包括还原、脱水、成环、甲基化、酰基化和糖基化等，从而形成的一类具有生物活性的次级代谢产物。聚酮化合物是结构和功能最多样化的天然产物之一，在核磁共振技术和质谱技术发展的支持下，超过10，000种的聚酮类化合物的结构得到了鉴定[5]。在聚酮类的化合物中，抗细菌的就有红霉素和四环素等，抗真菌的如制霉菌素和灰黄霉素等，杀虫的阿维菌素和梅岭霉素等，抗肿瘤的烯二炔类抗生素和柔红霉素等，做为免疫抑制剂的雷帕霉素和FK506等。这些具备多种活性的聚酮类化合物已经被广泛的应用到医药、农业和畜牧养殖业等。2.1聚酮化合物和脂肪酸的生物合成聚酮化合物的生物合成基本途径的开展并不早，远远晚于和它采用相似的合成机制的脂肪酸的合成研究历史。1967年，Light用两株Penicilliumpatulum的无细胞提取物（Cell-FreeExtract，ECT）和碳14标记的丙二酸辅酶A作用生产6-甲基水杨酸，三分之一的放射性出现在羧酸基团，这证实了聚酮化合物的乙酰聚丙二酸的合成机制[6]。而1970年是个重大突破，Dimroth等人从P.patulum中分离和纯化6-甲基水杨酸合成酶，酶能够利用乙酸辅酶A、丙二酸辅酶A和NADPH作用生成6-甲基水杨酸，但是当反应体系中缺少NADPH的时候，只能生成3个乙酸内脂，这表明6-甲基水杨酸合成过程中的还原反应是发生在最后一个丙二酸A缩合发生之前[8]。第二章吉他霉素生物合成基因簇的克隆和分析1.引言 对由微生物生产的天然产物抗生素进行结构改造，一是可以利用生产的抗生素做为中间体进行进一步的化学合成，这种生产方式成本提高，而且污染严重，不符号现代人们对绿色GDP的追求；另外一种方法就是利用基因的遗传操作，通过改变抗生素生物合成过程中的催化酶基因的序列（增加、减少和改变）来产生出非天然的天然产物。通过培养基和发酵工艺的优化可以在一定水平上提高微生物发酵生产抗生素的产量，然而这种提高非常有限；而传统的诱变育种等手段的微生物育种费时费力；通过基因工程手段（改变调控因子、敲除抑制基因和敲除原料竞争产物的基因等手段）可以迅速的提高抗生素的生产水平。以上通过基因工程手段的新型微生物药物的创新方面和新型微生物药物高产育种的多种优势十分明显，但这需要首先了解抗生素的生物合成途径，克隆生物合成的基因簇，分析各个基因的功能并加以利用才能实现，因此，开展对吉他霉素这种具有重要应用价值的抗生素研究，其生物合成基因簇的克隆和功能分析就显得非常迫切。本研究中的各种菌种都是采用低温甘油保藏，无菌棉签用无菌的20％甘油浸湿后，在北里链霉菌或者其它链霉菌长满孢子的固体平板上刮下孢子，直接悬浮于装有一定量体积20%甘油的菌种管中并剧烈振荡分散后，于-80℃保存。大肠杆菌经液体培养后收集菌丝体保存在-20℃的20%甘油中。3.2链霉菌总DNA的少量快速提取将培养好的链霉菌菌丝体用12000r/min离心5分钟，然后用50μl溶菌酶溶液重新悬浮10mg菌丝体，在37℃温育约50分钟，或温育至细胞成为半透明状。加入50μl2%SDS，混合振荡约1分钟直到溶液的粘度显著下降，37℃温育20分钟，然后加入25μl中性苯酚/氯仿，混合振荡均匀后，12000r/min离心5分钟，移取上清液，弃去白色中间层。用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，最后加入0.1倍体积的3M醋酸钠（自然pH），混合后加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），再次混合后在室温下放置5分钟（或者在-20℃放置30分钟），将絮状沉淀用牙签挑出，用70%乙醇洗涤DNA沉淀块两次，最后弃去所有上清液，待乙醇挥发后，用一定量TE缓冲液充分溶解DNA沉淀。第三章吉他霉素工业菌株的基因..................94-1071引言..................942材料与方法..................94-962.1菌株..................94-952.2质粒..................952.3大肠杆菌和北里链霉菌之间..................95-962.4北里链霉菌的发酵培养..................963结果与讨论..................96-1063.1增加正调节基因拷贝提高吉..................96-983.1.1包含kitK和kitL的质粒构建..................96-983.1.2含有多拷贝kitK..................983.2克隆血红蛋白基因(Vgb)..................98-1003.3克隆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因..................100-1013.4北里链霉菌基因工程菌株..................101-1064.本章小结..................106-107第四章总结和展望..................107-109 结论本研究工作结论如下：1.克隆出完整的吉他霉素生物合成基因簇在脱氧己糖合成途径中普遍存在一步反应，由葡萄糖-1-磷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷三磷酸反应生成dTDP葡萄糖。由于吉他霉素的化学结构中也存在着两个脱氧己糖，mycarose和mycaminose。因此推测出它的生物合成途径也存在着这个酶。利用这一点，设计了可以扩增此dTDP-葡萄糖合成酶基因的PCR引物，从构建的北里链霉菌基因组文库中克隆出了完整的吉他霉素生物合成基因簇。2.推论出吉他霉素的生物合成和调节途径通过生物信息学手段，预测了整个生物合成基因簇中的开放阅读框，序列相似性比对得逞各个基因的功能，推导出吉他霉素结构中聚酮糖苷部分和脱氧己糖部分的合成途径和特殊聚酮延伸单元甲氧基丙二酸酰基载体蛋白的合成模型。并且找到了两个吉他霉素生物合成途径专一性调节因子kitK和kitL。3.克隆出天蓝链霉菌的腺苷甲硫氨酸合成酶基因、全局性转录调节基因adpA、颤细菌的血红蛋白基因和吉他霉素的专一调节基因kitK和kitL。利用在链霉菌中的整合型载体，分别构建出能够在北里链霉菌中稳定表达这些基因的质粒。4.构建出4株高产稳定的基因工程菌株将构建的表达质粒通过结合转移的方式导入到吉他霉素生成菌株北里链霉菌1-9F，构建出四个基因工程菌株。生物量和效价测试表明这些菌株和出发菌株相比有大幅度提高，其中表达腺苷甲硫氨酸合成酶基因的工程菌株提高44％，传代培养证实了这些基因工程菌株的遗传稳定性。