大三生物实验思考题

生命科学学院生物技术基地班李晨学号:11420430121.实验室常用的离心技术包括哪三种，各自分别有什么优点？差速离心:通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。优点：样品的处理量较大，可用于大量样品的初分离。缺点：分离复杂样品和要求分离纯度较高时，离心次数多，操作繁杂。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中间损失，所以离心分辨力差。实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染，对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯。产品的纯度和回收率都达不到理论值。密度梯度离心:用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。包括等密度梯度离心和不连续密度梯度离心。优点：：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。等密度梯度离心:离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。优点：①分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。②可以分离复合蛋白质，可以分离出处于不同结合状态的同一蛋白。2.一个典型的蛋白质或酶提取液包括有哪些组分，这些组分各起什么作用？在实验室里通常使用什么试剂？分为离子强度调节剂，pH缓冲剂，温度效应剂，蛋白酶抑制剂，抗氧化剂，重金属络合剂和增溶剂。离子强度调节剂与pH缓冲剂：使蛋白质或酶尽可能处在体内环境的离子强度和pH值条件，使蛋白质或酶保持与体内相同的天然结构。实验室常用的试剂为含0.1-0.2M的Nacl或Kcl的PBS或TBS.温度效应剂:防止过冷过热会引起蛋白质或酶分子变性失活。实验室常用试剂为甘油、二甲亚砜。蛋白酶抑制剂：抑制细胞破碎释放出来的内源性蛋白酶，避免其将目的蛋白质或酶降解。实验室常用试剂为苯甲基磺酰氟（PMSF）.抗氧化剂 生命科学学院生物技术基地班李晨学号:1142043012:防止细胞破碎后，目的蛋白质或酶被空气中的氧气所氧化，失去其天然结构。实验室常用试剂为β-巯基乙醇、二硫苏糖醇。重金属络合剂：避免金属离子引起的酶蛋白变性失活。实验室常用试剂为EDTA、EGTA(螯合钙离子)。增溶剂：使膜蛋白溶解，细胞内容物释放。实验室常用试剂包括离子型去垢剂SDS、LDS、胆酸钠和脱氧胆酸钠；非离子型去垢剂Triton-100、吐温等。3.根据去垢剂的分子特点可以将其分为哪三种类型？它们各自的分子特点是什么？在蛋白质研究中有什么作用？去垢剂是能使蛋白质变性的一类化学物。去垢剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，分为离子型去垢剂，非离子型去垢剂和两性去垢剂。分子特点及作用：离子型去垢剂含有带电荷的极性基团,又可以分为阳离子去垢剂和阴离子去垢剂,容易受到溶液离子成分的影响,可能会与离子交换柱相互作用,干扰蛋白质的纯化。所以利用离子交换柱纯化膜蛋白时,需要使用非离子型或者两性离子型的去垢剂。非离子型去垢剂含有不带电荷的亲水极性基团,基本不受溶液中离子成分影响,能够破坏脂质分子间以及脂质分子与膜蛋白间的相互作用,但是不会破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用,因而常用于膜蛋白的活性分离和纯化。两性离子型去垢剂同时具有离子型和非离子型去垢剂的一些特点:一方面,两性离子型去垢剂的极性基团不带电荷,不会同离子交换介质相互作用;另一方面,两性离子型去垢剂又能破坏蛋白质与蛋白质间的相互作用。4.SDS-PAGE测定蛋白质亚基分子量的原理是什么？①在电泳前蛋白质会进行煮沸变性，使蛋白质的二三级结构破坏，使各亚基之间分离。②SDS-PAGE胶是由丙烯酰胺单体聚合成聚合态，形成网状，起到分子筛的作用，③蛋白质会与SDS形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，复合物在一定的电场中发生位移，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。④电泳会使不同大小的蛋白之间分离，再和标准分子量蛋白(Marker)对比，就可以得到待测蛋白质（亚基）的分子量了。5.紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250染色法和福林-酚试剂法是三种实验室常用的测定蛋白质浓度的方法。这三种方法的原理分别是什么？各自分别有哪些优缺点？①紫外吸收法：蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值 生命科学学院生物技术基地班李晨学号:1142043012）与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。优缺点：紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。此法测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差,故本法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。②考马斯亮蓝G-250染色法：是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm,蛋白质在1～1000μg范围内,蛋白质－色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。优缺点：该法方法简便,易于操作,所用试剂较少,显色剂易于配制。干扰物质少,如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ-球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。③Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发展，所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨蓝混合物(呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg。优缺点：优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多。缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。而且，耗费时间长，操作要严格计时，颜色深浅随不同蛋白质变化。6.分离核酸的一般步骤是先破碎细胞，再解聚核蛋白并去除蛋白质，最后沉淀核酸并去除其它杂质。苯酚和氯仿是最为有效的蛋白变性剂，但在具体使用中为何要将苯酚，氯仿和异戊醇配合使用？使用苯酚抽提细胞DNA时，苯酚的作用是使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 生命科学学院生物技术基地班李晨学号:1142043012氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇是因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，由于苯酚会部分溶于水，浓度可达到10%-15%，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。7.观察经琼脂糖凝胶电泳分离的核酸片段常用溴化乙啶染色。染色的方法包括哪些？各自有一些什么样的特点？染色后观察的紫外线波长分别是多少？各波长的观测灵敏度和对核酸分子的损伤作用如何？染色的方法包括胶染法，泡染法和点染法三种。胶染法是在制胶的过程中加入EB染料，当核酸在胶中电泳运动时会与胶中的EB进行反应。EB会插入到碱基对中。特点：此方法染色可以准确确定片段分子量，用量相对较少。泡染法：在电泳缓冲液中加入一定浓度的EB，制备成染色溶液。将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10～30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液处理（避免染料吸附在玻璃表面上）。特点：用泡染法染色时，可以精确确定核酸片段分子量。但是使用EB量太大。点染法：将EB染料与点样样品按照一定的比例进行混合，再进行点样电泳。特点：用点染法染色时，灵敏度最高，染料用量最少。但大片段稍有滞后现象，测定分子量不如另外两种方法精确。观察核酸的紫外光波长分别为254nm，300nm和360nm三种波长8.为什么机械剪切力和RNA酶分别是分离DNA和RNA的主要影响因素？在实际操作中可以采取哪些措施和办法防止这些影响因素对核酸分子的破坏作用？分离DNA和RNA时，会将DNA与蛋白质、RNA与蛋白质分离开，DNA、RNA的天然结构遭到破坏，其折叠遭到破坏，会以一级结构链状形式所存在，相对于折叠状态而言链状结构的DNA与RNA更容易受到剪切力的破坏，磷酸二酯键更容易被机械剪切力切断；去折叠后的DNA和RNA酶切位点会暴露出来，更容易被酶所识别、剪切，而且DNA、RNA酶广泛存在，比如空气中、汗液中、唾液中等。因此机械剪切力和RNA酶分别是分离DNA和RNA的主要影响因素。采取措施：减小剪切力的影响：提取基因组DNA时操作必须轻柔，如需混匀液体，只能用缓慢滚转的方法进行，切勿振荡或用手弹。提取缓冲液中加入蔗糖、氯化钾和镁离子以提供对RNA分子的保护 生命科学学院生物技术基地班李晨学号:1142043012，蔗糖会增加溶液的粘稠度，间接减小剪切力的影响。减小RNA酶的影响：提取RNA时更需要小心，戴新的塑胶手套和口罩，在灭过菌的操作台进行，使用的加样枪头、EP管和水都必须用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过，最后的RNA沉淀用DEPC水溶解。