外排泵msra在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用

　　外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用【关键词】表皮葡萄球菌物被膜红霉素耐药性0引言表皮葡萄球菌（简称表葡菌）引发的医院感染已得到人们的日益关注，虽然表葡菌分泌的毒性因子较金黄色葡萄球菌少，但其粘附在多聚材料上，形成生物被膜而引发的感染却呈现慢性、持续性、反复性和难治性的特点［1］.生物被膜的产生使膜内菌对抗生素的耐药性比浮游菌增加10～1000倍,其引发的感染常常只有移走植入物才能控制［2］，但其对抗生素的耐药机制目前还不十分清楚.外排泵msrA是浮游葡萄球菌对MLSB类抗生素耐药的主要机制之一,我们探讨外msrA在生物被膜内细菌对红霉素耐药性中的作用如下：1材料和方法1．1限制缺陷型菌株StaphylococcusaureusRN4220，Staphylococcusepidermidis1457(产生物被膜,ica+,红霉素MIC0.25mg/L)和穿梭载体pBT2由美国MichealOtto教授惠赠；野生株S68（产生物被膜，msrA+,红霉素耐药MIC32mg/L）.根据msrA全长（GenBankNo.X52085），设计引物并在两端加SalⅠ和BamHⅠ酶切位点（F5′AAAAGTACTgatctttgtacttagagatat3′；R5′CGGGATCCgatcggttatggtactattg3′），以菌株S68为模板扩增msrA,PCR反应条件：94℃5min，94℃1min，46℃1min，72℃90s，32个循环后，72℃7min.PCR产物凝胶纯化后，连于pMD18T载体并测序验证.将pMD18TmsrA质粒和pBT2质粒用SalⅠ和BamHⅠ双酶切后，将长度为2.0kb的msrA片段和6.9kb的pBT2质粒DNA片段连接后，转化入E.coliDH5α感受态细胞，用含Amp（100mg/L）和Em（20mg/L）的LB琼脂平板筛选，挑选菌落增菌提取质粒后，用SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定；同时PCR扩增msrA鉴定.DL2000DNAmaker,Taq酶（DRR001A）和PCR试剂均购自TaKaRa公司.1.2.1S.epidermidis1457pBT2/msrA株的构建取S.epidermidis1457新鲜增菌液1mL接种于25mLBmedium（含蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖1g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾1g/L）37℃震荡培养至A600nm0.8.收集细菌用灭菌三蒸水和100mL/L甘油溶液洗涤后，用800μL甘油(100mL/L)溶液悬起，以每管70μL分装于灭菌Eppendorf管，-70℃保存.取-70℃ 保存的金黄色葡萄球菌RN4220感受态细胞于室温融化.每管加入重组质粒pBT2+msrA6μL（100mg/L），轻轻混匀，室温放置30min，将细菌转入0.2cm电转杯，电击1次（电压2kV，电容25μF，电阻100Ω），通电时间约为2.4ms.迅速加入0.9mLBmedium悬起细菌，37℃震荡培养3h，取100μL涂于含Cm（20mg/L）的Bmedium琼脂平板，37℃倒置培养24h后，挑取克隆，接种到5mL含抗生素的LB液体培养基中，振摇培养12～16h，用Qiagen质粒抽提试剂盒提取质粒，SalⅠ和BamHⅠ酶切鉴定.采用Qiagenplasmidmidikit从金黄色葡萄球菌RN4220中提取50～100μg质粒，按上述方法电转化S.epidermidis1457感受态细胞，用含Cm（10mg/L）和Em（10mg/L）的Bmedium琼脂平板筛选阳性克隆.1.2.2S.epidermidis1457msrA的鉴定提取质粒用SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定.提取基因组DNA，PCR鉴定:msrA（1887bp）引物同前和icaA（814bp）引物为：5′GACCTCGAAGTCAATAGAGGT3′，5′CCCAGTATAACGTTGGATACC3′.95℃变性5min，95℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环后，72℃延伸7min；肉汤稀释法测量S.epidermidis1457和S.epidermidis1457msrA菌株的红霉素最小抑菌浓度,按常规方法操作，标准菌株StaphylococcusepidermidisATCC12228;采用KB纸片琼脂扩散法检测S.epidermidis1457和S.epidermidis1457msrA株对氨苄西林、苯唑西林、四环素、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素的药物敏感性，根据抑菌环直径的大小按NCCLS（2005）标准判读.将S.epidermidi1457和S.epidermidis1457msrA株接种于刚果红［3］培养板，检测其产膜特性.1.2.3细菌生物被膜的形成［4］和实时定量RTPCR将新鲜增菌液稀释至光密度为0.2（600nm），取5μL接种于已置于Bmedium平板上的0.2μm聚碳酸酯微孔滤膜上（直径约25mm），35℃孵育48h，滤膜及所生成的生物被膜每隔12h转移到新的平板上.聚碳酸酯微孔滤膜（IC），并在红霉素作用24h前后取样，放入细菌RNA保护液（Qiagen）中,尽快提取总RNA.将S.epidermidis1457msrA和S68菌株增菌24h后的浮游菌和生物被膜红霉素作用前后样品，用QiagenRNeasyminikit提取总RNA.使用RNasefreeDNaseset（Qiagen）去除样品中的基因组污染.采用TakaraSYBRExScriptTMRTPCRKit进行实时定量PCR检测浮游菌，膜内菌红霉素作用前后msrA基因的表达，以16SrRNA为内对照.采用DNAstar设计引物为：msrA5′AAGCCAGTAAAGCTAAACGAAATC3′，5′ TTTTGATGCACTTAAACGATCTGG3′；16SrRNA5′CCATGTGTAGCGGTGAAATGC3′，5′ACATCAGCGTCAGTTACAGACC3′.使用1457msrA浮游菌总RNA样品转录成cDNA梯度稀释为100,10,1,0.1,0.01ng/L作为标准品，进行RealTimePCR反应，制作16sRNA标准曲线和cDNA梯度稀释为100,10,1,0.1,0.01μg/L作为标准品，制作目的基因的标准曲线.检测各标本Ct值，根据标准曲线计算样品目的基因的浓度，分别用16SrRNA和1457浮游菌各目的基因表达量进行校准获得相对表达量.使用没有逆转录的反应作为对照鉴别是否有基因组污染.操作时每份样品重复3次.统计学处理：数据用x±s表示，采用CHISS2004统计软件组内前后比较采用配对t检验，组间比较采用t(t′)检验.2结果2．1重组质粒pBT2msrA电转入S.epidermidis1457全长msrA（1887bp）从野生菌株S68中扩增后，克隆入pMD18T，测序验证其序列的正确性；将序列正确的msrA克隆入pBT2（6970bp)载体，筛选出的阳性克隆质粒经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，分别得到6970bp和1887bp的DNA片段，证明pBT2msrA重组质粒构建成功（图1）.首先将重组质粒电转化入金黄色葡萄球菌RN4220，经SalⅠ和BamHⅠ双酶切，0.8g/L琼脂糖电泳证明正确后，从RN4220中抽提高浓度的质粒电转入S.epidermidis1457，经抽提质粒酶切、电泳证明分别为6970bp和1887bp片段（图2）.KB纸片琼脂扩散法检测其对氨苄西林、苯唑西林、四环素、环丙沙星、庆大霉素、氯霉素药物均敏感，与S.epidermidis1457相同；对红霉素耐药，最小抑菌浓度为16mg/mL；msrA（1887bp）和icaAPCR（814bp）扩增阳性（图3）；刚果红培养均产黑色带干结晶体菌落.　2.2实时荧光定量RTPCR表葡菌1457msrA和野生株S68膜内菌红霉素作用前后msrA表达未见统计学差异（P>0.05,表1）.表1实时荧光定量RTPCR检测表葡菌1457和S68msrA表达水平aP<0.05vs膜内菌EM作用前.3讨论浮游细菌暴露于抗生素、低水平ATP（如营养耗尽、饥饿等）或高水平ATP（如NaCl高渗等）恶劣环境下，为了生存常常会通过上调外排泵、全面调节子（globalregulator）和看家基因等的应激反应而尽快适应环境.质粒编码的外排泵MsrA最早是在表葡菌中发现，并广泛存在于葡萄球菌尤其是在凝固酶阴性葡萄球菌中. MsrA由488个氨基酸组成，含有2个ATP结合点，是浮游葡萄球菌对MLSB类抗生素耐药的主要机制之一［5-6］.我们发现，野生菌株S68（msrA+）生物被膜内细菌红霉素（10倍MIC）作用前与作用后，msrA的表达没有显著性差异，表达水平均低于浮游菌.为了排除野生菌株中不明确的因素对膜内菌msrA表达的影响，验证包裹在生物被膜内的表葡菌红霉素耐药性的增加是否与msrA的表达相关，我们从野生株中克隆了msrA全长基因，并通过穿梭载体将其电转化至限制缺陷菌株金黄色葡萄球菌RN4220，提取质粒后再转化S.epidermidis1457（ica+，产膜阳性菌），得到S.epidermidis1457msrA，经鉴定除携带红霉素耐药性（MIC16mg/L）以外，其它药物的敏感性和产膜特性与1457相同.野生株S68和S.epidermidis1457msrA菌株浮游菌msrAmRNA的表达高于膜内菌（P<0.05），膜内菌msrA的表达红霉素（100mg/L）作用前后未见统计学差异，提示尽管浮游菌中msrA的表达可使细菌产生红霉素抗性，但在生物被膜内特殊环境中膜内菌对红霉素耐药性的增加与外排泵基因的上调相关性不显著.类似的结果在大肠杆菌中也有报道，MairaLitran等［7］通过对比大肠杆菌外排泵acrAB缺失株和亲本株生物被膜内细菌对环丙沙星的敏感性，报道了acrAB表达的上调与膜内菌耐药性增加无关,其机制目前还不清楚.生物被膜对抗生素的耐药机制是一个复杂而未知的调控系统，可能与细菌生物膜的屏障作用、膜内菌生长缓慢与应激反应［8-9］,细菌间群体感应系统［10］等多种因素相关，研究结果显示不同细菌形成的生物被膜和使用不同的抗生素，其耐药机制也不相同.【