滇池鱼类关键环境内分泌干扰生物富集及毒性效用分析

　　滇池鱼类关键环境内分泌干扰生物富集及毒性效用分析第一章绪论1.1环境内分泌干扰物简介EDCs的内分泌干扰作用与人类的许多疾病相关，如繁殖率下降、肥胖、心脏病、糖尿病、免疫功能下降、肿瘤及神经缺陷等。此外，在鱼类、两栖类、鸟类和哺乳动物中均发现了与EDCs效应直接相关的生物损害，如生殖紊乱、性器官变形、性逆转、雌性化等[3，11'12]。目前，EDCs在我国引起的环境污染及健康危害问题也已引起了全社会的广泛关注。2010年，国际环保组织绿色和平发表了题为《毒隐于江一长江鱼体内有毒有害物质调查》的水污染调查报告。调查报告显示，在取自长江上、中、下游重庆、武汉、马鞍山和南京四个城市的鲤鱼和餘鱼体内，均测出一定含量的壬基酷（Nonylphenol，NP)和辛基酴（Octylphenol，0P),这两种EDCs均可导致雌性性早熟等发育和生殖系统问题[13]。2009年，％11等[14]报道了广东省清远地区田螺、好、鱼和水蛇等生物体中多溴联苯醚（PolyBrominatedDiphenylEthers,PBDEs)的污染水平，总含量在52.7-1702.0ng/g，与世界其他地区相比，该区域生物体内该种EDCs的污染较严重，有可能影响人体神经和内分泌系统。2004年，211011等[15]从珠江三角洲水域釆集罗非鱼、鲤鱼、鲢鱼和草鱼等样品，分析检测发现鱼体中多氯联苯(PolychorinatedBiphenyls，PCBs)的浓度超过USEPA的响应标准。1.1.1环境内分泌干扰物的和种类EDCs部分来自自然释放的植物雌激素，但更多的是人为排放，如农药生产、化学工业合成、石油炼制等过程。EDCs进入环境后，主要分布于空气、水和土壤中，并通过食物链网迁移到各个角落，构成对人类和动物的巨大威胁。空气中的EDCs主要来自于焚烧垃圾、生产过程中的原料泄漏、建筑材料和日用品的挥发等；水中的EDCs主要来自于工业废水，生活污水以及大气中EDCs的湿沉降；土壤中的EDCs主要来自于工农业活动和人类的其它社会活动[16]。目前确定有数百种化合物属于EDCs,根据其主要分为以下3类：（1)自然化合物，如动物和人体内天然存在的雌激素、植物性雌激素和真菌雌激素(2)合成激素药物，包括口服避孕药和在绝经期后用于治疗的替代类固醇药物，如己稀雌酷(Diethylstilbestrol, DES)[丨8]和乙炔基雌二醇等；（3)人造化合物，如农药类（杀虫剂、除草剂和杀菌剂）用作绝缘油的PCBst22]、用作阻燃剂的多溴联苯(PolybrominatedBiphenyls,PBBs)和PBDEs[2324]、用作树脂原料及增塑剂的双酷A和邻苯二甲酸酷类[25，26]，用作表面活性剂的院基酷类化合物(Alkylphenolpounds,APs)和垃圾焚烧产生的多环芳烃（PolycyclicAromaticHydrocarbons,PAHs)[28]等。其中，酷类EDCs在环境中的污染较严重，前期研究表明滇池水体中存在着一定的i分类EDCs污染；类固醇类EDCs的雌激素效应、生物毒性和危害最为明显，因此选择类固醇类和酴类这两种典型的EDCs作为本论文的目标化合物。1.1.1.1类固醇类环境内分泌干扰物类固醇类EDCs是脂溶性生物活性物质，具有类固醇类环，即环戊焼多氧菲[29]。这类物质化学性质稳定，有很强的内分泌干扰作用，在生物体内富集能力强，对生态环境造成较显著的影响。类固醇类EDCs中环境危害较大、最具代表性的化合物主要包括人和动物体内天然存在的雌酮（Estrone，El)；雌二醇（17v5-Estradiol,E2)、雌三醇（Estriol,E3)和人工合成的17-a-乙块基雌二醇（17-a-ethynylestradoil,EE2),这四种物质化学结构很相似，最主要的差别是C-3、C-16和C-17位置上的基团种类和空间化学结构的不同（如图1-1)。类固醇类EDCs具有高效活性，在极低环境浓度下（1ng/L)也会对生物体产生巨大的影响，即它们进入祀细胞后，与体内激素竞争性地结合留类受体，形成激素-受体复合物，然后进入细胞核与DNA结合，发挥生物学作用，改变细胞功能，扰乱生物体内分泌系统的正常代谢。1.1.2环境内分泌干扰物对鱼类的影响鱼类是水生态环境中重要的组成部分，处于水生生态系统食物链的顶端。由于水体中:EDCs的增多，已经对鱼类的生存和繁衍构成了严重的威胁，因此研究EDCs对鱼类的影响，对于保护鱼类资源和生态环境具有重要的意义。目前，大量的研究表明EDCs对鱼类的毒性效应主要体现在生长发育、性别分化和繁殖等方面[34]。1.1.2.1生长发育鱼类 早期发育阶段是鱼类最敏感的发育阶段之一，对外界环境的影响抵抗力较弱，因此很容易受到污染物的毒害而出现发育减缓、死亡的现象，严重的EDCs污染还可以导致鱼类大量死亡。通过捕搜污水处理厂和造纸厂出水口附近以及污染严重水体中的鱼会发现一系列生长发育毒性效应，包括死亡率的增加和生长状况的改变[35_37]等。此外，实验室通过对典型EDCs进行暴露实验，得到了与野外调查相一致的效应。如EE2、E2、0P、NP和BPA已被证实可以影响青鏘[38]、斑马鱼黑头软口鲦[4i]等实验鱼类的生长发育。第二章生物样品分析方法的建立2.1引言目前，国内外生物样品中EDCs的分析方法以生物法居多，如酶联免疫分析法(ELISA)和放射性免疫分析法（RIA)。但生物法存在很大的局限性，它不能同时检测多种化合物，由于交叉反应，给出的结果往往不够精确，而且对实验操作要求严格，影响因素多，重现性不好，实验成功率低。生物样品因其基质的复杂性和杂质的干扰性，而致使其EDCs的分析检测成为了较大的挑战。因此建立生物样品中准确、灵敏的同步化学分析方法已成为EDCs研究的重点。本章建立了生物样品中8种类固醇类和酷类EDCs(El、E2、EE2、E3、4-M3P、4-CP、4-NP和BPA)的化学分析方法。整个过程包括生物样品的采集、提取（微波辅助萃取）、浓缩纯化（凝胶渗透色谱、固相萃取）、衍生化和仪器检测（气相色谱-质谱联用）等步骤，分析方法的流程如图2-1。为了提高方法回收率，应控制并选择微波萃取条件（萃取溶剂、萃取溶剂用量、萃取温度、萃取时间等），优化固相萃取条件（萃取柱、洗脱溶剂等），准确选择凝胶渗透色谱净化的收集时间，并解决气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)分析生物样品回收率低、干扰大等主要问题。在前期水样品的研究中，衍生化及GC-MS等环节已经取得一定结果。因此，生物样品分析方法的建立主要是考察微波辅助萃取、凝胶渗透色谱净化、固相萃取以及对实际生物样品分析的应用。第三章滇池野外调查研究...................70-843.1引言.................703.2实验部分.................70-733.2.1仪器与试剂703.2.2研究区域及采样点.................70-723.2.3样品的采集.................723.2.4分析方法.................723.2.5质量控制与质量保证.................72-733.2.6数据处理.................733.3结果与讨论.................73-823.4小结.................82-84 第四章滇池网式放养研.................84-924.1引言.................844.2实验部分.................84-884.2.1仪器与试剂.................84-854.2.2实验鱼类及暴露网箱.................854.2.3样品的采集.................85-874.2.4分析方法.................87-884.2.5数据处理.................884.3结果与讨论.................88-914.4小结.................91-92第五章城市污水处理厂出水暴露.................92-1045.1引言.................92-935.2实验部分.................93-955.2.1仪器与试剂.................935.2.2污水处理厂简介.................935.2.3实验鱼类及暴露网箱.................935.2.4样品的采集.................93-945.2.5分析方法.................945.2.6数据处理.................94-955.3结果与讨论.................95-1025.4小结.................102-104结论本论文以滇池水体中普遍存在的类固醇类和酹类EDCs为切入点，在建立完善的生物样品分析检测方法的基础上，深入研究典型鱼类中EDCs的生物富集和毒性效应。将环境分析化学与污染物暴露引起的毒理学效应相结合，综合评估滇池水体中EDCs的生物效应和环境风险。主要研究结果如下：(1)建立了生物样品中类固醇类和酷类EDCs的分析方法，主要包括微波辅助萃取、凝胶渗透色谱净化、固相萃取、衍生化和GC-MS检测。该方法的检出限为0.3-0.7 ng/g，精密度为2.3%-12.7%，平均回收率为51.5%-100.6%，可以满足生物样品中痕量有机污染物分析的要求。应用该方法对急性暴露鱼样中类固醇类和酷类EDCs进行分析检测，8种暴露物质在鱼肉中均能检出，验证了本方法应用于环境生物样品中痕量类固醇类和酷类EDCs定量测定的可行性。与其它化学分析方法相比，本方法引入了自动凝胶渗透色谱净化技术，简化操作的同时改善了净化效果，具有更高的回收率和精密度。(2)滇池鱼类中存在着不容忽视的EDCs污染，部分ED类固醇类和酷类EDCs的污染水平，发现银白鱼中目标化合物浓度最高，是鲫鱼肌肉中浓度的2-3倍，鲤鱼介于银白鱼和鲫鱼之间。比较不同组织中类固醇类和酣类EDCs的浓度，发现其富集能力呈现肝脏>鲍>肌肉这一规律。在已知水体和鱼类肌肉中酷类EDCs浓度的基础上，计算出滇池鱼类中酌类EDCs的BCF值为18-97。通过类固醇类EDCs实验室BCF值和肌肉中的浓度，预测出滇池水体中类固醇类EDCs的浓度为4.4-18.0ng/L,与部分水体中己报道的浓度较接近。(3)昆明市城市污水处理厂出水存在着一定浓度的EDCs，暴露鱼类中EDCs的富集浓度可作为衡量水体中该类物质毒性效应和风险的评价指标。昆明市城市污水处理厂出水中EDCs的污染较滇池网式放养对照严重，对暴露鱼类产生了一系列的生物效应，如性腺生长的抑制，通过诱导肝脏合成Vtg而导致HSI的增加，以及血菜中Vtg含量的升高。此外，发现毒性效应生物评价指标的变化与污水处理厂出水中类固醇类和酷类EDCs在鱼体内的富集积累程度有关。(4)高背鲫鱼对典型EDCs具有较强的敏感性，可以作为潜在的模型动物用于EDCs的野外及实验室暴露研究。E2和EE2对高背鲫鱼鱼苗的96hLC50分别为0.403mg/L和0.149mg/L,EE2对高背鲫鱼的致死毒性比E2大，根据鱼类急性毒性试验毒性标准可判断E2和EE2对于高背鲫鱼是高毒物质。实验室长期低剂量E2和EE2暴露对高背鲫鱼产生了显著的生物富集作用和毒性效应（生长状况和性腺生长的抑制、HSI和血菜中Vtg含量的增加），EE2单一暴露对高背鲫鱼生长状况、脏器指数和血菜中Vtg含量的影响较E2单一暴露更明显，高背鲫鱼对EE2单一暴露更敏感。E2和EE2复合暴露并没有显著影响暴露物在高背鲫鱼肌肉中的富集。低浓度E2和EE2复合暴露对脏器指数和Vtg含量的影响强于单一物质暴露，但低于单一暴露诱导作用的加和。