生物化学课程论文

1引言以生物技术为特征的生物制药是近10年来发展最快的高新技术产业之一。它是将某一特定编码的天然或合成的核苷酸序列，利用有高度特异性的限制性内切酶和连接酶插入到质粒、病毒等载体中，形成重组的遗传物质，然后再把带有遗传物质的载体转移到宿主细胞使其增殖和表达。影响外来基因在新宿主细胞中表达的因素是复杂的，不同的培养条件与不同的提纯方法等均会影响最终产品的质量。因此生物技术产品可能含有用传统生产方法不可能存在的有害物质，所以这类产品的质量控制与传统方法生产的产品有本质的差别。它的出现给药物的生产带来了一场革命，推动了整个药业的发展。世界药品市场结构在未来10年内将发生重大变化。1.1生物技术在高质量中药和天然药物原料的研究生产及中药材资源可持续利用中的应用生产具有国际竞争力的现代中药，其源头是有高质量的中药原料。现代中药必须严格保证所用的药材原料无污染，农药残留和重金属含量在十分安全的范围内，药效物质基础的含量稳定可靠并有严格的质量标准。根据这些要求，国际上正积极地在探索《药材生产管理规范》(GAP)的实施。把”绿色中药材”的生产看成是可持续农业中的一个组成部分；积极发展生物防治，推广有机肥料，提倡植物性农药及低毒、易降解农药，注意保护生态及生物圈的平衡。就中药资源而言，必须抓住挽救、研究和合理利用这三个环节。在实现以上要求的过程中，生物技术应用具有重要的意义和潜力。1.1.1基因研究是中药资源保护、种植和可持续利用的重要手段 我国中药资源达1.2万余种，其中药用植物有1.1万余种(含亚种、变种)，药用动物近1600种，药用矿物80种。这些种中药材中部分涉及到珍稀濒危物种，仅就全国重要的10个植物园及药用植物园中已引种中草药3000多种，其中有50种属于78种珍稀濒危中草药的范围，占我国389种珍稀濒危植物的13%，因此对珍稀濒危中药材物种的挽救、保护与合理利用迫在眉睫。迁移珍稀濒危动、植物至饲养地和植物园是保证物种的重要方法，建立相应的基因库用于保存药用动、植物的基因，考察物种的变异具有重要意义，如郑丽屏等提出了药用植物种质资源的试管保存方法及试管苗基因库的建立。有报道用带有35S-1uc嵌合基因质粒包被的钨颗粒轰击石斛原球茎，三周后，向转化组织中加入荧光素，通过筛选和数轮生长，证明荧光素酶基因已整合到植物基因组中，这项研究提示我们可将影响名贵和需要共生生物的物种生长的相关基因整合到该植物中去，形成新的高抗性或变共生生长条件为单独生长条件，使那些需要特殊生境的名贵紧缺中药材能在通常环境下生长。1.1.2酶工程是中药和天然药物活性成分生产追求的最佳技术手段之一就疗效明确的单一天然活性成分而言，能够通过工业化生产获得天然复杂结构单一产物是人们追求的目标，但天然化合物结构复杂，常有多个不对称碳原子，合成难度较大或合成条件苛刻；而酶工程为这类成分的获得提供了新的途径。如金东史等利用酶转化方法将人参中的主要皂苷成分转化成含量只有十万分之几的人参皂昔Rh2：，并达到了月产30kg的生产规模；李继衍等利用酶法进行了伪麻黄碱的生物合成并实现了产业化。2生物转化及生物组合化学为以天然活性成分为先导发现新药提供了新的思路与方法对于复杂结构的天然活性成分来说，利用化学合成来进行结构修饰存在着得率低、反应专一性差、副产物多等缺点，特别是有些反应目前利用化学手段较难实现。生物转化技术可以弥补化学合成的不足，1997年Khmelnitski利用盐活化生物催化剂(Salt—activedthemo1ysin和Candidaantarctia)脂酶，成功地在有机相中进行了紫杉醇系列衍生物的生物合成。由此可见，生物转化技术在以天然活性成分为基础的创新药物研究与开发中具有重要的意义。组合化学(CombinatorialChemistry)是近年来在化学和药物基础研究领域兴起的一门新研究分支，被化学家认为是合成大量供生物活性筛选化合物最有效的新技术。它最大的优点是比经典有机合成能更快速、有效地合成大量化合物和众多同系物。同时，组合化学和快速活性筛选技术(high—throughputscreening)的结合也加速了药物化学的发展。可以说组合化学是现代化学技术与生物学技术有机结合在发展现代药物研究中范例。 在我国自行开发的化学药物前体相当部分来源于中药活性成分的研究，天然产物一般结构复杂，不易简单合成，利用化学法进行结构修饰获得高活性新化合物，费事费力。如何结合我国医药研究的具体情况，建立一套快速、经济、命中率高的新药研制和筛选手段，是促进我国医药研究开发的关键问题。我们将天然药物的生物转化研究与组合化学理论相结合建立了生物组合化学(Bio—combinatorialchemistry)研究方法，并将其用于复杂天然药物的筛选和研制，通过与高效快速药物筛选手段结合，发掘便于知识产权保护的，具有中国研究特色的新天然高效活性先导化合物。通过生物组合化学概念的提出，经对具有明确生物活性又有中国药物研究特色的天然复杂化合物或活性组分的研究，使这些化合物(或组分)在具多种反应催化酶的微生物或酶的作用下转化产生新的组合型天然化合物群。再通过与药理筛选手段结合，寻找新的高活性或低毒性的天然活性先导化合物，或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。近三年来，在国家自然科学基金的资助下我们先后对延胡索生物碱、贝母生物碱、青篙素类化合物等进行了研究并取得了良好的结果。如利用多种含不同催化功能酶体系的微生物对延胡索中镇痛活性成分延胡索乙素进行了生物转化研究，结果证明用筛选出的菌株转化所得的新组合型天然化合物群，经与等量底物进行镇痛活性比较，活性优于底物，说明新产生组合型天然化合物群转化产物中可能有活性高于底物的转化产物。在此基础上，我们通过制备规模发酵，再对产物进行提取分离，并对得到的单一化合物与底物进行活性比较，最终发现有的转化产物活性明显高于底物延胡索乙素，已申报国家发明专利。3生物化学技术用于药品检测及其成分分析3.1检测的基本内容　　应对可以接受的批数，例如连续5个批号的检品尽可能全面地进行鉴定，以确定其组分的连续一致性。各批次间的任一差异均应重视，该试验的结果应作为制定产品标准规格的依据。每批产品都必须有鉴别纯化活性物质试验来证实产品的同一性。鉴别试验的选择取决于产品的性质和生产方法。应测定每批成品的纯度，并应规定范围。宿主细胞DNA残量测定必须用灵敏度高的方法进行，对于长期或大剂量使用的产品应规定残留的微量抗原性成分的限度。采用国家或国际标准品作对照，测出产品的生物效价。如化学方法或体外试验方法与生物试 验方法平行，亦可选用体外法或化学法。如无标准品时，可选用经过批准的内部参照品进行标定。采用的标准品，必须是经过临床评价的，在化学组成、纯度及生物活性，包括全氨基酸序列等方面都是全面鉴定过，且与天然纯品对比的制品。　　总之，成品的检验应注意如下问题：(1)有效成分的同一性、结构确认；(2)有效成分的均一性；(3)有效成分的化学纯度；(4)对有害物质及杂质等的有效控制试验；(5)灵敏高效适宜的生物活性及比活性等实验方法［6］。3.2化学成分分析［5，6］　　主要包括蛋白质、糖链的构造，各种理化特性解析、确认、鉴定、均一性，纯度检定、定量等。　　蛋白质的构造、组成解析项目有：(1)氨基酸组成分析；(2)末端氨基酸及末端氨基酸序列分析；(3)巯基和二硫链的数量和位置分析；(4)肽图分析；(5)全氨基酸序列分析；(6)高级结构分析和分子量测定等。　　所用分析方法有氨基酸自动分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE法和高效液相色谱法(HPLC)等。也可将不同方法加以组合使用，会获得更好的分析结果。如HPLC-HPLC、HPLC-MS、HPLC-氨基酸自动分析、肽图-MS、肽图-氨基酸自动分析、肽图-氨基酸序列分析等。　　HPLC法和电泳法因其简便有效，所以在蛋白质的确认、鉴定、均一性检查、纯度检定及定量方面的应用十分广泛。如HPLC法通过选择适当的色谱柱填充剂和流动相，可分析只有1个氨基酸差别的肽链。用反相HPLC法测定肿瘤坏死因子(rh-TNF)的纯度，方法简便、准确、快速，分离测定同时进行，可避免其它方法在测定时有其它蛋白成分干扰的现象，并使比活的测定结果更为可靠［7］。电泳法可区分不同的分子量、电荷，与免疫学方法联用可大大提高试验的特异性。　　近年来建立的高效毛细管电泳法(HPCE)，在蛋白质和肽类分离分析方面具有无法比拟的作用。由于它具有用量少、分析时间短、分离效率高、自动化程度高等优点，特别适用于蛋白质和肽类分离分析，它的应用使蛋白质分析水平上了一个新台阶［8，9］。糖蛋白类药物是近年来研究的热点之一，糖链的结构和机能研究受到人们的广泛关注。现已知糖链有影响与靶细胞受体结合等诸多生物活性的调节和表达作用、增强与血浆蛋白质(运输)的结合性、影响免疫学的特性等功能。因此，糖蛋白中糖链结构的鉴定十分重要，但解析的步骤很复杂，主要包括(1)糖组成分析；(2)结构型分析(N还是O)；(3)唾液酸分子种类分析；(4)链的分枝、大小、分布；(5)糖链结构解析；(6)糖链结构位置；(7)每个结合位置的糖链分布、结合分析等。具体方法有：a.单糖分析：化学分析、GC、萤光标记-HPLC 法、强阴离子交换HPLC法等；b.糖链图(二维、三维)：用PA标记糖链的HPLC法、FACE法、CE法等；c.糖链结构：C13核磁共振法等。结论生物技术药物将异军突起，向大规模产业化和一些新领域发展。生物化学技术作为一种综合了生命科学与多种现代科学理论与研究手段的高技术，在21世纪将对生命科学的各个领域产生十分深刻的影响，由于中药具有中医传统疗效作用的特点，因此有关中药生物技术的研究必须既要积极，又要慎重。生物技术在建立药用动、植物基因库，保存药材品种，中药的绿色栽培，紧缺天然活性成分的转化生产，微量成分的转化增量，紧缺药材资源的二次利用，发现新的活性先导化合物，鉴定中药材，中医药药理模型的建立，中药加工、制剂工艺改造等方面均有广泛的应用前景。参考文献　1洪晓顺薛秀珍.国际现代生物技术发展趋势及我国发展现状简介.中国医情报，1997，3(2)∶124～125　2中国药学会生化药物专业委员会.生物药物国内外现状及展望.中国药学志，1997，32(11)∶694～698　3陶剑虹.我国医药市场品种结构分析.药学进展，1997，21(3)∶186～190　4周海钧.基因工程医药产品的质量要求.药物分析杂志，1993，13(1)∶45～47　　5中国药品生物制品检定所生检处编.国内外生物技术产品质量控制要点，1993，　　6徐连连.生化药物及生物技术产品的新药申报.药物生物技术，1994，1(2)∶58～62　　7杨昭鹏，徐康森.反相高效液相色谱法测定重组人肿瘤坏死因子衍生物.药物分析杂志，1997，17(1)∶22～24　　8张惠.高效毛细管柱电泳法对蛋白质和肽类分离分析新进展.药物分析杂志，1993，13(1)∶62～64　　9黄志东.高效毛细管电泳及其在生物物质分析中的应用近况.中国生化药物杂志，1998，19(2)∶108～110