plga-pcl多聚物单丝生物可吸收缝线的临床前期研究

PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线的临床前期研究陈翔宇，任小宝，刘明华，王伟，王涛，孙溦（400038重庆，第三军医大学西南医院急救创伤中心）[摘要]目的检验聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合聚己内酯[poly(lactic-co-glycolicacid)-polycaprolactone，PLGA-PCL]多聚物单丝生物可吸收缝线的生物可吸收性、降解过程中的力学特性衰减、细胞毒性、组织相容性。方法PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线浸泡于磷酸缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）或人血清溶液（humanserumsolution，HSS）中，观察其重量的衰减率；检测体外降解后其抗张强度的变化；与不同细胞系共培养后，检测细胞系的生长曲线变化；将不同可吸收缝线植入SD大鼠体内，观察局部炎症反应。结果在PBS溶液降解残余率的顺序依次是羊肠线>S4>S3>S2>S1。在人血清中降解残余顺序为羊肠线>S3>S2>S4>S1。扫描电镜的照片显示随着体外降解的发生，单丝表明的结构也开始变得粗燥。所有的多聚物单丝共培养的细胞均表现出良好的生长曲线，基本与空白对照组接近（P>0.05）。多聚物单丝组植入物周围只有少量炎症细胞浸润，而羊肠线周围可以看到大量炎症细胞的浸润。结论PLGA-PCL多聚物单丝生物缝线具有良好良好的可降解性、极低的细胞毒性以及良好的组织相容性。符合临床可吸收缝线的要求，在一定范围内调整聚己内酯（polycaprolactone，PCL）的含量可很好的控制PLGA-PCL多聚物单丝生物缝线的降解速率及其降解后的力学特性的衰减速率，而其组织相容性却无明显变化。[关键词]PLGA；PCL；生物缝线[中图法分类号][文献标志码]APreclinicalStudyofComplexPLGA-PCLMonofilamentBio-absorbableSuturesChenXiangyu，RenXiaobao，LiuMinghua，WangWei，WangTao，SunWei（400038Chongqing，TraumaCenterofSouthWestHospitalofTheThirdMilitaryMedicalUniversity）[Abstracts]ObjectiveToevaluatetheabsorbability，cytotoxicity，histocompatibilityandbreakstrengthretentionofcomplexPLGA-PCLmonofilamentbio-absorbablesutures.MethodsTheweightresidualandbreakstrengthretentionofthosesutureswereobservedinvitrodegradationtests.ThancellcultureandanimalmodewereemployedtoevaluatetheircytotoxicityandhistocompatibilityResultsInPBS，theorderofresidualweightwaschromiccatgut>S4>S3>S2>S1.InHHS，theorderofresidualweightwaschromiccatgut>S3>S2>S4>S1.Themorphologyofcomplexpolymermonofilaments，analyzedbySEM，showedsomecracksappearedonsurfaceafterdegradation.Allmonofilamentsshowedlowercytotoxicityandinflammatoryresponsecomparetochromiccatgut.ConclusionsComplexPLGA-PCLmonofilamentaspotentialbio-suturesshowedexpectableabsorbability，cytotoxicityandhistocompatibility.It’spossiblethattheabsorbabilityandmechanicalpropertyretentionofcomplexPLGA-PCLmonofilamentbio-suturescouldbecontrollablychangedbychangingtheratioPCLwithinacertainrange.[Keywords]PLGA；PCL；Bio-sutureSupportedbytheTacklingProjectforSci&TechResearchProjectofChongqing（CSTC2010AB5118）.Correspondingauthor:RenXiaobao,E-mail:rxb1000@sohu.com[基金项目]重庆市科技攻关项目（CSTC2010AB5118）[通信作者]任小宝，E-mail：rxb1000@sohu.com缝线是外科手术中至关重要的材料之一，主要分为可吸收缝线和不可吸收缝线[1]。可吸收缝线由于其可降解性及良好的组织相容性已经被广泛的使用。聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA],和聚己内酯（polycaprolactone，PCL）都是由单体通过开环聚合方式聚合的聚酯[2] 。由于它们较低的抗原性，在体内只引起较低水平的炎症反应，从而被广泛的应用于生物工程材料的制备中[3-4]。我们通过热熔冷拉丝的方法成功的制备了一种新型PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线[5]。在一定范围内改变PCL的比例，可有有效的控制多聚物单丝的力学特性及可塑性。这说明我们开发的PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线可能通过改变其成分比实现其物理特性的变化，从而适应不同部位手术的要求。为了能够推动此成果向临床转化，本研究观察了PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线的体外降解、力学特性衰减、细胞毒性以及组织相容性情况，为进一步临床试验打下了基础。1材料与方法1.1材料与试剂不同组成比的PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线，S1、S2、S3、S4，由本单位自主合成，方法同前期报道[5]。铬制羊肠线购自威高医疗。磷酸缓冲盐（PBS。0.05mol/L，pH=7.4）购自美国GIBCO公司。含蛋白酶和脂肪酶的人血清购自美国GIBCO公司。小鼠成纤维细胞L929，小鼠胚胎纤维母细胞NIH3T3，大鼠心肌细胞H9c2及人肌母细胞C2C12购自中国科学院上海生命科学院。CCK-8试剂盒（Beyotime，中国）1.2仪器热熔-冷拉丝仪（SJ20-26CB，上海通冷）。自动镀膜仪（JFC-1600,JEOL,日本）。扫描电子显微镜（JSM-6360LA，JEOL，日本）。电子万能试验机（SANS，中国）。可见光显微镜(Nikon,EclipseTE2000日本)。1.3方法1.3.1体外降解实验为了检测复合物单丝的可降解下，我们采用PBS浸泡法和人血清浸泡法检测不同时间点不同成分复合物单丝的降解率。50cm长复合物单丝被放置于50mL离心管中，并加入40mLPBS或40mL人血清，封闭后再37℃下以50r/min的转速震荡孵育，每10天更换1次溶液，以避免盐浓度的改变或蛋白酶、脂肪酶活性的衰减。样本测量前以蒸馏水漂洗3次并真空抽湿。根据公式1计算样本的质量残余率。并通过扫描电镜观察样本的表面形态变化。公式1质量残余率(residualweight)（%）=降解后质量/原始质量×1001.3.2细胞培养所有细胞系均培养于含有10%FBS的DMEM溶液中，5%CO2，37℃孵育。并定期传代。1.3.3细胞毒性实验将1根20cm长的复合物单丝剪成1.2～1.5cm的片段后置入24孔板中，采用75%的酒精浸泡8h以达到消毒的目的，消毒后以PBS溶液清洗3次后浸泡于含有10%FBS的DMEM培养基中以去除残余的酒精。然后每孔种植5×104个细胞，5%CO2，37℃孵育。分别于1、4、7d时对每种单丝样本培养孔进行细胞计数，绘制生长曲线。将培养基去除后，加入含有10%FBS和10%CCK-8的DMEM溶液500µL，37℃孵育2h后加入100mL染色剂。将溶液转至96孔板在450nm波长下检测吸光度，以空白的含有10%CCK-8的DMEM溶液作为内参。 1.3.4多聚物单丝的表面形态观察取多聚物单丝反复无水乙醇漂洗3次后，以自动镀膜仪对样本表面喷涂金膜，10mA，10min。以扫描电镜观察样本的表面形态。1.3.5体外降解后力学特性检测对体外降解试验前以及降解试验1、5、10、20、30d后的多聚物单丝和铬制羊肠线标本，进行抗张强度检查。方法同之前报道。按照公式2计算抗张强度残留率（%）。公式2抗张强度残留率(breakingstrengthretention,BSR)（%）=降解后抗张强度（N）/降解前抗张强度（N）×1001.3.6组织相容性实验1.3.6.1大鼠体内实验体内实验选用10周龄300～400g雄性SD大鼠，每组共10只，所有实验动物来自第三军医大学实验动物中心。于大鼠大腿消毒备皮后切开皮肤，在同一大鼠大腿肌肉内植入3～4cm长复合物单丝及铬制羊肠线，植入物两段端结固定。缝合手术切口。1.3.6.2组织学检测处死动物后取单丝及周围肌肉组织以4%福尔马林溶液固定24h，酒精脱水，石蜡包埋，切片后HE染色，以观察组织的局部炎症反应显微镜下观察急性炎症反应（中性粒细胞、多核细胞），慢性炎症反应（单核细胞、淋巴细胞），异物反应（巨噬细胞、多核异物巨细胞）并根据文献[6-9]报道的方式对组织切片的急性炎症反应、慢性炎症反应以及异物反应进行0～4的5级评分。上述实验重复3次。1.4统计分析所有连续性数据以均数±标准差的方式表示。所有连续性数据采用t检验，所有等级数据采用卡方检验。2结果2.1体外降解实验体外降解实验显示所有的多聚物单丝和铬制羊肠线随着浸泡时间的延长均表现出一定程度的降解。在PBS溶液中，最初的10d所有样本的降解都不明显，然而自30d起S1和S2的降解率明显高于羊肠线（P<0.05）。90d时间降解残余率的顺序依次是羊肠线>S4>S3>S2>S1。60d致90d间S2、S3和S4的残余重量曲线非常接近。然而在人血清中最初30dS1、S2、S3和S4的残留重量曲线非常接近且显著低于羊肠线（P<0.05）。但在第90天4种不同比例的多聚物单丝的残余重量表现出了一定的差别。其残余重量顺序为羊肠线>S3>S2>S4>S1（图1）。 纵坐标表示质量参与率，横坐标表示时间；A：在PBS溶液中降解0～30d；B：在PBS溶液中降解30～90d；C：在人血清溶液中降解0～30d；D：在人血清溶液中降解30～90d；CC：羊肠线，*：P<0.05，与羊肠线比较图1体外降解实验除了重量的衰减，通过体外降解实验，我们还发现所有样本的抗张强度也随着降解而衰减。S1无论在PBS还是人血清中其抗张强度均表现出最快的衰减，分别为80%和90%。S3在人血清中的抗张强度衰减最低，为23%（P<0.05）。而在PBS中S3抗张强度衰减率与羊肠线无明显差别（P>0.05）。我们同样可以看到PCL可以改变PLGA多聚物单丝的抗张强度衰减率。在人血清中S3的抗张强度衰减率在实验的10、20、30d均低于S1。而其与S2、S4没有明显的差别（图2）。 纵坐标表示抗张强度残留率（BSR），横坐标表示降解时间；上图：PBS中的体外降解试验；下图：HSS中的体外降解试验；*：P<0.05，与S1比较；#：P<0.05，与羊肠线比较图2体外降解后抗张强度残留率（BSR）的变化扫描电镜的照片显示随着体外降解的发生，单丝表明的结构也开始变得粗燥，然而S1的表面变化最为明显（图3）。左上：S3在PBS中浸泡中10d后的表现；右上：S3在PBS中浸泡中20d后的表现；左下：S3在PBS中浸泡中30d后的表现；右下：S1在PBS中浸泡中30d后的表现图3扫描电镜观察S3、S1在人血清溶液中体外降解过程中的表面结构变化(×200) 上述结果显示，可通过PCL添加比例的调节改变PLGA-PCL多聚物单丝的体外降解速率以及力学特性的衰减率。2.2细胞毒性试验细胞共培养试验显示，所有的多聚物单丝共培养的细胞均表现出良好的生长曲线，基本与空白对照组接近（P>0.05）。S1和S2与L929/H9c2及C2C12共培养7d后细胞生长活性显著优于羊肠线（P<0.05）；S3和S4与L929/H9c2及C2C12共培养7d后细胞生长活性较羊肠线无明显差别（P>0.05）。在与NIH3T3细胞共培养时所有的多聚物单丝以及羊肠线组间差异不明显（P>0.05）（图4）。纵坐标表示细胞活性，横坐标表示时间；左上：NIH3T3细胞系；右上：L929细胞系；左下：C2C12细胞系；右下：H9c2细胞系；CC：羊肠线；TCP：空白对照；*：P<0.05，与羊肠线比较图4与不同细胞系共培养后细胞系生长速率的变化2.3SD大鼠体内实验通过之前描述的方法将多聚物单丝和铬制羊肠线植入SD大鼠大腿肌肉中。30d后取局部标本石蜡包埋HE染色，在500μm×400μm的视野内对炎症细胞计数。多聚物单丝组植入物周围只有少量炎症细胞浸润，而羊肠线周围可以看到大量炎症细胞的浸润。说明PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线在组织中只引起非常低水平的炎症反应，这一结果明显优于商用的羊肠线。随着多聚物单丝中PCL的含量逐渐增高，炎症反应也逐渐增强。PCL含量的最高的S4其炎症反应较其他多聚物缝线，但仍然优于羊肠线。组织炎症严重程度的排序为羊肠线>S4>S3>S2>S1。这一显现提示对于PLGA/PCL多聚物单丝，其引起组织炎症反应的组要因素是PCL的降解产物（表1,图5）。 表1大鼠体内植入缝线后的局部炎症反应炎症反应水平a急性炎症反应慢性炎症反应异物反应瘢痕形成S10000S20001S30001S41121CCb4331注：a：炎症反应分为0～4级，0=不存在，4=非常严重，逐级递增；b：羊肠线缝线植入SD大鼠体内30d后局部放大观察缝线周围炎性表现；CC：羊肠线；S1、S2、S3、S4：不同样品图5大鼠体内植入缝线30d后局部组织HE染色观察（×100）3讨论在体外降解实验中，所有的多聚物单丝均表现出可降解性。有文献报道PLGA更容易在PBS中发生水解，分解为单体或寡聚体[10-11]。而PCL的降解需要酯酶和蛋白酶K的催化[12]。新鲜人血清中含有与人体微环境中类似的丰富的酯酶和蛋白酶。由于铬制羊肠线的结构更加复杂因此在缺乏酶的PBS溶液中表现出很慢的降解速度。在新鲜人血清中由于富含酯酶和蛋白酶，S4（70wt%PLGA，30wt% PCL）和铬制羊肠线更容易降解。在PBS溶液中最初10d，所有的实验组匀无明显的降解速率的差异，90d后S2（90wt%PLGA，10wt%PCL），S3（80wt%PLGA，20wt%PCL），S4（70wt%PLGA，30wt%PCL）的残余重量显著高于S1（100wt%PLGA，0wt%PCL）。说明PCL可以改变多聚物单丝在不同溶液中的可降解性。此外降解后抗张强度残留率和单丝表面结构改变均受到PCL比例改变的影响。PLGA和PCL广泛的应用于组织工程中，如生物膜、纳米纤维、生物支架、纳米微粒等，得益于其良好的生物可吸收性和生物相容性[3-4]。与预期的结果一样，PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线与不同的细胞系共培养均未表现出明显的细胞毒性。有趣的是逐渐增加PCL的含量，L929、H9c2细胞的生长活性缓慢的下降。而作为对照组的铬制羊肠线在于NIH3T3、H9c2和C2C12细胞共培养时导致细胞生长活性的显著下降。说明我们开发的，PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线细胞毒性低，优于铬制羊肠线，过得的增加PCL含量可能会导致细胞毒性的增加理想的手术缝线，应该具有在人体内表现出较低的炎症反应。通过动物实验，我们发现我们开发的PLGA-PCL多聚物单丝生物可吸收缝线在大鼠体内引起了非常微弱的炎症反应。而传统铬制羊肠线却引起了较强的炎症反应。这主要是由于后者含有异种蛋白，更容易引起机体的免疫反应。因此我们开发的PLGA/PCL多聚物单丝缝线可能成为一种非常有临床应用价值的生物可吸收缝线。PLGA-PCL多聚物单丝生物缝线具有良好良好的可降解性、极低的细胞毒性以及良好的组织相容性。符合临床可吸收缝线的要求，在一定范围内调整PCL的含量可很好的控制PLGA-PCL多聚物单丝生物缝线的降解速率及其降解后的力学特性的衰减速率，而其组织相容性却无明显变化，从而使之可以适应不同的手术要求，具有更广的临床应用范围。参考文献：[1]Garcia-TiradoJ,Rieger-ReyesC.Suturetechniquesoftheintercostalspaceinthoracotomyandtheirrelationshipwithpost-thoracotomypain:asystematicreview[J].Archivosdebronconeumologia，2012，48:22-28.[2]SongX,ZhaoY,WuW,etal.PLGAnanoparticlessimultaneouslyloadedwithvincristinesulfateandverapamilhydrochloride:systematicstudyofparticlesizeanddrugentrapmentefficiency[J].Internationaljournalofpharmaceutics，2008，350:320-329.[3]WangY,WeiYT,ZuZH,etal.CombinationofhyaluronicacidhydrogelscaffoldandPLGAmicrospheresforsupportingsurvivalofneuralstemcells[J].Pharmaceuticalresearch，2011，28:1406-1414.[4]FangR,ZhangE,XuL,etal.ElectrospunPCL/PLA/HAbasednanofibersasscaffoldforosteoblast-likecells[J].Journalofnanoscienceandnanotechnology，2010，10:7747-7751.[5]陈翔宇,任小宝,王涛,等.PLGA-PCL多聚物单丝生物缝线的制备及力学特性研究[J].第三军医大学学报（待发表）[6]KosanM,GonulalanU,OzturkB,etal.Tissuereactionsofsuturematerials(polyglactine910,chromedcatgutandpolydioxanone)onratbladderwallandtheirroleinbladderstoneformation[J].Urologicalresearch，2008，36:43-49.[7]WandallHH,Holm-JensenS,AgnerE.Absorbablesutures.AcomparisonbetweenPGAandcatgut[J].TheBritishjournalofsurgery，1972，59:898.[8]WainsteinM,AndersonJ,ElderJS.Comparisonofeffectsofsuturematerialsonwoundhealinginarabbitpyeloplastymodel[J].Urology，1997，49:261-264.[9]ChenX,YangX,PanJ,WangL,etal.DegradationbehaviorsofbioabsorbableP3/4HBmonofilamentsutureinvitroandinvivo.JournalofbiomedicalmaterialsresearchPartB[J].Appliedbiomaterials，2010，92:447-455.[10]YooJY,KimJM,SeoKS,etal.CharacterizationofdegradationbehaviorforPLGAinvariouspHconditionbysimpleliquidchromatographymethod[J].Bio-medicalmaterialsandengineering，2005，15:279-288.[11]LooJS,OoiCP,BoeyFY.Degradationofpoly(lactide-co-glycolide)(PLGA)andpoly(L-lactide)(PLLA)byelectronbeamradiation[J].Biomaterials，2005，26:1359-1367.[12]ZengJ,ChenX,LiangQ,etal.Enzymaticdegradationofpoly(L-lactide)andpoly(epsilon-caprolactone)electrospunfibers[J].Macromolecularbioscience，2004，4:1118-1125.