重组人神经肽y受体y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文

　　重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究论文丁克祥董萍郑永晨杨永鹏朱晓亮韩晋云单志新丁宇丁振华【摘要】目的在大肠杆菌中表达人神经肽YY2受体，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aY2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethodsTherebinantplasmidpET28aY2edatography.ThenbioinformaticanalysisoftheY2receptoridpET28aY2expressedrebinanthumanY2receptorprotein.Highlypurifiedfusionproteinatography.RelatedbiologicalcharacteristicsofY2receptoridpET28aY2canbesuccessfullyexpressedinDE3.HighlypurifiedproteinscanbeobtainedbyNi2+NTAaffinitychromatography.Y2receptor′sbiologicalcharacteristicsarepredicted,ent.【Keyatics神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸组成的多肽,属于胰多肽家族,作为一个信号分子在不同物种间有高度的保守性。人体内NPY相关的受体主要存在于中枢神经组织中,此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2和Y5〔1，2〕。NPY通过与其受体Y2(NPY2R)的作用刺激内皮细胞增殖分化,在血管生成过程中重要的作用〔3，4〕，Kuo等〔1〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合征形成中有重要的作用。他们认为,NPY与NPY2R相互作用,通过血管生成引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化，表明NPY及NPY2R可作为媒介用以增加移植脂肪组织的体积和存活。1材料与方法1.1材料E.coliBL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aY2的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientzIID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1重组人NPY2R融合蛋白的诱导表达用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aY2的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5mlLB(Kan+ )液体培养基，37℃振摇培养过夜。次日取培养过夜菌液500μl再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养4h。取加IPTG前和后的菌液各1ml，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50μl，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心10min，每个样品取20μl上样于10%的SDSPAGE凝胶电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2h，然后脱色，拍照记录结果。1.2.2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃，5000r/min，离心15min，收集菌体沉淀;加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃，12000r/min，离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃，12000r/min，离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10min/次，处理时间30min;超声处理后，于4℃，12000r/min，离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。1.2.3包涵体的提纯于菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25ml,吹打混匀，室温静置30min,12000r/min离心30min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。1.2.4包涵体的裂解于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25ml，吹打混匀，室温静置6h，使包涵体充分裂解,.freelin离心30min，收集上清液，即为包涵体裂解物。1.2.5变性蛋白的复性将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4℃条件下透析;复性液中的尿素浓度从7～1mol/L依次递减,在每个尿素浓度梯度复性液中透析3～4h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透析袋内的样品吸出，4℃，12000r/min，离心30min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4℃，12000r/min，离心30min，再将上清液加入透析袋，在4℃预冷的PBS中透析20h;取出透析好的样品，4℃，12000r/min，离心30min，收集上清液即为复性产物。-70℃保存。1.2.6复性产物的纯化①上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1ml/min以内;②冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5ml/min以内;③洗脱：分别用含50、100、150mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5ml/min。 1.2.7纯化产物ODEL三级结构预测服务器，未能生成预测的结果。2.4.7抗原性分析利用在线软件对NPY2R的抗原性进行分析，结果见图8，有10个抗原决定簇可供选择，以便进行相关实验。图8NPY2R的抗原性分析3讨论NPY2R缺失小鼠能够明显减少摄食、降低脂肪沉积和减轻体重〔5〕，在大鼠和小鼠外周注射NPY2R抑制剂PYY3236均可抑制摄食，降低体重,而在NPY2R缺失模型鼠中却无此作用〔6〕。这表明NPY2R与摄食和肥胖密切相关。为了探明是否NPYNPY2R信号系统能剌激体内脂肪量的增加,研究者使用遗传性的肥胖鼠B6.VLepob/J,这种鼠具有能进行中枢性的调节摄食过量、削弱新陈代谢及减少交感性嗜铬细胞活性的特点。与对照组鼠相比,这些鼠血清NPY水平高出正常值的200%,并且明显地上调腹部皮下脂肪的NPY及其受体Y2的表达。这也支持了一种观点，即循环的NPY来源于脂肪组织。利用腹部皮下脂肪源性的NPY进行处理后,可观察到在肥胖及消瘦鼠体内脂肪组织的质量及体积增加了50%。而相反的是,注射NPYY2受体拮抗剂可降低肥胖及消瘦鼠体内脂肪量及体积的50%。Baker等〔7〕研究表明NPY与Y2受体作用可引起机体内新的脂肪生成,并可减少机体对移植脂肪的吸收。他们以鼠及猴为对象进行的研究表明将包有NPY并能稳定释放14d的缓释药片植入到鼠的皮下组织中,在药片植入的周围会有新的脂肪生成,而且这种脂肪能够至少维持3个月。同时将含有NPY的药片植入到两只猴子腹部的皮下组织中,NPY的用量与给鼠的用量一样,但1个月后通过MRI检测,同样可以观察到脂肪细胞的生成。本课题组在完成重组人源化NPY2R基因克隆及序列分析〔8〕的基础上,将NPY2R基因与pET28α载体连接后表达于DE3中。pET28α表达载体在N端含有HisTag寡聚组氨酸链,因此,表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。本课题组设计的NPY2R融合蛋白N端为36个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个Histag，其后的目的NPY2R蛋白有381个氨基酸。即pET28aNPY2R表达的融合蛋白共由417个氨基酸组成,分子量约50kD左右。用6×histag抗体进行ediatesstressinducedobesityandmetabolicsyndrome〔J〕.NatMed，2007;13:803.2MovafaghS，HobsonJP，SpiegelS,etal.NeuropeptideY(NPY)inducesmigration，proliferation，andtubeformationofendothelialcells bimodallyviaY1，Y2，andY5receptors〔J〕.FASEBJ，2006;20：132737.3RupnickMA，PanigrahyD，ZhangCY,etal.Adiposetissuemasscanberegulatedthroughthevasculature〔J〕.ProcNatlAcadSciUSA，2002;99：107305.4BrakenhielmE，CaoR，GaoB，etal.Angiogenesisinhibitor，TNP470，preventsdietinducedandgeicobesityinmice〔J〕.CircRes，2004;94：157988.5SainsburyA，SchportantroleofhypothalamicY2receptorsinbodyice〔J〕.ProcNatlAcadSciUSA，2002;99：893843.6BatterhamRL，CoallCJ,etal.GuthormonePYY(3236)physiologicallyinhibitsfoodintake〔J〕.Nature，2002;418：6504.7BakerSB，CohenM，KuoL,etal.TheroleoftheneuropeptideY2receptorinliporemodeling：neuropeptideYmediatedadipogenesisandadiposegraftmaintenance〔J〕.PlastReconstrSurg，2009;123(2):48692.8丁克祥,董萍,郑永晨,等,与肥胖相关的神经肽Y受体Y2基因的克隆及序列分析〔J〕.国际护理学杂志,2009;28(3):4235.