生物工程专业毕业论文--微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件的研究+任务书+开题报告+外文翻译

本科毕业论文（设计）手册题目：微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件的研究学院：生物工程专业：生物工程学号：姓名：指导老师：职称：合作老师：/职称：/成绩：4 手册目录（一）本科毕业论文(设计)正文………………………………3（二）本科毕业论文(设计)任务书…………………………………21（三）本科毕业论文(设计)开题报告………………………………23（四）本科毕业论文(设计)文献综述………………………………30（五）本科毕业论文(设计)外文翻译…………………………36（六）本科毕业论文(设计)指导记录…………………………62（七）本科毕业论文(设计)中期检查表………………………64（八）本科毕业论文(设计)答辩资格审查表…………………65（九）本科毕业论文(设计)答辩记录…………………………66（十）本科毕业论文(设计)成绩评定书…………………………67（十一）本科毕业论文(设计)作品(实物)验收表……………………684 目录中文摘要…………………………………………………………………………………5外文摘要…………………………………………………………………………………6引言………………………………………………………………………………………71．实验材料及仪器………………………………………………………………………71.1材料……………………………………………………………………………71.2试剂………………………………………………………………………………81.3仪器………………………………………………………………………………82．工艺流程………………………………………………………………………………83．实验方法…………………………………………………………………………93.1标准曲线的制备…………………………………………………………………93.2金银花总黄酮传统提法………………………………………………………93.3微波辅助提取单因素实验方法…………………………………………………93.4微波辅助提取正交试验方法……………………………………………………93.5黄酮含量测定方法………………………………………………………………94．结果………………………………………………………………………………104.1标准曲线绘制……………………………………………………………………104.2微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件的研究（单因素实验）………………104.2.1微波功率对金银花总黄酮提取影响………………………………………104.2.2微波时间对金银花总黄酮提取的影响……………………………………114.2.3固液比对金银花总黄酮提取的影响………………………………………124.2.4乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响…………………………………134.3微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件研究（正交实验）……………………134.4微波辅助提取与传统乙醇回流法比较………………………………………155．讨论………………………………………………………………………………176．结论………………………………………………………………………………17参考文献………………………………………………………………………………18致谢……………………………………………………………………………………204 微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件的研究摘要：目的　本实验采用微辅助提取，分别通过单因素实验、正交实验考察金银花总黄酮的最佳工艺条件，为金银花总黄酮药理药效研究提供材料，同时为其进一步开放奠定基础。方法以芦丁为对照品，用紫外-可见分光光度法建立芦丁的标准曲线；在单因素试验的基础上，以总黄酮含量为指标，采用正交试验方法考察液固比、乙醇浓度、提取时间等因素对微波提取工艺参数做初步研究。结果　（1）单因素实验结果：金银花总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度70%，固液比为1:25，微波时间12min,微波功率406W。（2）正交实验结果：固液比（B）、乙醇浓度%（A）和微波功率W（C）对指标影响显著。根据以上分析，可定出影响指标的因素显著性主次顺序为：ACBD。总黄酮的优选浸提条件（各因子优水平组合）为最佳提取功率为406W，最佳提取时间为12min，最佳固液比1:25，最佳乙醇浓度为70%。（3）以总黄酮得率为指标，微波辅助提取优于传统回流提取法。结论该方法提高了黄酮的提取率，减少了有机溶剂用量，缩短了提取时间。关键词：金银花；总黄酮；微波辅助提取；正交试验法；乙醇回流4 Microwave-assistedextractionprocessofflavonoidsinhoneysuckleConditionsAbstract:ObjectiveThepurposeofmicro-assistedextractionprocessoftotalflavonoidsinhoneysuckleconditionsofapreliminarystudyandwiththetraditionalcraftmakethatnolcomparedtooptimizetheextractionoftotalflavonoidsinhoneysuckleconditions.MethodUserutinasreferencesubstance,byultraviolet-visiblespectrophotometryrutinstandardcurvessetup;inthesinglefactortest,basedonthetotalflavonoidcontentasanindex,usingorthogonaltestapproachtoliquid-solidratio,ethanolconcentration,extractiontimeonthemicrowaveextractionprocessparameterstodoapreliminarystudy.ConclusionTheexperimentalresultsshowthat:Theyieldoftotalflavonoidsasanindex,microwave-assistedextractionissuperiortothetraditionalrefluxextractionmethod,totalflavonoidsinhoneysucklethebestextractionprocessforthe70%ethanolconcentration,solid-liquidratioof1:25,microwavetimeto12min,microwavepower406W.Keywords:honeysuckle;totalflavonoids;microwave-assistedextraction;orthogonaltestmethod;ethanolreturn460 引言微波辅助萃取[1-2](microwaveassistedextraction)MAE又称微波辅助提取，是指使用适合的溶剂在微波反应器中从天然药用植物、矿物或动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。MAE是在分析化学中派生出来的新型萃取技术，和传统的水蒸气蒸馏、索氏抽提等技术比较，微波提取技术可以缩短萃取时间、降低能耗、减少溶剂用量、提高收率和纯度、降低生产成本，不仅具有很高的经济效益，而且有望改变中草药传统的服用方式。微波提取由于其快速高效分离及选择性加热的优势，在天然产物[2]有效成分的提取方面受到重视，目前，利用微波技术提取中药和天然产物生物活性成分，已涉及黄酮类、苷类、多糖、萜类、挥发油、生物碱、鞣质、甾体及有机酸等。陈斌[3]等利用微波萃取葛根异黄酮的工艺，采用77％乙醇，固液比为1:14，且在体系温度低60℃的前提下，微波间隙处理3次，葛根总黄酮的浸出率达96％以上。与传统的热浸提相比，不仅产率高，而且速度快，节能。戴玉锦等通过单因素的特点，大大节省了能源。王白军4]等对白芥子中总黄酮的微波提取与含量测定[，运用微波技术提取白芥子总黄酮，采用MCL-3型连续微波反应器中，用80％乙醇，功率400W，反应时间20min，提尽黄酮，比色法测定[7]总黄酮含量，结果测得白芥子中总黄酮含量为1.85％，平均加样回收率素试验和正交试验对柚皮中黄酮类化合物提取工艺进行了研究。用微波法从柚皮中提取黄酮的最佳工艺条件为，乙醇浓度80％、浸提时间为5min、料液比1:25此时黄酮得率为0.84mg/g。与传统水浴法的对比试98.96％，相对标准差（RSD）为2.11％(r=6)[8]。首次运用微波技术从白芥子中提取总黄酮，提取速度快，提高了效率，比常规法提取的含量高，其结果令人满意。本实验采用单因素分组实验方法，在此基础上进行正交试验设计，结合实际情况分别对微波辅助提取法和传统乙醇回流提取法提取金银花总黄酮的最佳工艺进行探究。1.材料与方法1.1材料金银花(浙江中医药大学饮片厂提供)60℃烘箱内烘干，打粉备用。1.2试剂芦丁对照品（批号：10080-2003016，含量91.7%）购于中国药品生物制品检定所；所用试剂亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、回收乙醇、95%60 乙醇皆为分析纯；所用水为去离子水。1.3仪器粉碎机（DFT-100克上海新诺仪器厂）微波炉（WP700型格兰仕微波炉有限公司）；电子天平（AG135型上海精密科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（018268型金坛市大地自动化仪器厂）；旋转蒸发仪（RE-52AAA型上海嘉鹏科技有限公司）；循环水式真空泵（SHB-ⅢA河南省太康科教器材厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9140A型上海森信实验有限公司）；紫外722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；自动平衡离心机（TDZ5-WS型赛特湘仪离心机仪器有限公司）。2.工艺流程如图2-1所示：粉碎、烘干浸提、微波处理蒸发浓缩干燥、溶解定容金银花粉末滤液浓缩液总黄酮粗品含量计算0.10.090.072-1微波辅助提取金银花总黄酮工艺流程图3.实验方法3.1标准曲线的制备 3.1.1最大吸收波长的选择方法60 以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510nm处均有1个强吸收峰，因此选择510nm为测定波长。3.1.2对照品溶液的制备方法 精密称取芦丁对照品10.2mg置50mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。3.1.3标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分别置10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置15min。采用分光光度法，在510nm处测定吸光度，以对照品量（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。3.2微波提取单因素实验方法分别考察不同的微波辐射功率,辐射时间,乙醇浓度,固液比对提取效果的影响3.3提取工艺正交试验设计方法系统考察微波提取法的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用微波辐射功率（A），辐射时间（B），乙醇浓度（C），固液比（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用L9（34）正交表设计，得到供试液。3.4微波辅助提取法与乙醇回流法比较比较两种提取方法的处理时间和液固比对总黄酮提取量的影响。传统乙醇回流法提取总黄酮的所需时间比微波辅助提取法提取长得多，且金银花总黄酮提取量比较低;而微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。比较此两种方法在最佳条件下的总黄酮含量。3.5总黄酮含量测定方法取0.5mL液，加入5%亚硝酸溶液0.3mL荡摇匀，放置6min加入10%硝酸铝0.3mL荡摇匀，放置6min入4%氢氧化钠试液4mL，30%（V/V）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min分光光度法，在510nm定吸光度值由标准曲线计算得总黄酮含量。4.结果4.1标准曲线绘制表4-1标准曲线表编号01234560 芦丁浓度（mg/mL）00.020.030.050.070.09吸光度（OD）00.2060.3810.5480.7380.911图4-1标准曲线图以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到回归方程为：Y=10.328x+0.0147，R2=0.9900，表明在一定范围内线形关系良好。4.2微波提取金银花总黄酮单因素实验方法4.2.1微波功率对金银花总黄酮提取的影响准确称取5g金银花粉末，加入70%的乙醇溶液，设定微波功率为126W-700W，微波辅助提取全程时间为10min，将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2h后合并提取液，检测总黄酮含量，实验结果见图4-2和表4-2。表4-2微波功率对金银花总黄酮提取的影响微波功率（W）126252406567700总黄酮得率（%）1.341.862.052.432.1060 图4-2微波功率对金银花总黄酮提取的影响由图4-2可知，微波功率设在300W~800W之间，随着微波功率的增大，微波对细胞壁的破碎作用增强，胞内总黄酮溶出速率增大，得率逐渐增高。4.2.2微波处理时间对金银花总黄酮提取的影响准确称取5g金银花粉末，加入适量70%的乙醇溶液，设定微波功率为406W，微波辅助提取时间分别设定为4min，6min，8min，10min，12min，14min将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2h后合并提取液，检测总黄酮含量，实验结果见图4-2和表4-2。表4-3微波处理时间对金银花总黄酮提取的影响微波时间（min）4681012总黄酮得率（%）1.261.541.762.482.36图4-3微波处理时间对金银花总黄酮提取的影响60 由图4-3可见，微波时间在10min内，黄酮含量随着超声时间的延长而增加，10min时达到最大值。4.2.3固液比对金银花总黄酮提取的影响准确称取5g金银花粉末，液固比分别设定为20，30，40，50，60将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2h后合并提取液，实验结果见图4-4表4-4。表4-4固液比对金银花总黄酮提取的影响固液比（mL/g）2030405060总黄酮得率（%）1.582.162.201.981.76　图4-4固液比对金银花总黄酮提取的影响由图4-4可知，在液固比为1:30的时候有一个峰值，液固比在20到30时候随液固比的升高，含量增加，1:40到1:60的时候，随液固比的增加，含量减少。液固比在1:30的时候总黄酮含量最高，达到2.20%。4.2.4乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响准确称取5g金银花粉末，加入适量70%的，设定微波功率为406W，微波辅助提取液固比设定为30,分别设定乙醇溶液溶度为50%，60%，70%，80%，90%将提取液离心，取上清液，将过滤渣乙醇回流2小时后合并提取液，检测总黄酮含量,实验结果见图4.2.4表4.2.4.60 表4-5乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响乙醇浓度（%）5060708090总黄酮得率（%）0.911.542.382.101.86图4-5乙醇浓度对金银花总黄酮提取的影响从上图可见，金银花总黄酮最佳提取乙醇浓度为70%，而在乙醇浓度过高或过低时得率较小。可能的原因是：乙醇浓度过低，提取液中杂质含量较多，可能是蛋白质、过滤、浓缩、和分离均较困难;而随着乙醇浓度的提高，脂溶性的物质溶出增多，给提纯带来较大的麻烦。所以，选择70%乙醇作为微波辅助提取溶剂。4.3微波辅助提取金银花总黄酮正交实验方法为系统考察微波提取法的工艺参数，根据单因素实验，分别选择乙醇浓度%（A）、固液比（B）、微波功率W（C）和微波时间min（D）作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用择L9（34）正交表设计得到供试液正交设计表见4-6，实验结果见表4-7。表4-6正交实验因素水平表实验号乙醇浓度%（A）固液比（B）微波功率W（C）微波时间min（D）1501:2525282701:30406103901:357001260 表4-7微波辅助提取金银花总黄酮的L9（34）正交试验结果表因素乙醇浓度（%）固液比（g/mL）微波功率（w）微波时间（min）黄酮得率（%）试验号123456789M1M2M3m1m2m3RA5050507070709090908.607.865.392.872.621.801.07B1:251:301:351:251:301:351:251:301:356.876.556.432.292.182.140.15C2524067004067002527002524066.027.076.762.012.362.250.25D8101212810101286.576.656.622.192.2172.2070.0272.072.342.192.862.632.371.941.581.87为进一步确定各因素对金银花总黄酮得率的影响程度，对表4-7中的各因素进行方差分析和显著性检查，见表4-8。表4-8方差分析表方差来源离差平方和自由度均方F值显著性ABCD1.7140.1383.9445.88422220.2940.0690.8571.97228.524.2536.5640.21***由上表可知：微波时间min（D）对提取率的影响很小，作为误差项。显著性检验后发现因素：固液比（B）、60 乙醇浓度%（A）和微波功率W（C）对指标影响显著。根据以上分析，可定出影响指标的因素显著性主次顺序为：ACBD。总黄酮的优选浸提条件（各因子优水平组合）为最佳提取功率为406W，最佳提取时间为12min，最佳固液比1:25，最佳乙醇浓度为70%。该工艺条件下金银花总黄酮粗品得率可以达到2.86%。4.4乙醇回流法提取总黄酮4.4.1乙醇回流时间对金银花总黄酮提取的影响准确称取发酵液150mL，用水提法浸提1，2，3，4，5h后，测定总黄酮的含量，结果见图4-6表4-9。表4-9乙醇回流法处理时间对金银花总黄酮提取的影响处理时间（h）123456总黄酮得率（%）0.560.700.810.871.211.05图4-6乙醇回流时间对金银花总黄酮提取的影响图4-6回流时间对金银花总黄酮提取的影响由图4-6知，用乙醇回流法提取金银花总黄酮，随时间的变长，总黄酮的提取量也在增加，提取5h时，总黄酮含量最高。4.4.2回流固液比对金银花总黄酮提取的影响用传统乙醇回流法提取金银花总黄酮，在其他条件不变的情况下，改变回流液固比，测得的金银花总黄酮含量见表4-10和图4-7。表4-10回流液固比金银花总黄酮提取的影响液固比（mL/g）2030405060总黄酮得率（%）0.510.620.700.860.7560 图4-7回流固液比对金银花总黄酮提取的影响由图4-7知，乙醇回流法提取金银花总黄酮的时候，总黄酮的含量随着固液比的升高而升高，液固比在50到最高得率为0.86%。当液固比超过50的时候，金银花总黄酮的含量随固液比的增加而减少。所以乙醇回流法提取金银花总黄酮的最佳液固比是50:1。由图4-3和图4-6明显可看出两种提取方法总黄酮提取量随时间的延长而提高，但传统乙醇回流法提取总黄酮的所需时间比微波辅助提取法提取长得多，且金银花总黄酮提取量比较低，而微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。由图4-4和4-7知，在相同液固比下，微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。4.4.3微波辅助与传统提法最佳工艺对比比较此两种方法在最佳条件下的总黄酮得率，结果见表4-11。表4-11微波辅助与传统提法最佳工艺对比表提取方法时间固液比功率乙醇浓度总黄酮得率微波辅助提取法10min1:25406W70%2.86%乙醇回流法5h1:50／70%1.54%从表可知，在两种方法的最佳工艺条件下，微波辅助提取法提取得到的总黄酮明显要高于传统乙醇回流法，且浸提剂用量少，提取时间缩短,提取量增加，提取过程无需高温，避免了因高温对总黄酮分子结构的破坏，被浸提的生物活性物质在短时间内保持不变，是黄酮化合物工业生产较理想的一种提取新工艺。微波辅助提取金银花黄酮类化合物提取率能达到2.86%，要高于乙醇回流法提取的1.54%。微波辅助提取时间仅为10min，比乙醇回流法提取的5h要远远的缩短了。60 5.讨论5.1微波萃取法的原理是微波直接与被分离物作用，微波的激活作用导致样品基体内不同成分的反应差异使被萃取物与基体快速分离，通过偶极子旋转和离子传导两种方式同时加热，加剧了体系中分子的碰撞频率，使黄酮分子容易从药材内部扩散到溶剂中，大大缩短加热的时间，并达到较高产率。5.2传统的工艺需要以热传导、热辐射等方式进行，温度上升缓慢，提取时间长。本实验中，用传统醇回流法需要大于4h的提取过程，而微波萃取法只需30min即可完成，提取率较传统醇提取法高，节时，节能，其优越性显而易见。6.小结6.1正交实验工艺分析本实验采用单因素分组实验方法，在此基础上进行正交试验设计，结合实际情况分别确定了微波辅助提取法和传统乙醇回流提取法提取金银花总黄酮的最佳工艺。其中传统乙醇回流提取法的最佳工艺条件为液固比50:1，提取时间5h；金银花总黄酮微波辅助提取工艺，最佳提取功率为406W，最佳提取时间为12min，最佳液固比25:1，最佳乙醇浓度为70%。该工艺条件下金银花总黄酮粗品得率可以达到2.86%。6.2本方法与其他方法比较微波辅助提取法与传统水提法相比，提取时间缩短至二十四分之一，所得净多糖产率也有一定的提高。这是由微波所具有的高频特性、热特性及生物效应几大特点所致,一方面，高频微波促使样品中偶极分子旋转而导致弱氢键破裂及离子迁移，加速了多糖对样品的渗透，并使多糖很快溶解;另一方面，微波是一种高频波，它使提取体系中偶极分子因高速旋转产生高频率摩擦，从而可在短时间内产生极大的热量，使整个样品同时被加热，从而大大加快了多糖的溶解;第三方面，微波具有生物效应，微波会引起样品细胞膜破裂，加速了黄酮从细胞中释放出来。从两种方法的对比中可以明显看出，微波辅助提取较传统乙醇回流提取法提取量高，且溶剂用量少，缩短了提取时间，提取成本低。6.3展望在单因素试验的基础上，以总黄酮含量为指标，采用正交试验方法考察固液比、乙醇浓度、提取时间等因素研究微波提取工艺参数，为进一步工业化生产提供理论依据。该方法提高了黄酮的提取率，减少了有机溶剂用量，缩短了提取时间。本实验通过对微波提取金银花总黄酮的工艺条件研究为药理药效研究提供材料。60 参考文献[1]王艳，张铁军．微波萃取技术在中药有效成分提取中的应用[J]中草药，2005,36(3):470-473．[2]张英，俞卓裕，吴晓琴．中草药和天然植物有效成分提取新技术—微波协助萃取[J]．中国中药杂志，2004,29(2)：104-106．[3]陈斌，南庆贤，吕玲．微波萃取葛根总黄酮的工艺研究[J]．农业工程学报，200l,l7(6)：123-125．[4]戴玉锦，卢明，冯玲．微波法从柚皮中提取黄酮类化合物的工艺研究[J]．江苏农业科学，2006,(1)：121-123．[5]张志信，张仕秀，宋关斌用微波一碱水法提取三七茎叶总黄酮的工艺研究[J]．药物生物技术，2005,12(6)：389-391．[6]李伶，杨俊红，徐志东用微波提取山楂中总黄酮的正交实验研究[J]．中国药学杂志，2005,40(2)：l12-114．[7]林敏，吴冬青，范彦康等用微波对提取万寿菊花中黄酮类化合物的影响[J]．湖州师范学院学报，2005,27(2):108-111．[8]孔琪，吴春．菊花黄酮的提取及抗氧化活性研究[J]．中草药，2004,35(9):1001-1002．[9]房方，张广强，谢新年.用分光光度法进行黄酮类化合物含量测定的研究[J].河南中医药学刊,2002,12(1):17-19．[10]丁利君，吴振辉，蔡创海，等．金银花中黄酮类物质最佳提取工艺的研究[J]．食品科学，2002,23(2)：62-66．[11]胡碧波，吴祖帅，蔡君，等．金银花中主要黄酮的测定及影响因素考察[J]．中国中药杂志，2006,31(21)：117-119．[12]扬俊，蒋惠娣，徐娟华．金银花总黄酮的提取工艺及其含量的动态变化研究[J]．中草药．2002,33(11)：990-993．[13]张睿，徐雅琴，时阳.黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品与机械[J]，2003,(1)：21-22．[14]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].人民卫生出版社[J],2000．[15]涂瑶生，毕晓黎.微波提取技术在中药及天然药物提取中的应用及展望[J].世界科学技术中医药现代化，2005,7(3)：65-69．[16]张秀明，茯苓药理作用研究概况[J]．中药材，2001,24(6)：445-449．[17]WangHK,Xia,YangZY,eta1.Recentadvancesinthediscoveryanddevelopmentofflavonoids60 andtheirana-1ogues[J]asantitumOl~andanti-HIVagents,AdvExpMedBiol,1998,439:191-225.本科毕业论文(设计)任务书学院生物工程专业生物工程姓名学号指导老师职称讲师合作老师/职称/题目微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件的研究一、课题的内容和任务要求1.1研究的内容1.1设计微波提取金银花总黄酮的最佳工艺条件，制备供试液。1.2最大吸收波长的选择方法研究。1.3配置标准芦丁作对照品制备标准曲线方法的研究。1.4用紫外分光光度法测定粗总黄酮的含量。1.5微波辅助提取法与传统乙醇回流法进行效果比较。1.2任务要求本文拟采用微波辅助提取法来探讨金银花总黄酮的提取最佳工艺条件。实验分别从微波时间、微波功率、乙醇浓度、固液比等因素考察超声波法对金银花总黄酮提取的影响，获得最佳微波提取条件，并与传统乙醇回流法进行比较。为微波技术应用于金银花总黄酮提取开发提供理论基础。二、进度安排（起止时间：2010年10月9日～2011年4月22日）2010年10月～2010年11月搜集资料，确立研究方向，学习基本操作2010年11月～2010年12月完成外文翻译、撰写综述2010年12月～2011年1月完成开题报告，准备试验用品2011年1月～2011年3月工艺条件的研究完成实验2011年3月～2011年4月撰写毕业论文，准备论文答辩60 2011年4月完成毕业论文答辩及修改60三、主要参考资料[1]王艳，张铁军．微波萃取技术在中药有效成分提取中的应用[J]．中草药，2005，36(3)：470-473．[2]涂瑶生，毕晓黎.微波提取技术在中药及天然药物提取中的应用及展望[J].世界科学技术—中医药现代化，2005，7(3)：65-69．[3]江苏新医学.中药大辞典[M].上海：上海科学出版社，1997．[4]裴凌鹏，惠伯棣，金宗镰，等.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展[J].食品科学，2004，25(2)：203-207．[5]KimAntioxidantiveflavonoidsfromtheleafofMorusAlba[J].ArchPhamRes,1999,22(1):81.[6]KayoDoi.StudiesontheconstituentsoftheleafofMorusAlba[J].ChemPhamBull,2001,49(2):151.签名栏：学生：指导老师：学院领导：注意：1．任务书由指导老师填写、院领导审核，学生、指导老师、院领导均应签字。2．此任务书要求在毕业论文（设计）工作开始前下达。60 本科毕业论文(设计)开题报告学院生物工程专业生物工程姓名学号指导老师职称合作老师/职称/题目微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件的研究题目性质实验研究√技术开发工程设计应用型调查型其他一、选题依据和目标（该研究的目的、意义、国内外研究现状及发展趋势）1.1研究目的及意义金银花，为中药材和植物的统称。植物金银花又名忍冬，为忍冬科多年生半常绿缠绕木质藤本植物。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。药材金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花。金银花自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等证，均效果显著。目前，已见微波辅助提取应用于其他植物黄酮类化合物的提取，未见该法应用于金银花总黄酮的提取。本文拟利用乙醇溶液做溶剂对金银花进行微波处理，目的在于优化金银花总黄酮提取的工艺条件。在单因素试验的基础上，以总黄酮含量为指标，采用正交试验方法考察液固比、乙醇浓度、提取时间等因素研究微波提取工艺参数，为进一步工业化生产提供理论依据。1.2国内外研究现状及发展趋势60 金银花黄酮作为药用有独特的药理方式和良好的疗效，且毒副作用很低，从而成为治疗冠心病新药开发和研究的热点之一。目前研究试验证明金银花具有消炎、杀菌、降压、治疗冠心病之效。金银花又属于2002年卫生部公布的“既是研究，食品又是药品的物品”。而微波法具有穿透性强、选择性高、加热效率高等特点，越来越多被用来提取中草药中的有效成分，成为一种普遍的提取方法。从文献检索情况来看，国内外近5年对金银花的研究主要集中在对有效成分的提取、含量测定、有效成分的药理活性等方面。2003年，张睿、徐雅琴对提取黄酮类化合物的工艺进行研究综述，阐明了9种提取方法（水提法、碱性水或碱性烯醇提取法、有机溶剂提取法、微波法、超声波法、酶解法、大孔树脂吸附法、超滤法、超临界萃取法）的优缺点。2004年，李莉研究了金银花黄酮类化合物的提取方法，选择水或70%乙醇为溶剂，微波处理或非微波处理桑叶的各种方法提取桑叶总黄酮。研究结果表明，经微波处理10min桑叶，以70%乙醇作溶剂提取桑叶总黄酮的浸出率最高。2006年张璐、刘强等，通过对茯苓多糖制备工艺及药理作用研究进展进行综述，结果为茯苓多糖的制备方法有发酵醇沉法、稀碱浸提法、水提醇沉法、微波辅助提取法；茯苓多糖具有抗肿瘤作用、免疫增强作用、保肝与催眠作用、抗衰老作用、抗单纯疱疹病毒作用、抗炎作用、防石消石作用等。2007年王宏磊、彭永宏等在对超声波法提取剑花总皂苷工艺研究实验中，利用超声波法，采用正交实验对剑花总皂苷提取工艺进行研究。结果表明，提取剑花总皂苷的最优条件为：粒度80目，最佳溶剂水，超声时间40min，溶剂挥干温度80℃，料液比l:2。2007年，邓光辉、周桂等在超声波法乙醇提取山楂叶黄酮的研究中，突破山楂叶中有效成分黄酮的提取主要使用的传统乙醇提取法，在超声波条件下，采用正交实验设计考察了乙醇浸提山楂叶中黄酮的提取工艺条件。综上所述,微波辅助提取法已经在较多植物黄酮的提取中得到应用，且作用效果明显。该方法提高了黄酮的提取率，减少了有机溶剂用量，缩短了提取时间。本实验通过对微波提取金银花总黄酮的工艺条件研究为药理药效研究提供材料，同时为其进一步开发奠定基础。目前，未见有微波辅助提取方法应用于金银花的提取。鉴于目前的状况，其产业化道路仍较漫长。从长远来看，若能总结出最佳提取工艺，应用于金银花总黄酮工业化生产，则有非常光明的产业化前景。6060 二、课题关键问题及难点2.1溶剂的选择浸出液的溶剂选择，必须是对有效成分溶解度大，对无效成分溶解度小(不溶解或杂质沉淀)，不能与金银花中黄酮的成份起化学变化而影啊有效成分。而且扩散性、渗透性强，价廉易得，安全无毒的溶剂。溶剂选择不当，不但给生产带来了麻烦，还会严重影响提金银花总黄酮的质量和澄明度2.2提取温度在高温度条件下，分子之间碰撞的次数加剧，有效成份被破坏，无效成分浸出量增加，这不仅增加了浸出物质的杂质，而且容易引起某些不耐热成份和挥发性较强的成份分解、变质或挥发掉。而温度过低也会影响金银花总黄酮的提取。因此，应注意微波辐射的时间和功率的控制。2.3活性炭脱色脱脂后的黄酮醇溶液浓缩至50mL左右加入0.02g/mL粉末活性炭于50℃保持30min，然后过滤。脱色可反复进行，直至颜色符合要求或色值不能再降低。活性炭脱色简便易行，效果也好，但活性炭脱色后，过滤相当困难，并且活性炭作为脱色剂时，由于其对黄酮的吸附作用，会造成黄酮一定量的损失，对黄酮得率也会有较大影响，如何避免，是难点也关键问题。三、完成该课题研究已具备的条件（有关的研究工作基础，仪器设备条件，经费情况）3.1研究工作基础在实验准备阶段，查阅了大量相关金银花总黄酮提取文献，为实验开展提供理论基础。本人具有一定的专业知识技能和相关实验经验。经过指导老师葛老师的帮助，结合文献资料中的有关资源，确立了研究方案，技术路线合理。3.2主要仪器设备条件本实验操作的实验室具有实验过程所需要的所有试剂，仪器，设备这些为实验的开展提供了保障。3.3经费情况本实验在实验设计及操作过程中，在指导老师葛老师、学院老师和同学们的指导鼓励和帮助下。实验一切经费预算合理，主要用于对金银花、对照品及其所必须试剂的购买。准备充分，保证实验能顺利进行。四、研究方案（拟采取的研究方法或试验方法及主要技术路线）60 4.1实验材料及设备4.1.1材料供试材料：金银花，60℃烘箱内烘干，打粉备用。所用材料经鉴定为菊科金银花试剂：芦丁对照品（批号：10080-2003016，含量91.7%）购于中国药品生物制品检定所；所用试剂亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠95%、乙醇皆为分析纯；所用水为去离子水。4.1.2实验设备粉碎机（DFT-100克上海新诺仪器厂）微波炉（WP700型格兰仕微波炉有限公司）；电子天平（AG135型上海精密科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（018268型金坛市大地自动化仪器厂）；旋转蒸发仪（RE-52AAA型上海嘉鹏科技有限公司）；循环水式真空泵（SHB-ⅢA河南省太康科教器材厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9140A型上海森信实验有限公司）；紫外722型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；自动平衡离心机（TDZ5-W型赛特湘仪离心机仪器有限公司）。4.2拟采取的研究方法或试验方法4.2.1标准曲线的制备 4.2.1.1最大吸收波长的选择方法以亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠为显色剂，分别作各样品提取液以及芦丁标准品的吸收曲线，在510nm处均有1个强吸收峰，因此选择510nm为测定波长。4.2.1.2对照品溶液的制备方法 精密称取芦丁对照品10.2mg置50mL容量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。4.2.1.3标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5mL，分别置10mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3mL，振荡摇匀，放置6min；再加入10%硝酸铝0.3mL，振荡摇匀，放置6min；最后加入4%氢氧化钠试液4mL，加甲醇定容至刻度，摇匀，放置15min。采用分光光度法，在510nm处测定吸光度，以对照品量（mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。60 4.2.2微波提取单因素实验方法分别考察不同的微波辐射功率,辐射时间,乙醇浓度,固液比对提取效果的影响4.2.3提取工艺正交试验设计方法系统考察微波提取法的工艺参数，根据已有的资料及实际情况，选用微波辐射功(A),辐射时间（B）,乙醇浓度(C),固比(D)作为考察因素，以测得的浸提取样品中总黄酮含量为考察指标，选用择L9(34）正交表设计，得到供试液。4.2.4总黄酮含量测定方法取0.5ml液，加入5%亚硝酸溶液0.3ml荡摇匀，放置6min加入10%硝酸铝0.3ml荡摇匀，放置6min入4%氢氧化钠试液4ml,30%（V/V）乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min分光光度法，在510nm定吸光度值由标准曲线计算得总黄酮含量。金银花总黄酮含量按以下公式计算:金银花总黄酮得率%=式中:C—根据标准曲线查到的浓度V2—所取供试液的总体积V1—浓缩液定容的体积V0—由V1所取的试剂体积4.2.5微波辅助提取法与乙醇回流法比较比较两种提取方法的处理时间和液固比对总黄酮提取量的影响。传统乙醇回流法提取总黄酮的所需时间比微波辅助提取法提取长得多，且金银花总黄酮提取量比较低;而微波辅助提取的总黄酮较乙醇回流法高。比较此两种方法在最佳条件下的总黄酮含量。4.3研究内容该研究主要分为以下四部分:4.3.1设计微波提取金银花总黄酮的最佳工艺条件，制备供试液。4.3.2最大吸收波长的选择方法研究。4.3.3配置标准芦丁作对照品制备标准曲线方法的研究。4.3.4用紫外分光光度法测定粗总黄酮的含量60 4.4实验主要技术路线金银花粉碎、烘干粉末浸提、微波处理滤液蒸发浓缩浓缩液干燥、溶解总黄酮粗品定容含量计算0.10.090.074.5研究进度安排2010年10月～2010年11月搜集资料，确立研究方向，学习基本操作2010年11月～2010年12月完成外文翻译、撰写综述2010年12月～2011年1月完成开题报告，准备试验用品2011年1月～2011年3月工艺条件的研究完成实验2011年3月～2011年4月撰写毕业论文，准备论文答辩2011年4月完成毕业论文答辩及修改五、参考文献[1]房方，张广强，谢新年用分光光度法进行黄酮类化合物含量测定的研究[J]河南中医药学刊,2002,12(1):17～19．[2]江苏新医学院[J]．中药大辞典．下册．上海：上海科技出版社，2002．132．[3]章绍，丁炳杨．浙江植物志总论[M]．杭州：浙江科学技术出版社，2004．186．[4]扬俊，蒋惠娣，徐娟华．金银花总黄酮的提取工艺及其含量的动态变化研究[J]．中草药．2002，33(11)：990-993．60 [5]张睿，徐雅琴，时阳.黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品与机械,2003,(1)：21-22.[6]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社,2000．[7]涂瑶生，毕晓黎.微波提取技术在中药及天然药物提取中的应用及展望[J].世界科学技术—中医药现代化,2005,7(3)：65-69．[8]张秀明，茯苓药理作用研究概况[J]．中药材，2001,24(6)：445-449．[9]A.Machuca,Napoleao,AM.FMilagres.Detectionofmetal-chelatingcompoundsfromwood-rottingfungiTrametesversicolorandWolfiporiacocos.WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology，2001,17:687-690．[10]邓光辉，周桂，刘榕城.微波法乙醇提取山楂叶黄酮的研究[J].2007,(1):01-02．[11]ZhangWJ.BiochemicalResearchTechniquesofCompoundPolysaccharides.Hangzhou.ZhejiangUniversityPublishers,1998.11-12.[12]HeZX.BiochemicalExperimentTechniques.Beijing:ChemicalIndustryPress,2004.72.[13]HuGJ,XuMH.AppilcationofextractioninorganicsampleanalysisofenvironmentJiangsuEnoirnSciTech,1997,1:31-33.六、指导老师意见签名：年月日七、学院意见学院负责人签名：年月日60 本科毕业论文(设计论文(设计)文献综述学院生物工程专业生物工程姓名学号指导老师职称合作老师/职称/题目微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件研究文献综述（主要包括国内外现状、研究方向、进展情况、存在问题、参考文献等）黄酮类化合物提取及应用的研究进展摘要：黄酮类化合物是广泛存在于植物中的一类多酚类物质，具有强生物活性与药理活性。文章综述了近些年来黄酮类化合物在结构特征、功能研究以及提取方法等方面的研究进展，并对未来研究方向进行了讨论和展望。关键词：黄酮类化合物；提取方法；药理作用；应用1黄酮类化合物简介黄酮类化合物是在植物中分布非常广泛的一类天然产物，其在植物体内大部分与糖结合成昔类，有一部分是以游离态的形式存在，由于最先发现的黄酮类化合物都具有一个酮式碳基结构，又呈黄色或淡黄色，故称黄酮。现在所讲的黄酮类化合物已远远超出这种范围，有的并非黄色、而是白色、橙色及红色等，分子结构也有显著差异，其共同的特是均含有湛本碳架，即两个苯环通过三个碳原子相互连接而成。同时，黄酮分布广泛，生理活性多种多样，黄酮具有抗活性氧自由基能力和类SOD活性…，有良好的免疫调节作用，能显著增强人体对不良环境和疾病的抵抗力，并且不含任何有害成分和抗营养因子，对人体无毒、副作用，具有极大的安全性。最新研究表明，黄酮还具有明显的解毒功效，因此引起了人们的广泛研究。60 2黄酮类化合物的药理作用2.1抗氧化、清除自由基作用研究证明，黄酮类化合物具有抗氧化作用。黄酮类化合物具有C6—C3—C6双芳环联结形式，分子中心的α，β不饱和吡喃酮具有抗氧化活性，是极好的天然抗氧化剂。类黄酮的抗氧化能力与其所含羟基的数量和位置有关，研究表明，类黄酮确实具有清除活性氧自由基的作用，特别是清除O2效果更好，且清除能力依次为：芦丁>槲皮素>桑色素>橙皮甙。所以类黄酮可预防动脉硬化、癌、糖尿病、帕金森氏病等疾病，有抗衰老作用[9]。2.2降血糖、降血脂、抗粥样硬化作用浙江大学医学院俞灵莺闭等报道，金银花总黄酮对糖尿病模型大鼠有显著的降血糖作用，其降血糖作用的途径之一可能是桑叶总黄酮对小肠刷状缘膜上双糖酶活性的抑制作用，可减缓葡萄搪吸收入血，从而减缓餐后血糖的升高，降低血搪峰值。通过高脂血症动物实验发现，叶中黄酮类化合物:黄蔑昔、异栅皮素、茵芋昔具有抑制血清脂质增加和抑制动脉粥样硬化形成的作用。2.3降血压作用Doik图等报道，从金银花中分离出多种活性成分如黄酮及其衍生物，金银花中的芸香昔、概皮素、概皮昔能增加离体及在位蛙心的收缩力与输出量，并减少心率。芸香昔使蟾蛛下肢及兔耳血管收缩，搬皮素可扩张冠状血管，改善心肌循环。卜氨基丁酸、芸香昔、榭皮素具有降血压的作用，充分证实桑叶黄酮类化合物能够起降血压的作用闭阁。2.4其他作用朝鲜学者幻侧等发现金银花中分离纯化的两种黄酮类化合物QU等人对人早幼粒白血病细胞似的生长表现出显著的抑制效应，后者还诱导了HL.60细胞素的分化。焦晶晶圃等报道发现桑叶中含有的黄酮类化合物是一种很有潜力的天然护肤因子。3黄酮类化合物提取方法黄酮类化合物的提取方法主要有机溶剂法提取、热水提取、酸提取、碱提取、超滤提取等，近年陆续出现了超声技术提取、微波法提取和超临界流体萃取法。3.1水提法　覃洁萍等[1]取藤茶300g，加水煎煮2次，趁热过滤，合并滤液浓缩后，放置3天，析出浅黄色颗粒状结晶，抽滤，干燥，得粗结晶72.6g60 ，收率为24.2%。水提法的优点是成本低、安全性高，适于工业生产。缺点是总黄酮提取率较低，易将可溶于水的杂质如蛋白质、糖类提出，加大了进一步分离的困难，且易致霉变。此外，一些黄酮苷元难溶或不溶于水，不适于用水提法提取。3.2碱提取酸沉淀法黄酮类虽有一些极性，可溶于水，但难溶于酸性溶液，易溶于碱性溶液，故可用碱性溶液提取，然后将溶液调为酸性，即可将黄酮类沉淀析出。在用碱酸法提取纯化时，应避免用强碱，用强碱尤其在加热时易破坏黄酮母核。在加酸酸化时，酸性也不宜过强，以免生成盐使析出的黄酮类化合物重新溶解。当花、果类药材中含有大量果胶、黏液等水溶性杂质时，宜用石灰乳或石灰水提取，使含羧基的杂质在提取的同时生成钙盐沉淀，不被溶解[2]。3.3有机溶剂提取法对苷类和极性较大的苷元如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等，常用某些极性较大的溶剂如甲醇、乙醇或混合溶剂提取，对大多数苷元则用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性较小的溶剂提取[5]。虽然有机溶剂对黄酮的提取率高，但缺点是（1）大多有机溶剂都易燃易爆；（2）多数有机溶剂有毒或具有强刺激性，会危害人体和污染环境，（3）一般成本较高。3.4超声波法　超声波辅助提取[8]具有提取效率高、不破坏有效成分的特点，目前已广泛用于提取生物碱、苷类等生物活性成分。对超声波辅助提取银杏叶中黄酮苷的研究表明，超声波辅助提取可以强化提取效果，缩短提取时间，提高原料的利用率。汤建国等[3]比较了从柑橘皮中超声提取与常规浸提二氢黄酮橙皮苷的效率，结果表明，超声法用时短，提取温度低，收率是常规浸提法的1.61倍。但超声波提取对容器壁的厚薄及容器放置要求较高，否则会影响药材的浸出效果，目前仍处于小规模实验阶段，要用于大规模生产，尚需进一步解决有关工程设备的问题。3.5微波提取法微波提取是利用不同结构的物质在微波场中吸收微波能力的差异，使基体物质中的某些区域或提取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被提取物质从基体或体系中分离，进入介电常数较小、微波吸收能力相对差的提取剂[4]。此法的主要优点是（1）可有效地保护药材中的功能成分，对提取物具有较高的选择性，提取率高；（2）提取速度快、省时，溶剂用量少；（3）安全、节能、设备简单，节省投资[5]。李嵘等[6]以水为介质用微波技术提取银杏叶黄酮苷，30min提取率可达62.3%，与传统乙醇-水浸提5h的提取率64.1%相近。微波技术用于中草药提取尚在起步阶段，其提取机制与工艺有待进一步研究。60 3.6酶解法　提取植物有效成分的过程中，当存在于细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力[17]。选用适当的酶作用于药用植物材料，如纤维素酶、果胶酶等，可使细胞壁及细胞间质中的纤维素、果胶质等降解，破坏细胞壁的致密结构，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，比传统水浸提工艺提取率提高了25.1%。　酶法[8-10]作用条件温和，但有局限性,（1）酶的最佳温度及最佳pH值往往在一个范围内，必须严格控制酶反应时的温度及pH值，因此，实验设备的要求较高;（2）酶法提取过程中，有可能改变中草药中某些成分结构，产生新的化学物质，影响产物的纯度及收率[7]。3.7超临界CO2提取法与有机溶剂法相比，超临界流体提取技术具有提取效率高、无溶剂残留、活性成分不易被破坏等优点，还可以实现选择性萃取和分离纯化。研究表明，以银杏叶黄酮为例，所得提取物中银杏黄酮含量为28％，银杏内酯含量为7.2％，均高于现行的国际标准。此外，研究表明，经过超临界流体萃取，银杏叶提取物中的毒性成分白果酸含量可由2％降至0.02％[13]。4黄酮类化合物的应用研究4.1黄酮类化合物在保健食品中的应用随着消费水平的提高，人们越来越注重提高生活质量，保健食品日益受到人们的关注。据预测，2010年我国保健品市场销售额将达1000亿元。在众多的天然活性成分中黄酮类化合物是极有应用潜力的资源之一。黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，而黄酮类化合物广泛存在于植物体中，因此近年来各国科学家都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步加工成具有抗癌、抗衰老、调节内分泌等特异功能的保健食品。黄酮类化合物在食品中的应用形式比较单一，主要是作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用[15]。从产品形式看种类不多，基本上是液态饮品、果蔬汁饮料、低度发酵酒、茶等。其利用方式主要有2种：一类是直接应用黄酮提取液制成保健品食品；另一类是将提取液经浓缩、纯化等深度加工，得到高纯度的黄酮类化合物产品。4.2 黄酮类化合物医药制品开发4.2.1 抗心血管病药物60 黄酮类化合物具有防止心脑血管疾病的作用。国内外先后研制开发了以银杏叶提取物制成的各种制剂，用于治疗冠心病、心绞痛、脑血管疾病等均有良好的疗效。利用沙棘总黄酮开发的天然药品可治疗心绞痛、预防动脉粥样硬化、心肌梗塞、脑血栓等。此外利用山楂叶中提取总黄酮制成的片剂，对治疗冠心病的总有效率为90％[18]。4.2.2 抗肝脏毒素药物从紫花水飞蓟种子中提取总黄酮，内含水飞蓟素、异水飞蓟素、次水飞蓟素，是常用抗肝素药的重要有效成分。具有刺激肝细胞形成、抗脂质过氧化作用，用于治疗肝炎、肝硬化，并能支持肝的自愈能力，改善健康状况[16]。4.2.3 止咳平喘药我国研制的124种防治气管炎的植物药中就有69种其主成分是黄酮类化合物，包括黄酮醇、双氢黄酮及其甙，大多具有消炎、止咳、平喘功能。4.2.4 天然抗氧化剂黄酮类化合物作为合成抗氧剂如BHT、BHA等替代品具有高效、低毒等特点，研究表明[21]，茶多酚可以有效抑制油脂的过氧化物形成和多稀脂肪酸的分解，从而延长油脂的货架期。茶多酚已在保健食品、鱼油、食用油中得到广泛应用。研究表明，其具有较好的抗氧自由基作用，比VE强50倍，比VC强20倍，而且能通过血脑屏障，防治中枢神经系统的疾病。5目前国内外研究发展趋势和前景近年来，黄酮类化合物的提取、分离鉴定日益受到人们的关注。此外，高新技术如微胶囊包埋、冷冻干燥、膜分离、超临界流体萃取等以及多种技术的耦合，为黄酮类化合物的提取、分离、纯化[20]、鉴定等提供了更为精确的方法和手段。然而，对其吸收、代谢机制、活性机理、具有生理功能的活性基团、稳定性等方面仍缺乏全面的认识。因此，黄酮类化合物的开发利用具有广阔的前景。6存在问题微波辅助提取法已经在较多植物黄酮的提取中得到应用，且作用效果明显。该方法提高了黄酮的提取率，减少了有机溶剂用量，缩短了提取时间。本实验通过对微波提取金银花总黄酮的工艺条件研究为药理药效研究提供材料，同时为其进一步开发奠定基础。目前，未见有微波辅助提取方法应用于金银花的提取。6参考文献[1]金银花总黄酮的提取工艺及其含量的动态变化研究[J]．中草药，2002,33(11)：988-990．60 [2]涂瑶生，毕晓黎.微波提取技术在中药及天然药物提取中的应用及展望[J].世界科学技术—中医药现代化,2005,7(3)：65-69．[3]江苏新医学.中药大辞典（下册）[M].上海：上海科学出版社,1997．[4]裴凌鹏,惠伯棣,金宗镰等.黄酮类化合物的生理活性及其制备技术研究进展[J].食品科学，2004,25(2)：203-207.发酵工艺研究[J].酿酒科技，2005,(2)．[5]王艳，张铁军．微波萃取技术在中药有效成分提取中的应用．中草药，2005,36(3)：470-472．[6]张英，俞卓裕，吴晓琴．中草药和天然植物有效成分提取新技术—微波协助萃取．中国中药杂志，2004,29(2)：104-106．[7]陈斌，南庆贤，吕玲.微波萃取葛根总黄酮的工艺研究．农业工程学报，200l,l7(6)：123-125．[8]戴玉锦，卢明，冯玲．微波法从柚皮中提取黄酮类化合物的工艺研究．江苏农业科学，2006，(1)：121-123．[9]邓光辉，周桂，刘榕城.微波法乙醇提取山楂叶黄酮的研究.2007,(1):01-02．[10]胡碧波，吴祖帅，蔡君，等．金银花中主要黄酮的测定及影响因素考察[J]．中国中药杂志，2006，31(21)：117-119．[11]扬俊，蒋惠娣，徐娟华．金银花总黄酮的提取工艺及其含量的动态变化研究．中草药．2002，33(11)：990-993．[12]张睿，徐雅琴，时阳.黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品与机械，2003，(1)：21-22.[13]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].人民卫生出版社，2000．[14]涂瑶生，毕晓黎.微波提取技术在中药及天然药物提取中的应用及展望[J].世界科学技术—中医药现代化，2005，7(3)：65-69．[15]张秀明，茯苓药理作用研究概况[J]．中药材，2001,24(6)：445-449．[16]YasumoriTamuraa,Ken-ichiNagayasu.Flavonoid5-glucosidesfromthecocoonshellofthesilkworm,Bombyxmori[J].Phytochemistry,2002,59(3):275-278.[17]KimSy.AntioxidantiveflavonoidsfromtheleafofMorusAlba[J].ArchPhamRes,1999,22(1):81-83.[18]HeZX.BiochemicalExperimentTechniques.BeijingChemicalIndustryPress,2004,72-74.[19]HuGJ,XuMH.Appilcationofextractioninorganicsampleanalysisofenvironment.JiangsuEnoironSciTech,1997,1:31-33.[20]ZhangWJ.Bi-ochemicalResearchTechniquesCompoundPolysaccharides.Hangzhou.ZhejiangUniversityPublishers,1998,11-12.60 本科毕业论文(设计)外文翻译学院专业生物工程姓名学号指导老师职称合作老师/职称/题目微波辅助提取金银花总黄酮工艺条件研究译文一：通过Box-Behnken设计方法优化微波萃取芹菜中锌和铁MostafaKhajeh&EsmaelSanchooli摘要这篇文章叙述了一组程序对锌和铁测定的发展过程，这组程序通过响应面分析法（简称RSM）分析，测定则是在微波系统萃取后的食品样品中，采用火焰原子吸收光谱法（简称FAAS）。一个箱线图矩阵被用来寻找程序的最优条件，通过响应面法研究。三个变量“辐照功率、时间、温度”作为优化研究中的三因素。工作环境的建立作为发现每个分析物最优值之间的一种折衷。这些值分别是：温度800C，辐照功率105W，时间9min。这种方法被应用到在芹菜样品中测定锌和铁。说明芹菜已经成为一个普通的家庭主食，伴随着胡萝卜、洋葱和土豆。它的松脆质地和独特的风味使得它成为沙拉和煮菜中流行的添加物。芹菜在减肥饮食中很宝贵，它提供低卡路里的纤维体积，而且它有降低高血压的潜在力量。消费蔬菜是由重金属进入食物链的重要通路之一。　农地非农化和城市环境都遭受着金属污染，这是由于污水灌溉和交通排放。因此，人类暴露于污染的蔬菜60 是健康中心的一个问题。锌和铁是人体所必需的矿物质，人体吸收大量的生物分子来维持正常结构、功能和细胞不断增值。然而，这些金属在使用过量后就会有毒性作用，尤其是在某些遗传病。食物是暴露在人体中的锌和铁的主要来源。因此在食品中测定这些金属总是适宜的。微波辅助萃取（简称MAE），也称微波萃取，是结合微波萃取和传统溶剂萃取的一种萃取技术。研究显示MAE有很多优点，比如较短的时间、较少的溶剂、较高的萃取率、较好的产品并且成本较低。在分析化学多元实验设计技术的使用变的越来越广泛。多元设计，允许同时优化几种控制变量，比单变量的方法更快实施而且有较高的性价比。最流行的多元设计之一是两级满阶乘，在这种设计下每一个因素只有在两个层次做实验研究。由于它们的简单性和成本相对较低，满阶乘设计对最初研究和一个优化的初始步骤很有用，尽管当问题包含大量因素时阶乘设计几乎是强制的。在另一方面，由于只有在两个层次中使用，这些模型对这些设计的适用性是有点限制。如果一个更复杂的模型是必需的，对于一套最佳制备条件，那么一个人必须付诸于增大响应面设计，这就需要多于两个因素水平了。在这些设计当中，箱线图设计是基于三级不完整的阶乘设计的二阶多元设计，已经在关键实验条件下的评估得到广泛应用，也就是，最大或者最小反应函数。实验所需的数量要求这种设计的发展被定义为N=2k(k-1)+C0,k是因子数目，C0是复制数量的中心点。目前的工作是叙述发展，通过响应面方法论（简称RSM），用一个有三个变量（辐照功率、时间、温度）的箱线矩阵，一组程序对锌和铁测定则是在微波辅助萃取系统优化萃取后的芹菜，通过FAAS。实验仪器测量用KonikWonM300火焰原子吸收光谱法（简称FAAS）,用氘灯背景校正，组装了常规气压喷雾剂，气压喷雾室是用来分析的。空心阴极灯是用来测定锌和铁的。铁的最敏感波长为248.3nm，锌为213.9nm。锌和铁的带宽分别为0.5nm和0.2nm。火焰组成是乙炔（流量，每分钟1.5L）、空气（流量，10.0L/min）、燃烧器高度设定为8mm。喷雾剂的流量吸尘保持在5.0L/min到5.5L/min之间。微波萃取在风气摘录被执行。材料硝酸在默克中具有最高清洁度在使用，也可用于回收。试剂ZnCl2和FeCl360 就具有最高纯度，在不需要进一步进化方可使用。Fe和Zn溶液的准备是通过溶解适当容量的Fe和Zn盐，在双重蒸馏水的10mL的瓶中。稀释的解决方案的准备是通过适当稀释溶液，在双重蒸馏水中。MAE过程部分样品被转移到萃取容器中，用10mL的作为萃取溶剂。根据最初的实验设计，萃取在多种条件下都能进行，温度范围是50到10000C，辐照功率从50到150W，辐照时间是5到15min。萃取之后，辐照样品被转移到10mL的容积式烧瓶中，并且容器要完全密封。在这个方案中样本浓度是通过FAAS分析的。实验设计分析方法的优化可以通过两种不同的方法来执行：通常以传统的单变量的方法为代表的一个过程“每次研究一个变量”，这个很容易解释但是需要更大量的试剂和时间来完成。另外，变量之间的萃取是不考虑的。另一种方法需要多元技术，这种技术很快，很经济也很有效率，而且允许同时萃取多于一个变量。RSM是多元技术，它适合数学实验领域，通过一个响应函数在理论设计中研究。RSM是实证二技术，致力于评价一系列因素控制的实验和观察结果之间的关系。它需要得出统计模型过程的先验知识。基本上，这个优化过程包括三个关键步骤，执行统计设计实验，估计数学模型的系数，预测系统的响应速度和检查模型的充分性。这些显著变量，如温度、辐照功率、时间被选择作为关键变量，被分别指定为X1、X2、X3每个变量的低、中、高水平被分别指定为-，0和+，在表1中已经给出。实验的实际设计在表2中给出。结果与讨论MAE（平均绝对误差）的优化：MAE优化步骤的进行使用Box-Behnken设计，不同影响因素的选择：微波功率、时间和温度及其他参数即保持不变干燥的样品(1.0g)与溶剂的体积（10mL）。实验所需的数量调查如前所述三参数分为三个等级27（33）,但是现在用一个Box–Behnken设计数量减少到十五，结果这个有限的一系列实验提供了一个统计模型,该模型被用来确认高产趋势进行了提取过程，表2显示了矩阵编码和响应为解析信号为每个个体的金属，下面说明关系方程的四个变量，即辐射功率(P)、时间(t)、温度(T)和分析反应：A(Zn)=0.527175–0.006213(T)–0.002329(P)+0.016929(t)+5.2×10−5(T)2+1.40×10−5(P)2–4.95×10−4(t)2–9.0×10−6(T)(P)–4.7×10−5(T)(t)–1.7×10−5(P)(t)60 方程从相应考虑如图1所示该方程的衍生方程如下：A(Fe)=0.14028–6.54×10−4(T)–7.38×10−4(P)–0.00618(t)+3.0×10−6(T)2+3.0×10−6(P)2–1.6×10−5(t)2–1.0×10−6(T)(P)–3.3×10−5(T)(t)+3.9×10−5(P)(t)表面反应的关键问题是解决这些方程的条件计算这些关键部分的方法层发表在ntosetal.2004，方差分析的结果如表3：计算的临界点如下:Zn:温度（T）=74.86°C,辐射功率（P）=114.28W,辐射时间（t）=11.58minFe:温度（T）=85.71°C,辐射功率（P）91.69W,辐射时间（t）=7.01min为了建立一个对样本有用的单一因素实验，T,P,t设置为80°C,105W,δ和9.0min，60 需要指出的是,在此情况下,通过实验模型预测,定量萃取的元素才能得以实现。一般来说,更高的萃取温度萃取是由于溶解度的增长，是因为在较高的温度下引起的电子相互作用的溶剂对减少,上升到更高的分子运动,造成溶解性的增加，提高温度,也可能导致细胞基质的开放，结果随着提取金属可用性的增加而增加，此外,在高温下,溶剂中的溶解度随粘度增加而降低,从而达到提取效率的增加，在注册的参考资料分析锌和铁，程序的精确度被确认，即米粉也是我们企业10a，结果:达到±1.913.1±0.9为锌和铁，价值观是为34.7±注册1.1±1.4和12.7%,分别对锌和铁，这些调查结果表明,前面提出的观点得到了验证。分析应用优化后的方法用于测定锌和铁分别在芹菜中的含量。其结果在表4结论 研究证明了MAE作为一个快速高效萃取程序的适用性，并且它的优点是无需复杂的清理。MAE用的时间比传统的萃取方法短。另外，用先进的优化方法，萃取你感兴趣的复合物更有选择性而且跟传统的萃取过程在相似或者可比回收率的情况下相比较显得更加快速。 RSM跟经典实验或者在一次实验中只用一个变量的优化方法相比，有很多优点。首先，RSM可以从少量实验中得出大量信息。事实上，经典的方法很耗费时间而且需要大量的实验来解释系统的行为。其次，在RSM中，观察独立参数对反应的交互作用成为可能。该模型方程简单地阐述了独立参数对二进制组合的影响。另外，经典模型把独立变量的反应联系起来，这个独立变量是用来获取关于这个过程的信息。综上所述，我们可以说RSM是优化的一个有用工具，最后，RSM也代表了一种更加经济的方法，因为实验的数量可以显著降低。箱线图设计已经被证明是极有价值的工具，允许定义实验参数的精确最佳值，也使得用少量实验评估变量之间的相互作用成为可能。 60 箱线矩阵的应用成为一种可能、快速、经济、高效的提出程序的优化策略的方法。MAE程序为了在芹菜样品中定义铁和锌，不再需要9.0min时间，105.0W的辐照功率、80.00C的温度而不断发展。 60 60 60 60 60 译文二：优化微波萃取人类苯等离子体P.Fernández&C.Vázquez&R.A.Lorenzo&A.M.Carro&I.Álvarez&P.Cabarcos摘要一个简单快速的微波萃取（MAE）方法，已经评估为固相萃取（SPE）的代替品，SPE对六地西泮的确定在欧洲很多国家被广泛规定在人体血浆。对于MAE的优化，一个实验设计使用萃取时间、温度、溶剂体积作为影响参数。一个期望函数被定义，为了同时优化MAE方法。方差分析显示溶剂体积对所有的样本测试的优化有积极的影响，已经成为统筹全局的重要因素。同时，萃取时间在四地西泮的萃取中的作用更为突出。选择MAE的一种情况：温度89°C、时间13min、8mL的氯仿对应4mL的丙醇：89.8+0.3%到102.1+5.2%的回收率，因为苯二氮卓类运采用高效液相色谱法结合二极管阵列检测技术。MAE和SPE的比较结果表明MPE方法更为实用，因为它处理样品简单高效。苯二氮卓类用户就MAE的适用性在27种等离子种成功测试。在短期内，苯二氮卓类（简称BZD）是非常有用的精神刺激药物，对紊乱症状很有帮助，比如焦虑、癫痫、失眠。然而，严重的副作用源于长期经常使用治疗药物，自备配方或者使用过度剂量。酒精和BZD所产生的效应相结合也许就是一种有助于过激行为的添加剂。性犯罪和暴力行为可能和BZD的消费有联系，也会导致法医学的并发症。依赖是可能的风险更大的强效，短效BZD就像阿普唑仑。在开催眠和焦虑性的处方是，谨慎是必须的，因为长期使用就会产生极大的依赖性。量化在等离子体也许有助于慢性定量优化，验证符合性和识别改变在药代动力学。由于这些原因，可靠的优化，快速简单的方法，要控制BZD在等离子体要求节约时间和金钱，而且不丧失灵敏度和再现性分析方法。液相色谱法已经成为常规测定的一个重要工具，由于它的特异性，速度和灵敏度。尽管高效液相色谱法（简称HPLC）的质谱检测有很高的选择性，但是仪表的费用使得它不适合临床或者毒理学实验室。总而言之，HPLC-UV检测或者二极管阵列检测（简称DAD）仪表在分析实验室广泛应用。一个有效的样品预处理程序之前,液相色谱分离是必须的为了提高灵敏度。液-液萃取和固相萃取（SPE），在线SPE和固相微波萃取已经成功被运用。不同的分析方法已经高效发展和建立来设别和量化化合物；一些选定的基于BZD应用的相关信息已在表格1中。类似极限的检测（简称LODs）在每毫米毫微克的水平已经实现与不同的检测系统，用气相色谱法或者HPLC分离。60 微波萃取很适合进行常规分析，无需任何清洗步骤，这个方法效率很高。此外，MAE使得同步萃取比其它传统的制造工艺产生很少的浪费；因此，它被认为是一种清洁技术。大量报道关于应用这种技术在环保样品分析。MAE也已经成功被应用在分析各种医药、维生素和药物滥用，目前应用在制药和生物样品。配置法设计，提供一种可同时调查多变量和多重反应影响的方法，这种方法已经普遍被使用，比在一段时间内的一个因素的方法更实用，因为他们测试和评估任何变量之间的相互反映，需要相当少的实验来完成优化过程。这项研究的目的在于确定MAE作为替代品建立处理程序附页的适用性，比如SPE，为了同时提取人类等离子体中六种成分——　阿普唑仑，——疗效及毒素水平显示见表2.一种可行和可靠的HPLC-DAD方法的发展基于微波萃取在苯等离子体，这些等离子体的浓度低于治疗水平，这已经在带刺的样品中得到验证。这种方法被BZD用户用于分析真正的血浆样品。60 化学品BZD研究标准已经从Cerilliant那里获得。乙腈，氯仿，异丙胺和甲醇从Merck那里购买。纯化水从Milli-Q水系统获得。个别原料的解决方案是每毫升的药物含一毫克的甲醇。强有力的解决方案含有6BZD，它通过稀释原料来获得最终的浓度，允许等离子体的变化范围是0.06到2ug/mL。BondElutCertify黑盒是从瓦里安那里获得。仪表微波萃取器械采用MPR300/12风气加上S，并配有溶剂检测器。此器械可以同时提取12种样本，相同条件下在封闭容器萃取，用同步磁力搅拌样本和溶剂。车载压力控制系统的安装是为了监测和控制血管内提取的压力和条件。这个烤箱所允许的最大功率是1000W，这个功率变化直到达到所选择的温度。分析表明，一个水相色谱连接到二极管阵列检测器模型，也来自水域。用千年软件程序进行数据加工。样本被注入到不锈钢柱，不锈钢柱来自水域。确保分辨率最优峰值，因此在合理的短时间内高效分离样本，用流动相洗脱，包括乙腈混合物（简称溶剂A）和0.02M的磷酸盐缓冲剂pH值为7.5（简称溶剂B），流动0.8mL/min，在梯度模式中是0-12min，35%的溶剂A和65%的溶剂B；14-30min，40%的溶剂A和60%的溶剂B；35min，35%的溶剂A和65%的溶剂B。二极管阵列检测器允许波长在200nm到400nm之间波动以便获得色谱图，即使我们决定在230nm工作，波长也非常接近6BZD的吸收极大值，也就证明可以获得同时色谱响应。60 等离子样本来自加利西亚输液中心无毒的等离子体可以用与校准标准的制备。等离子样本是从中BZD毒的病人身上获得的，并存放在4°C的环境下，除非分析延迟，这种情况下样本就会结冰。所有研究执行都是根据世界医学协会的伦理原则，为了医学研究包括人来受试者。MAE程序等离子体在离心机上离心十min，14000r/min，为了消除可能共同萃取的化合物，引起矩阵效应。MAE条件被优化，为了萃取人类苯等离子体作为结果和讨论中的讨论。最终的优化过程如下：硼酸缓冲剂（2mL，pH值为9.0）加到1mL的等离子体中，样本在89°C萃取13min，用8mL的氯仿和2mL的丙醇。冷却后，打开萃取血管然后离心10min，4000r/min，来从水域中分离有机相。上清收集起来后在一种氮流中40°C集中干燥。萃取液在200uL的流动相溶解，产量比原本在等离子体中的五倍还多。高速离心5min，14000r/min后，20uL的上清被注入到色谱中。SPE程序用于SPE的方法已经准确地验证了，一个程序的所有描述在别处也报道过。总之，500uL的硼酸缓冲，pH值为9.0加到500uL的样本中，此样本含有BZD。用流形和黑盒从等离子体中分离药物，条件是2mL的甲醇和2mLpH值为6.0的磷酸盐缓冲剂。然后用5min烘干样本，此样本是3mL的氯仿对应2mL丙醇。萃取液有氮蒸气在40°C蒸发得到，然后重建成200uL的流相，产量比原本在等离子体中的五倍还多。最终，20uL的上清被注入到色谱中。验证程序程序一定程度上在线性和重复性和再现性得到验证。针对治疗和毒性浓度，校准曲线通过扣球空白的等离子体产生。校准曲线建立在六种浓度变化从60-2000ng/mL。精度在一定程度上表征了相对标准偏差（简称RSD），通过在三种不同浓度（0.06,0.4,2ug/mL）下分析五种带刺的人体血浆样本。样本的回收率被确定通过三种不同浓度（0.06,0.4,2ug/mL）的带刺的水样的分析。初步试验为了评估溶剂对萃取人类苯等离子的影响，许多研究已经全面展开，用不同的溶剂和混合物传统萃取生物矩阵的药物：（1）调查表；（2）种；（3）乙酸乙酯（4）氯仿/甲醇（体积1:1）（6）氯仿/异丙胺（体积1:4,1:1,4:1）。60 对于MAE，溶剂被作为一种需要良好的介电常数的萃取剂来吸收微波能并把它转化为热能。等离子体的含水矩阵通常过于加热样本促进它们释放到周围介质中。此外，高温度达到微波加热就会大幅度减少萃取时间和所需溶剂体积。在所有情况下，一毫升的空白等离子体相当于一微克的所有BZD研究。MAE的一般条件是这样：10mL的溶剂，80°C，6min。数据1显示溶剂或会溶解的混合物对带刺的目标样本的萃取的影响。己烷比其它溶剂更糟。己烷不能够萃取阿普唑仑，溴基安定和氯羟去甲安定，然而氯羟去甲安定当使用种是不被萃取。氯仿/异丙胺（体积1:4,1:1）混合后所提供的萃取产量比从大量的化合物研究氯仿中发现的少。氯仿/异丙胺（体积4:1）对所有的BZD提供最好的萃取结果，被选择为萃取剂。等离子样本和一体积的硼酸缓冲剂（pH值为9.0）混合，保证BZD在非离子化的形式下并且它们很容易转换成有机相。添加1,2或者4mL的缓冲液到1mL的等离子体估计用了MAE的一般条件，如上所述：10mL的氯仿/异丙胺（体积4:1），6min，80°C。1:2的比例混合对所有的BZD都能很好的萃取。MAE程序的优化温度，萃取时间和萃取溶剂的体积同步优化，通过制服外壳的设计，此设计有12此实验和三个中央点组成。在实验领域，五种不同温度（60,75,90,105和120oC），七种时间（2,4,5,7,9,10和12min），三种溶剂体积（4,7和10mL）都被测试过。实验设计的随机性避免了外部环境的影响。为每一个二次多项式模型BZD考虑：xi60 是因素研究的代码（萃取温度，时间和溶剂体积），y是从每个BZD中获得的回应。b值是估计多项式系数：b0是拦截术语，bi是代表每个变量主要影响的系数，bij是二次条款中的系数，负责曲率反映，bij（i≠j）系数描述萃取影响。实验设计一代和所有的统计分析使用统计软体执行。根据初步研究，氯仿/异丙胺（体积4:1）和等离子体/硼酸缓冲剂（体积1:2）是固定的两个因素。MAE的效率是通过对每个实验中得到的BZD峰面积的评估。对模型系数的估计是根据最小二乘线性回归计算得到，并且这些模型已经通过方差分析得到验证。不变的术语和主要影响的系数是相当显著的。溶剂体积是一个重要的因素，因为它对所有的BZD来说是积极的，有统计学意义的。萃取时间对那4种BZD也具有统计学意义，对它们中的三个具有积极影响但是对氯羟去甲安定有消极影响。一些相互作用和二次条件是有统计学意义的，呈现不同的影响。三维响应表明情节显示在给定条件下两个变量的影响，另外一个变量是常量。数据2显示，比如，有些反应模型开发的两个BZD。最好的反应在中高水平的温度以及溴基安定和阿普唑仑（Fig.2a）高水平的时间中得到了。然而，氯羟去甲安定，安定和四氢西泮显示了不同的行为，比较好的反应在高水平的时间但是是低水平的温度。对于氯羟去甲安定，较高反应在温度和时间相反的水平中得到了。另外，对于所有的BZD比较好的反应在高水平的时间和高水平的溶剂体积中得到了。然而，一个双重行为为阿普唑仑（Fig.2b），氯羟去甲安定和安定进行了观察研究；在这些情况下，高水平的时间和任意水平的溶剂体积都提供了高反应。为了发现同步优化条件，多标准决策策略用期望函数优化在没有额外的实验验证下被接受。这些期望函数被建立作为每个BZD反应的部分特征函数。这些反应结果被转变成一个无量纲的期望(di)规模，这个期望值从d=0时的不良反应变换到d=1时的完全符合预想的反应。在第二个步骤，一个全球性的期望函数（D），代表共同最佳的全球质量，是通过结合简单的期望函数和几何平均值计算得到。进一步的详细资料可以从别处发现。对大限度D可以从8毫升的氯仿/异丙胺（体积4:1，89摄氏度，13分钟）中获得（Fig.3）。在这些条件下，对所有的药品的di预测值都为1.0。60 MAE-HPLC-DAD方法的性能这已经提出的分析方法根据食品及药物管理局（简称FDA）和国际研讨会（简称ICH）的指导原则得到验证。样本可以从它们的保留时间（即，溴基安定7.66min，阿普唑仑10.52min，氯羟去甲安定17.85min，安定20.53min，四氢西泮26.44min）和是否吸收光谱鉴定出。生物矩阵中的内源性成分并不干扰感兴趣的血液样本（Fig.4，色谱图C），因此这种方法在等离子体样本中对BZD的决定性被成功选择。所有的混合物在浓度范围内研究都满足线性关系，并且回归系数振荡在0.9997和0.9999之间。表格3显示了这个方法的分析特征，通过HPLC-DAD计算SPE和MAE等离子体的萃取物。LOD被评为最低浓度，它给出色谱信噪比为3，且量化的限制（简称LOQ）被评为最低浓度，它给出色谱信噪比为10。LODs达到的范围为6.2到12.6ng/mL，LOQs获得的变化范围是20.7到42.0ng/mL。表格4显示了所有BZD的回收率和精度。日内精度从0.3%到4.3%的遥感数据之间变化，日外精度从0.3%60 到6.0%的遥感数据之间变化。平均回收率从89.8±0.3%到102.1±5.2%之间变化。比较MAE和SPE为了测试MAE和SPE校准曲线的统计学意义，有源光网络垂直取向（简称ANOVA）被应用到校准斜坡，测试结果显示MAE在校准斜坡上的变化，或者SPE在95%的置信区间的有意义的。因此，SPE相比MAE有稍高的校准灵敏度，只有溴基安定和四氢西泮对这两种萃取程序显示相似的校准斜坡值。表格3和表格4显示了应用两种萃取程序的相对有效性。所有的除四氢西泮以外的BZD在MAE过程中有较低的LODs和LOQs。在所有情况下精度都低7%，但是MAE在日内精度和日外精度的遥感数据方面稍有提高。双重ANOVA被用来评估回收实验的三个因素的不同之处：A，萃取程序；B，6BZD的分析；C，三种浓度（0.06,0.4和2mL）。回收方法的显著差异在95%的水平下与最少显著差异方法比较。在对BZD的分析（p=0.5622），浓度测试（p=0.7095）和它们的萃取过程中都没有发现显著差异（P>0.05）。当增加一两个萃取程序到BZD研究：AB互动（p=0.5884），回收率也没有差异。当增加一两个萃取程序在不同浓度下：AC互动（p=0.5043），回收率也没有显著差异。最终，在不同浓度下萃取BZD不能在任何回收率之间取得差异：BC互动（p=0.9968）。然而，显著差异在SPE和MAE的回收率（F=7.01，p=0.0111）中被发现（p<0.05）。多变域测试证实了这些结果并且显示SPE的回收形式已经一元化了，这同MAE的回收方法有显著差异，因为MAE得到的回收率均高于应用经典的SPE。另外，SPE相对与MAE给出更高的数据分布（SPE：65%到103.7；MAE：89.8%到105.3%）。根据ANOVA的结果，多范围测试结果显示回收率平均值获得在三浓度研究形成一个平均值的同类组。同样地，回收率平均值获得对所有的BZD也形成了一个平均值的同类组。人类血浆样品的BZDMAE的优化和SPE过程的建立被应用在十个BZD用户的血浆样品中，随后这些样品被HPLC-DAD混合。运用成对的t测试来比较两个样本准备程序的均值。这个测试基于两个测量值的成对差异。通常的虚无假设是均值之间的差异为0。t统计的95%置信区间内的均值是2.239，p=0.0610。因此α=0.05时H0是拒绝的，统计分析显示MAE和SPE对BZD的萃取不提供显著不同的结果60 。在此基础上的结果，优化的MAE-HPLC-DAD方法对等离子样品的常规毒物分析很有效，而且此方法已经被应用到接受BZD治疗的病人的17种等离子样品中。27个病例中的三个都用MAE加工处理过，发现两种不同的BZD（溴基安定和氯羟去甲安定，安定和氯羟去甲安定，四氢西泮和氯羟去甲安定）。然而，12个病例中发现的BZD显示毒素水平，然而18个病例显示了治疗水平。氯羟去甲安定在11种病例中得到论证（范围41.6-783.8ng/mL，平均水平224.9ng/mL），溴基安定在9种病例中得到论证（范围61.6-414.1ng/mL，平均水平201ng/mL）；阿普唑仑在7种病例中得到论证（范围48.4-222ng/mL，平均水平118.5ng/mL）；四氢西泮在2种病例中得到论证（范围73.8-457.6ng/mL，平均水平265.7ng/mL）；安定在1种病例中得到论证（平均水平241.2ng/mL）。数据4显示了色谱图，标准溶液所含6BZD是2ug/mL，一个真正的病例（含有溴基安定和氯羟去甲安定）和一个空白等离子。60 结论:人类等离子样本的MAE是一种强有力的，快速的和高产量的萃取方法。关于分析的总时间现如今成为最重要的因素之一，MAE比SPE更加快速，因为在一个微波炉里面12中样品可以同时萃取。一个简单，迅速及具有验证性的MAE-HPLC-DAD方法被优化，为了敏感的和适当的测定人血浆BZD在治疗和有毒的水平。BZD日常论证方法的适用性在一个毒理学试验室中展示。此外，可以肯定MAE方法对其它BZD也适用。60 60 60 60 60 60 60