微生物学实验目录

目录实验一、母液的配制和保存……………………………………………2实验二、培养基的配制与灭菌………………………………………….5实验三、外植体消毒与初代培养的建立……………………………….7实验四、继代与增殖培养………………………………………….9实验五、生根培养…………………………………………………11实验六、植物茎尖脱毒培养………………………………………13实习试管苗的炼苗与移栽……………………………………..15 实验一、母液的配制和保存一、实验目的通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。二、原理配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩20倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩200倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩200倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩200倍）等。三、实验材料、试剂和仪器设备1．试剂NH4NO3,KNO3,CaCl2·2H2O,MgSO4·7H2O,KH2PO4,KI,H2BO3，MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,Na2·MoO4·2H2O,CuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O,Na2•EDTA•2H2O，FeSO4·7H2O，烟酸，甘氨酸,盐酸硫胺素,肌醇,盐酸吡哆醇,蒸馏水2．仪器设备冰箱，天平，酸度计或pH试纸，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(500ml，1000ml)，药勺、称量纸、酸度计或pH试纸，滴管、玻璃棒，电炉，微波炉四、实验方法1.大量元素母液的配制 配制时先用量筒量取蒸馏水大约800ml，放入1000ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3,KNO3,KH2PO4,MgSO4.7H2O,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。2.微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4•4H2O，ZnSO4•7H2O，H2BO3，KI，NaMoO4•2H2O，CuSO4•5H2O，CoCl2•6H2O，按制备母液Ⅰ的方法逐个溶解。（钼酸钠难溶解，可在室温下用蒸馏水溶解后再加入到微量元素母液中。）定容至1000ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。3.铁盐母液配制把FeSO4•7H2O和Na2•EDTA•2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2•EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。4.有机化合物母液的配制按配方表中用量依次称取：维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。5.植物生长物质母液的配制 NAA母液：准确称量10mg，先用少量1mol/LNaOH溶液完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为0.1mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。6-BA母液的配制方法相似，母液浓度为2mg/ml。请注意细胞分裂素的溶解方法。五、实验报告按照实验报告格式要求及各组在实验中的配制溶液情况，完成报告撰写。附：MS培养基母液配方成分数量(mg/L)成分数量(mg/L)母液Ⅰ母液ⅡNH4NO333000MnSO4•4H2O4460KNO338000ZnSO4•7H2O1720KH2PO43400H2BO31240MgSO4•7H2O7400KI166CaCL2•2H2O8800Na·MoO4•2H2O50母液ⅣCuSO4•5H2O5肌醇20000CoCl2•6H2O5烟酸100维生素B1100母液Ⅲ甘氨酸400FeSO4•7H2O5560维生素B6100Na2•EDTA•2H2O7460 实验二、培养基的配制与灭菌一、实验目的学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。二、原理组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。三、实验材料、试剂和仪器设备1．试剂琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH2．仪器设备天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，滴瓶，酸度计或pH试纸，培养瓶，封口膜，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，微波炉，电炉，标签纸，记号笔四、实验步骤1.培养基的配制培养基组成：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂(pH5.8)①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液的用量如表1所示： 母液名称母液浓度扩大倍数500ml培养基吸取量大量元素20微量元素200有机成分200铁盐200NAA0.1mg/ml6-BA2mg/ml②取50ml烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用各母液专用移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和生长物质母液，置于烧杯中备用。③取500ml烧杯一个，加入300ml蒸馏水，称量琼脂4g倒入烧杯中，将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂完全溶化后，加入15g蔗糖，充分溶解后，将准备好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素母液混合液倒入烧杯中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入500ml烧杯中，并加蒸馏水定容。④充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。⑤把培养基分装到广口瓶中，每瓶约50ml。用封口膜封好瓶口。贴上标签，注明培养基名称，配制者姓名和配制日期，待灭菌。2.培养基灭菌（灭菌条件：121℃，15分钟）①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。 ④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。要求：每人准备培养基2瓶。提前准备实验三所需的无菌材料。五、实验报告附：稀酸和稀碱的配制方法1mol/LHCl取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。1mol/LNaOH称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。 实验三、外植体的消毒与初代培养的建立一、实验目的通过实验，初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。二、原理植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。三、实验材料、试剂和仪器设备1．实验材料：月季当年生枝条2．试剂：升汞，吐温-803.仪器设备（以各组所需为例）无菌器材：8瓶培养基4个不锈钢托碟+吸水纸1升无菌水大号、中号镊子各2把2把解剖刀、1把剪刀 2个500ml烧杯非无菌材料：0.1%升汞消毒液200ml1个250ml消毒缸2盏酒精灯及火机1个1000ml搪瓷缸(装废液用)1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、洗衣粉、喷雾器、鞋套、肥皂四、实验步骤1．实验二制备的培养基即是本实验所用培养基。2．接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。 3．选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好）。将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。3．准备进入接种间，用肥皂水清洗双手至手肘部位并在自来水下冲洗干净，进入缓冲室后套上鞋套。4．把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。消毒时间结束后在酒精灯火焰旁用无菌镊子将已完成表面灭菌的外植体转移到烧杯中，用无菌水清洗5次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒剂。最后一次清洗后将外植体转移到无菌托碟上，吸干水分备用。5．将消毒后的外植体按极性方向接种到培养基上，每瓶可接入3～4段月季茎段。将培养瓶放置在21±2℃，光强800～1200lx，光周期为12h的环境下培养。约30天长成具5～8片叶的无根试管苗。6．各组的每位同学操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中，由下一位同学在使用前灭菌。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。五、实验报告1.接种2天后观察污染情况，计算污染率。污染率=污染的材料数/总接种材料数×100%2.每周观察并记录外植体萌动的情况，包括外植体基部是否有愈伤组织出现及其出现时间，侧芽萌发时间及芽的生长状况（萌芽数及芽平均长度）等，并计算萌发率。并注意观察是否有芽玻璃化等异常情况出现。萌发率=侧芽萌发的茎段数/总接种材料数×100%六、思考题为什么常在消毒液中加入1～2滴表面活性剂如吐温-80？ 实验四、继代与增殖培养一、实验目的通过实验，掌握运用植物生长调节物质调控植物器官分化的方法。二、原理以植物的茎、叶等作为外植体进行离体培养，可以直接诱导器官分化，产生芽、根，形成新的植物体；也可以诱导其改变原来的分化状态脱分化形成愈伤组织。这种愈伤组织在一定条件下，又能“再分化”出根和芽等器官。在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控着培养细胞再生完整植株的不同方式。三、实验材料、试剂和仪器设备1．实验材料，实验三获得的月季无菌枝条2．试剂MS母液，各种植物生长物质3．仪器设备无菌器材：8瓶培养基3～4瓶4－6周龄月季无菌枝条4个不锈钢托碟+吸水纸大号、中号镊子各2把2把解剖刀非无菌材料： 1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml2盏酒精灯及火机1个橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套、肥皂1把大号镊子四、实验步骤1.培养基准备。增殖培养基，①MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L；②MS+6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L。2.接种室的灭菌见实验三。3.继代，将实验三的培养瓶转移到接种室，在将瓶放入超净工作台前用75%的酒精棉球擦拭瓶外表面，减少附在瓶外壁上的灰尘与微生物。然后在酒精灯火焰旁进行无菌操作，将无菌芽从原茎段上切下，切成1～2cm的带腋芽茎段转接到继代增殖培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽。4.培养，培养温度同于初代培养，将光强增至2000lx，光周期延长为16h/天，以免试管苗生长细弱。五、实验报告1.观察并记录月季茎段在增殖培养基上的生长和增殖情况，并计算增殖率（继代接种时的茎段数目与继代培养后所产生的茎芽数之比）。2.根据在两种培养基上的生长情况，确定最适增殖培养基。 实验五、生根培养一、实验目的同实验四。二、原理同实验四。三、实验材料、试剂与仪器设备1．实验材料，实验四获得的月季试管苗2．试剂MS母液，各种植物生长物质3．仪器设备无菌器材：8瓶生根培养基3～4瓶8～10周龄月季试管苗4个不锈钢托碟+吸水纸大号、中号镊子各2把2把解剖刀非无菌材料：1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml 2盏酒精灯及火机1个橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套1把大号镊子四、实验步骤1.培养基准备。生根培养基，①1/2MS+IBA0.5mg/L；②1/2MS+NAA0.5mg/L；③1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。2.接种室灭菌。3.接种培养，在超净工作台上进行无菌操作。选取生长粗壮的无根苗，切成2～3cm的茎段，分别转入①②③三种生根培养基中，于温度23±2℃，光强2000lx，光周期为12h的环境下培养。当幼苗基部伤口愈合，并出现白色根尖突出物时即可进炼苗和移栽管理。五、实验报告1.观察并记录月季无根苗在生根培养基上培养3～4周后的不定根发生情况，并计算生根率。生根率（%）=生根无根苗数/接种无根苗总苗数×100%2.比较3种生根培养基的诱导效果。六、思考题植物芽和根的分化与植物生长调节物质有何关系？ 实验六、植物茎尖脱毒培养一、实验目的熟练掌握外植体表面消毒技术及茎尖剥离和培养的基本方法。二、原理病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，成熟的组织和器官病毒含量较高，而幼嫩的和未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点则几乎不含或含量很少。三、实验材料、试剂与仪器设备1.实验材料,盆栽菊花,万寿菊或矮牵牛种子2．试剂MS母液，各种植物生长物质诱导培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+3%糖+0.7%琼脂，pH5.8增殖培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+3%糖+0.7%琼脂，pH5.8生根培养基：1/2MS+NAA0.1mg/L+珍珠岩3．仪器设备无菌器材：4瓶诱导培养基4个培养皿+吸水纸中号、小号镊子各2把 2把解剖刀、2把解剖针非无菌材料：1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml2盏酒精灯及火机1个橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套旧牙刷、金刚砂、珍珠岩、小花盆（10cm）研钵1个、镊子2把、解剖刀1把、解剖镜1台四、实验步骤1.母株病毒的鉴定（汁液感染法），取母株叶片放于等体积（W/V）的缓冲液（0.1mol/L磷酸钠）中，研磨成汁液，接种于万寿菊/矮牵牛鉴别寄主上。接种后，放置在18～25℃的防虫室中观察1个月，记载症状反应。2.取带顶芽茎段，长约3～5cm，除去叶，保留护芽的叶柄，用洗涤液充分清洗尤其是叶柄处，用软毛刷充分涮洗并在自来水下反复冲洗干净后，先用70%酒精处理30s，再用0.1%升汞消毒6分钟，并不时轻轻搅动。灭菌结束后用无菌水清洗5～6次，吸干水份，转入无菌三角瓶中备用。3.将已灭过菌的材料放入无菌培养皿中，在解剖镜下用解剖针剥去顶芽外面的幼叶，直至看到表面光滑呈圆锥形的生长点，只剩下1～2个叶原基，切取约0.3mm和0.5mm两个不同长度的茎尖，接种到培养基中培养。最好是放在培养基凝固时产生的冷凝水表面上，防止茎尖脱水，且正放。温度23±2℃，光强1000～3000lx，光周期12～16h培养。 4.约3天后茎尖开始萌动，颜色逐渐变绿，基部逐渐膨大，4～6周后形成丛芽。将诱导出的芽切下，转接到增殖培养基或生根培养基上进行培养。该步可根据具体条件进行。5.等组培苗长至2.5～3.5cm高时，具2～3片叶时，可从瓶中取出苗，用自来水冲洗干净基部附着的培养基后，整株放在研钵中磨成汁液。按1所述方法接种鉴别寄主和培养，观察组培苗是否脱去相应病毒。五、实验报告1.观察并记录茎尖在培养基上的生长情况，是否出现愈伤组织，芽的分化数及形态，生长长度，并统计茎尖的繁殖系数。2.比较两种不同接种长度的茎尖接种成功率。3.统计脱毒率。比较两种长度的脱毒效果。 实习试管苗的炼苗与移栽一、实验目的通过月季试管苗的炼苗与移栽管理，掌握组培苗炼苗与移栽的基本方法与过程。二、原理试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营养供应的特殊条件下，这样的试管苗若未经充分锻炼，一旦被移出培养瓶后难以适应自然环境的变化，则很快失水萎蔫至死亡。通过炼苗，逐步改变试管苗的生长环境，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能等，提高试管苗的适应能力，为移苗成功打下基础。三、实验材料、试剂和仪器设备1.实验材料，实验五所获得的月季生根苗2.试剂及仪器设备MS培养液，蛭石，河沙，园土，泥炭土，甲醛，高锰酸钾，多菌灵，育苗盘，喷雾器，塑料薄膜，温室四、实验步骤1.炼苗，将培养瓶放在温室自然光照下培养，同时昼夜有明显温差，5～7天后再打开封口膜使瓶中空气湿度降低，通气加强，2～3天后可移苗。2.移栽基质的准备，①蛭石；② 河沙：园土：泥炭土（1：1：2），拌和均匀。用甲醛和高锰酸钾进行熏蒸消毒。移栽基质要用能密封的器具盛装，然后在土中间放一小烧杯，将称量好的高锰酸钾倒入烧杯中，再把已量取的甲醛溶液慢慢倒入烧杯中，完毕，密封好器具。3天后打开器具取出基质在阳光下曝晒再装入育苗盘中。3.幼苗出瓶后，先洗去沾附的培养基，用0.1%多菌灵溶液浸泡后移栽于基质中，种植密度为2～3cm×4～6cm/株。移栽完后，一次性浇透水，并用0.1%多菌灵喷雾。当叶表面水珠消失后盖好保湿薄膜，保持温度15～25℃，湿度在85%以上，同时注意通风，控制光照在50%左右。每7～10天喷一次杀菌剂，待小苗成活并开始长新梢后可施稀薄的MS培养液作追肥。逐渐增强通风直至约2周后打开保湿薄膜。当叶片呈现深绿色、生长健壮，根长至，约50天后即可盆栽管理。五、实习报告详细记录试管苗的炼苗及移栽管理过程，报告生长现象及移栽成活率。