淀粉微生物检验操作规程

淀粉微生物检验操作规程1大肠菌群测定1.1设备和材料冰箱：2℃~5℃；恒温培养箱：36℃+1℃。恒温水浴锅：46℃+1℃；天平：感量0.1g。灭菌锥形瓶：500ml；灭菌玻璃珠：直径约5mm。灭菌平皿：直径90mm；灭菌试管：16mm×160mm。载玻片、盖玻片；灭菌牛皮袋、塑料袋。无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）灭菌金属勺、刀等。1.2培养基和试剂1.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。1.2.2煌绿乳糖胆盐肉汤。1.2.3结晶紫中性红胆盐琼脂。1.2.4无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min1.2.51mol/l氢氧化钠：称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。1.2.61ml盐酸：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。三、检验程序 36℃+1℃选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管25g（或25ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释36℃+1℃48h+2h产气不产气BGLB肉汤48h+2h不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性查MPN表报告结果四、操作步骤：1、以无菌操作称取检样25g（ml），放入含225ml灭菌生理盐水的具玻璃塞锥形瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。2、样品匀液的PH值应在6.5~7.5之间,必要时分别用1氢氧化钠或1盐酸调节。 3、用1无菌吸管吸取1：10样品匀液1，沿管壁缓缓注入9磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管洒端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1无菌吸管反复吹打，使其混匀均匀，制成1：100的样品液。4、根据对样品污染状况的估计，从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15分钟。5、复发酵试验：用接种环从所有48h+2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃+1℃培养48h+2h，观察产气情况，产气者，计为大肠菌群阳性管。6、大肠菌群最可能数（MPN）表（见附录B），报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。大肠菌群最可能数（MPN）的检索表阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.10.010.001下限上限0.10.010.001下限上限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012<3.03.03.06.16.29.43.67.2117.4111115169.21420152027-------0.150.151.21.23.60.171.33.61.33.63.64.54.51.43.64.53.74.58.79.59.611181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100>11004.58.78.78.78.74.68.71791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100-------注1：本表采用3个稀释度[0.1g(或0.1ml)、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml）]，每个稀释度接种3管。 注2：表内所列检样量如该用[1g(或1ml)、0.1g（或0.1ml）和0.01g（或0.01ml）]时，表内数字应降低10倍；如改用[0.01g(或0.01ml)、0.001g（或0.001ml）和0.0001g（或0.0001ml）]时，则表内数字相应增高10倍，其余类推。2霉菌测定2.1设备和材料冰箱：0℃~4℃；恒温培养箱：25℃+28℃显微镜：10×~100×；架盘药物天平：0g~500g，精确至0.5g。灭菌锥形瓶：500ml；灭菌玻璃珠：直径约5mm灭菌平皿：直径90mm；灭菌试管：16mm×160mm载玻片、盖玻片；灭菌牛皮袋、塑料袋；灭菌金属勺、刀灭菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）等。2.2培养基和试剂孟加拉红培养基：按GB/T4789.28-2003中4.80规定灭菌生理盐水。2.3检验程序 25g样+225ml0.85%盐水做成几个适当倍数的稀释液选择三个适宜的稀释度，各取1ml加入灭菌平皿内淀粉每皿加入适量培养基（孟加拉红培养基）菌落计数报告2.4操作步骤：1、以无菌操作称取检样25g（ml），放入含225ml灭菌生理盐水的具玻璃塞锥形瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。2、用灭菌吸管吸取1：10稀释液10ml，注入灭菌试管中，另用1ml灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。3、取1ml1：10稀释液注入含9ml灭菌生理盐水的试管中，另换一支1ml灭菌吸管吹吸五次，此液为1：100稀释液。4、按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1ml灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择三个合适的稀释度，分别在做10倍稀释的同时，吸取1ml稀释于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿，然后将晾至45℃左右的培养基注入平皿中，并转动平皿使之与样液混匀，待琼脂凝固后，倒置于25℃~28℃温箱中，3天后开始观察，共培养5天。 5、计算方法：通常选择菌落数在10~150之间的平皿进行计数，同稀释度的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母数。6、报告：每克（或毫升）淀粉所含霉菌和酵母菌数以cfu∕g(ml)表示。