重组人神经肽y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究论文

　　重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究论文丁克祥董萍郑永晨杨永鹏朱晓亮韩晋云单志新丁宇丁振华【摘要】目的在大肠杆菌中表达人神经肽Y，并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析。方法取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28aNPY转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDSPAGE检测和ethodsTherebinantplasmidpET28aNPYedatography.ThenbioinformaticanalysisoftheNPYproteinidpET28aNPYexpressedrebinanthumanNPYprotein.HighlypurifiedNPYfusionproteinatography.RelatedbiologicalcharacteristicsofNPYidpET28aNPYcanbesuccessfullyexpressedinDE3.HighlypurifiedproteinscanbeobtainedbyNi2+NTAaffinitychromatography.NPY′sbiologicalcharacteristicsarepredicted,ent.【Keyatics人神经肽Y(Neuropeptide,NPY)是一个由36个氨基酸组成的多肽,广泛分布于中枢和外周神经系统。此外,NPY也存在于其他组织、器官及腺体中。NPY影响摄食行为、激素分泌、心血管功能、调节体温、生物节律、性行为及情绪等各种生物功能,故越来越受到人们的重视。NPY释放后主要通过NPY受体起作用，不同受体起不同的作用,各组织所含受体种类及分布密度也不相同〔1，2〕。近来研究表明NPY可在局部作用于内皮细胞及脂肪细胞上Y2受体，促进局部脂肪组织生长。而且在NPY的作用下，局部脂肪移植物可存活更长时间不被机体吸收〔3，4〕。据此，理论上不仅可通过局部增加NPY的量，使更多的NPY作用于Y2受体促进该部位脂肪组织的增加;还可通过局部注入NPY抗体，使其中和游离的NPY蛋白，减少NPY与Y2受体的结合而达到该部位脂肪组织减少的效果。即以NPY为靶标，促进脂肪组织的转移。为此,本研究用基因克隆技术在大肠杆菌中制备NPY的融合蛋白,一方面获得高纯度的NPY蛋白，另一方面所得的蛋白制备NPY抗体,以便用于脂肪转移和肥胖代谢综合征的临床前研究。1材料与方法1.1材料E.coliBL21(DE3)、含有测序正确的重组质粒pET28aNPY的保存菌均由本室保存;蛋白Marker购自TaKaRa公司;鼠抗人Anti6×His抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG均购于天根生化科技有限公司;镍离子亲和层析预装柱及化学发光显色试剂购于QIAGEN公司;蛋白电泳仪、电转移仪(BioRad公司);cientz IID超声细胞粉碎机为宁波新芝科器研究所产品;其他所用试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1重组人NPY融合蛋白的诱导表达用接种环沾取少量含有重组质粒pET28aNPY的保存菌，于LB(Kan+)平板上划线，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接种于5mlLB(Kan+)液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日取培养过夜菌液500μl再接种于50ml选择性LB液体培养基中，振荡培养至OD600值达0.6。吸取1ml后加入IPTG，终浓度为1mmol/L，37℃继续诱导培养4h。取加IPTG前和后的菌液各1ml，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀，并于沉淀中加50μl蒸馏水，混匀后再加2×SDSPAGE上样缓冲液50μl，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心10min，每个样品取20μl上样于15%的SDSPAGE胶上电泳，电泳结束后取考马斯亮兰R250染色2h，然后脱色，拍照记录结果。1.2.2包涵体的释放据上所述，在2000ml的摇瓶中装500ml的LB液体培养基扩大诱导规模。将诱导表达菌液，4℃以5000r/min离心15min，收集菌体沉淀;加入25mlPBS，吹打充分悬浮菌体沉淀，4℃12000r/min离心30min，弃去上清，依此反复冲洗菌体沉淀3次;加入细胞裂解液25ml，吹打使菌体沉淀均匀悬浮;将菌体沉淀悬浮液置-20℃冷冻，再于室温融化，如此反复冻融3次;4℃12000r/min离心细菌冻融液30min，弃去上清，在沉淀中加入超声裂解液25ml，吹打混匀;置冰上对细菌冻融液进行超声处理，10min/次，处理时间30min;超声处理后，于4℃12000r/min离心30min，弃去上清，沉淀为菌细胞裂解沉淀物。1.2.3包涵体的提纯菌细胞裂解沉淀物中加入含4mol/L尿素的包涵体提纯液25ml,吹打混匀，室温静置30min,.freelin离心30min，反复3次，即得到包涵体沉淀物。1.2.4包涵体的裂解于包涵体沉淀物中加入包涵体裂解液25ml，吹打混匀，室温静置6h，使包涵体充分裂解,2000r/min离心30min，收集上清液，即为包涵体裂解物。1.2.5变性蛋白的复性将收集的包涵体裂解物上清液加入到处理过的透析袋中，扎紧透析袋两端;将透析袋整体浸没于蛋白复性液，在4℃条件下透析;复性液中的尿素浓度从7～1mol/L依次递减,在每个尿素浓度梯度复性液中透析3～4h。每次更换不同尿素浓度复性液之前，需要将透析袋内的样品吸出，在4℃12000r/min离心30min，再把上清液加入透析袋内，重新扎紧进行透析;透析完毕后，将样品取出，4℃12000r/min离心30min，再将上清液加入透析袋，在4℃预冷的PBS中透析20h;取出透析好的样品，4℃12000 r/min离心30min，收集上清液即为复性产物。-70℃保存。1.2.6复性产物的纯化①上样：将复性产物缓慢加于已用PBS缓冲液平衡的镍离子亲和层析预装柱中，加样所用的流速要控制在1ml/min以内;②冲洗：PBS洗涤除去未结合蛋白，冲洗流速应控制在5ml/min以内;③洗脱：分别用含50、100、150mmol/L咪唑PBS缓冲液洗脱融合蛋白，流速5ml/min。纯化后取20μl上样于15%的SDSPAGE胶上电泳。1.2.7纯化产物ODEL三级结构预测服务器，预测结果见图8。2.4.7抗原性分析利用在线软件对NPY的抗原性进行分析结果如图9所示，有2个抗原决定簇可供选择，以便进行相关实验。3讨论NPY的N端和C端各有一个酪氨酸残基和酪氨酰胺残基,C端的酰基化对NPY的生物活性至关重要,N端的酪氨酸残基与稳定NPY的三级结构和结合NPY受体密切相关。NPY作为一信号分子在不同物种间具有高度的保守性。人体内NPY相关的受体有五种(Y1～Y5),主要存在于中枢神经组织中,此外在外周组织也有分布。其中与脂肪组织相关的受体主要有Y1、Y2、Y5〔3，4〕。NPY通过与Y2的作用刺激内皮细胞增殖分化,在血管生成过程中发挥重要作用〔5～7〕，Kuo等〔4〕的研究表明NPY在脂肪重塑、饮食所诱导的肥胖加剧及伴随的代谢综合症形成中有重要的作用。他们认为NPY与Y2受体相互作用通过血管生成而引起内皮细胞及脂肪细胞的增殖、分化。这表明NPY可作为一介质来增加移植脂肪的体积。Baker〔3〕等的研究进一步表明NPY与Y2受体作用可引起机体内新的脂肪生成,并可减少机体对移植脂肪的吸收。脂肪组织内含有成熟的脂肪细胞及间质细胞。NPY具体作用于成熟脂肪细胞还是作用于间质细胞或者是同时作用于二者后引发相应的生理反应有待进一步研究。脂肪增加对血管生成有一定的依赖性,血管抑制为肥胖的治疗提供了一种新手段〔5〕。VEGF及bFGF对于血管生成及脂肪组织源性干细胞分化形成成熟脂肪细胞也有促进作用〔6〕。这些都为临床脂肪移植研究奠定了基础。脂肪组织要想在所移植部位存活,丰富的血供是必不可少的。其次,在血供保障的情况下如果所移植的脂肪组织细胞能够增殖、分化、进行自我更新的话,那将会弥补被机体吸收掉的那部分脂肪组织,保持移植脂肪的体积不变,即提高其存活率。因此，可将NPY、VEGF及bFGF进行综合研究，以期对脂肪转移在临床应用的探索有实质性进展。 笔者利用DNA重组技术克隆了NPY基因〔7〕，且将其与pET28a载体连接后表达于DE3中。即以BL21(DE3)/pET228a+作为表达体系。pET28a表达载体在N端含有HisTag寡聚组氨酸链,因此,表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。本文所设计的NPY融合蛋白N端为36个氨基酸组成的非目的蛋白，其中包含一个Histag，其后的目的NPY蛋白也有36个氨基酸。即pET28aNPY表达的融合蛋白共由72个氨基酸组成,分子量约10kD左右。用6×Histag抗体进行elioratesbodyetersindietinducedobesemice〔J〕.PNAS;2006，103(18):71548.2PittnerRA,MooreCX，BhavsarSP,etal.EffectsofPYY〔336〕inrodentmodelsofdiabetesandobesity〔J〕.ObesRelatMetabDisord,2004;28：96371.3BakerSB，CohenM，KuoL,etal.TheroleoftheneuropeptideY2receptorinliporemodeling：neuropeptideYmediatedadipogenesisandadiposegraftmaintenance〔J〕.PlastReconstrSurg，2009;123(2):48692.4KuoLE，KitlinskaJB，TilanJU,etal.NeuropeptideYactsdirectlyintheperipheryonfattissueandmediatesstressinducedobesityandmetabolicsyndrome〔J〕.NatMed，2007;13:803.5MovafaghS,HobsonJP,SpiegelS,etal.NeuropeptideY(NPY)inducesmigration，proliferation，andtubeformationofendothelialcellsbimodallyviaY1，Y2，andY5receptors〔J〕.FASEBJ，2006;20：132737.6LedouxS，QueguinerI，MsikaS,etal.Angiogenesisassociatedanobesity〔J〕.Diabetes，2008;57(12):324757.7董萍,丁克祥,杨永鹏,等.与人体肥胖相关的神经肽Y基因的克隆及序列分析〔J〕.国际护理学杂志,2009;28(2):2579.