微生物遗传育种课程论文

微生物单细胞蛋白的遗传选育和应用前景张臣（山东农业大学生命科学学院生物工程专业09级03班）摘要随着世界人口的不断增长，粮食和饲料不足的情况日益严重。面对这一严峻的现实，单细胞蛋白的开发与生产为解决人类食品和饲料问题开辟了新的途径。因此，对生产单细胞蛋白的微生物利用诱变育种、航天育种、反向代谢工程育种和基因工程育种等现代微生物育种技术进行遗传选育越来越有必要。一旦我们能根据自己的需要来设计和获得某种单细胞蛋白，这将会解决一直困扰人类的粮食问题，甚至还会推动其他很多行业和领域的发展。关键词微生物单细胞蛋白生物特性遗传选育应用前景GENETICBREEDINGANDAPPLICATIONPROSPECTABOUTSIMPLECELLPROTEINOFMICROBEAbstractWiththeworldpopulationgrowing,thelackoffoodandfeedismoreandmoreserious.Facedwithsuchseveresituation,thedevelopmentandproductionofsimplecellprotein(SCP)supplyanewwaytosolvetheproblem.Therefore,itismoreandmorenecessarytodealwiththemicrobethatcanproduceSCPbymeansofmodernmicrobialbreedingtechnology,suchasmutationbreeding,spacebreeding,reversemetabolicengineeringbreedingandGeneengineeringbreeding.Oncewecandesignandgetasinglecellproteinaccordingtoourownneeds,itwillworkoutthefoodproblemthathasbeenperplexinghumanbeingsforalongtime.Inaddition,itmaypushsomeotherindustriesandfieldsforward.Keywords:Microbe；Simplecellprotein；Biologicalcharacteristics；Geneticbreeding；Applicationprospect8 微生物细胞含有丰富的蛋白质，而这正是人和动物不可缺少的营养物质，这是微生物食品倍受青睐的一个原因。人们热衷于微生物食品的开发，还有一个重要的原因，就是它可以解决因人们对蛋白质的需求增加而导致的粮食供求矛盾。因为人从动物中获取蛋白质营养，而动物的蛋白来源往往又离不开以粮食作为主要原料的饲料供应，因此人们对蛋白质的需求量增加，也就导致了用于蛋白质生产的间接粮食消耗的增加。由于耕地的减少、人口的增加，难以提供更多的粮食用于改善人们的食品结构。而微生物可以帮助人类解决这一矛盾。真菌、酵母菌、单细胞藻类、细菌等微生物的结构十分简单，往往一个个体就是一个细胞，然而它们生产蛋白质的本领却很强，所需要的培养条件简单，对底物的要求也不高。因此人们选准了这些细胞生物作为获取蛋白饲料和食品的源泉。通过培养单细胞微生物获得的蛋白质称为单细胞蛋白。一般从单细胞培养物中可以获得45%-80%的蛋白质，18-20种氨基酸，此外还有丰富的维生素、脂肪和糖类，对人和动物均具有较高的营养价值，且各种氨基酸搭配合理，维生素含量高、成本低、产量高、原料广等特点，特别对于缓解世界面临食物短缺、环境污染和能源缺乏等问题尤其显得重要。【1】通过对生产单细胞蛋白的菌种进行遗传选育，利用诱变育种、航天育种、反向代谢工程育种和基因工程育种等现代微生物育种技术改变其生物学特性，比如通过诱变提高产量或者改变蛋白结构等，从而获得人类想要的蛋白。这要比饲养家畜更加方便，更加廉价，甚至更加高产。一、单细胞蛋白的特性与来源单细胞蛋白是通过培养单细胞生物而获得的菌体蛋白质。用于生产SCP的单细胞生物包括微型藻类、非病原细菌、酵母菌类和真菌。1.1单细胞蛋白的生物特性【2】1.1.1SCP营养丰富蛋白质含量高达40%～80%，比大豆高10%～20%，比肉、鱼、奶酪高20%以上；氨基酸的组成较为齐全，含有人体必需的8种氨基酸，尤其是谷物中含量较少的赖氨酸。单细胞蛋白中还含有多种维生素、碳水化合物、脂类、矿物质，以及丰富的酶类和生物活性物质，如辅酶A、辅酶Q、谷胱甘肽、麦角固醇等。1.1.2原料来源广泛生产单细胞蛋白的原料来源极为广泛，成本较低。一般分为四类：一是糖质原料，如淀粉或纤维素的水解液、亚硫酸纸浆废液、制糖的废蜜等；二是石油原料，如柴油、正烷烃、天然气等；三是石油化工产品，如醋酸、甲醇、乙醇等；四是氢气和碳酸气。最有前途的原料是可再生的植物资源，如农林加工产品的下脚料、食品工厂的废水下脚料等。这些资源数量多，而且用后可以再生，还可实现环境保护。1.1.3生产速率高一般蛋白质生产速度同猪、牛、羊等体重的倍增时间成正比。微生物的倍增时间比牛、猪、鸡等快千万倍，如细菌、酵母菌的倍增时间为20～120h，霉菌和绿藻类为2～6h，植物1～2周，牛1～2个月，猪4～6周。据估计，一头500kg公牛每天生产蛋白质0.4kg，而500kg酵母至少生产蛋白质500kg。8 1.1.4劳动生产率高 生产不受季节气候的制约，易于人工控制，同时由于在大型发酵罐中立体式培养占地面积少。如年产10万吨SCP工厂，以酵母计，按含蛋白质45%计算，一年所产蛋白质为45000t。一亩大豆按亩产200kg计，含蛋白质40%，则一年为80kg蛋白质，所以，一个SCP工厂所产蛋白质相当于562500亩土地所产的大豆。1.1.5可以完全工业化生产 单细胞蛋白生产比农业生产需要的劳动力少，又不受地区、季节和气候条件的制约，可在占地有限的小设备上进行，不仅数量大，而且质量好，远远超过现有粮食品种的蛋白质。许多国家单细胞蛋白的生产已具有很大的规模，取得了丰硕成果。前苏联年产单细胞蛋白质达数百万吨以上，保加利亚也有几十万吨之多。德国、美国、前苏联、加拿大等国早已用单细胞高活性生物饲料代替了鱼粉。1.1.6单细胞生物易诱变，比动、植物品种容易改良 可采用物理、化学、生物学方法定向诱变育种，获得蛋白质含量高、质量好、味美，并易于提取蛋白质的优良菌种。1.2用于生产单细胞蛋白的微生物种类用于生产单细胞蛋白的微生物种类很多，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌以及某些原生生物。这些微生物通常要具备下列条件：所生产的蛋白质等营养物质含量高，对人体无致病作用，味道好并且易消化吸收，对培养条件要求简单，生长繁殖迅速等。单细胞蛋白的生产过程也比较简单：在培养液配制及灭菌完成以后，将它们和菌种投放到发酵罐中，控制好发酵条件，菌种就会迅速繁殖；发酵完毕，用离心、沉淀等方法收集菌体，最后经过干燥处理，就制成了单细胞蛋白成品。【3】二、菌种的遗传学选育回顾微生物育种技术的发展过程，其大至分为自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种以及基因工程育种几个阶段。对微生物进行育种是进行工业化生产的重要前提，育种后必须适合大规模培养的工艺要求，并且拥有相对稳定的遗传性能，不能轻易发生变异。然而国内对单细胞蛋白的研究主要是集中在了对生产工艺的研究上，既然选育菌种是所有工作的前提，那么就很有必要探讨一下育种技术在生产单细胞蛋白上的应用。2.1高产单细胞蛋白酵母的诱变育种国内某高校在2010年曾对单细胞蛋白酵母进行了诱变育种及培养条件的优化，从而获得了高产的酵母菌。【4】所使用的供试材料为某啤酒厂废弃的啤酒酵母泥，8 从啤酒废酵母把中分离纯化酿酒酵母，紫外诱变使其发生基因突变，培养一段时间后，用分光光度计测定吸光度筛选出吸光度大于出发菌株的诱变菌。将初筛得到的菌株制备成种子液，接到基础发酵培养基，摇床培养一段时间后，将发酵液离心并用蒸榴水洗涤，收集菌体，研磨成粉，用凯氏定氨怯测定其SCP含量，筛选出SCP含量较高的诱变菌株。用紫外线对出发菌株进行照射，选择适当的照射时间，经过初筛和复筛得到诱变菌株是关键。值得注意的是，一定要控制好照射时间，如果照射时间过长，可能导致菌体细胞大量死亡；照射时间过短，就会起不到诱变的作用。再对诱变条件进行优化，如从PH、培养温度、接种量和碳源等方面进行改进，会使诱变育种更加成熟，效率更高。虽然化学诱变剂也能起到很好的诱变效果，但是会对蛋白有比较大的损害，而我们所要获得的产品就是蛋白，所以化学诱变剂很少采用，最好还是采用物理或生物的方法进行诱变育种。诱变育种和其他育种方法相比，具有速度快、收益大、方法简单等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，在生产中使用的十分普遍。但是诱变育种缺乏定向性，因此诱变突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。在物理诱变因素中，紫外线比较有效、适用、安全，其他几种射线都是电离性质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性。目前，多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定，人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂以达到预期的育种效果。2.2航天诱变高产单细胞蛋白菌株航天育种起初只是应用在种子的诱变和培育方面，不过随着微生物技术的不断进步，已逐渐渗透到人们的生活中，利用微生物当生产用的“种子”已经崭露头角。自然而然的，各国的科学技术人员做了很多航天诱变微生物菌种的试验，以求获得人们所需要的菌株。将航天高技术与传统的物理化学诱变及分子技术等相结合，利用卫星或高空气球携带，搭载微生物等生物体样品，经特殊的空间环境条件（强宇宙射线，高真空，微重力等）作用引起生物体的染色体畸变，进而导致生物体遗传变异，经地面选育试验后，能快速而有效地育成生物的新品种，供生产和研究使用。2008年时有关的科学技术人员就利用航天诱变技术获得了高产单细胞蛋白啤酒酵母YB-6菌株。【5】他们通过对经航天诱变的啤酒酵母多级平板分离、摇瓶筛选，得到了一株能在玉米秸秆水解液中生长且高产单细胞蛋白的YB-6菌株。2.3利用杂交育种技术获得优良菌株杂交育种是利用两个或多个遗传性状差异较大菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式，而导致其菌株间的基因的重组，把亲代优良性状集中在后代中的一种育种技术。杂交育种理论基础是基因重组。由于杂交育种选用了已知性的供体菌和受体菌作为亲本，所以不论是方向性还是自觉性,均比诱变育种前进了一大步。[6]对生产单细胞蛋白的菌种进行杂交育种时，两种菌种可以都是产蛋白的菌株，这样就会增加产品的营养价值，也可以是一种产蛋白的菌株与另一种生长速率很快的菌株杂交，这样可以大大提高蛋白的产量。这项技术已经逐步取代了传统的诱变育种技术，具有高效性和很强的目的性。8 2.4利用基因组改组技术获得优良菌株蛋白质往往是多亚基的，而不同的亚基往往是由不同的基因控制的，这就需要我们对菌种的遗传背景有充分的了解才行。而基因组改组技术无须对菌种遗传背景十分清楚，能够有效地对由“多基因”调控的性状进行改良。宏基因组的研究为基因组改组技术的发展奠定了基础。它是通过直接提取环境中的混合微生物总基因组，并构建宏基因组文库，直接得到环境中微生物的遗传信息，从而避免了微生物分离纯化的繁琐过程。因此一个宏基因组文库就包含了某一特定环境中全部的基因多样性。如果以宏基因组作为微生物育种的定向进化来源进行基因组改组，将得到取之不尽的遗传多样性，为微生物育种提供更加广阔的选择空间，预示着宏基因组改组技术在微生物育种以及应用上有着广阔的前景。[7]目前已有报道将宏基因组作为提供多样性蛋白质的来源，通过宏基因组的DNA改组，得到了原核生物微量表达的稀有蛋白质。2.5利用反向代谢工程育种技术获得所需菌株代谢工程发展的三个阶段：正向代谢工程、反向代谢工程和进化代谢工程。利用基因组学进行的称为反向代谢工程。传统的代谢工程以代谢反应网络为基础，以代谢分析和代谢改造为主。20世纪80年代兴起反向代谢工程，从限制生物活性的主要因素入手，确定决定某表型的基因型，然后用基因重组技术将目的基因导入宿主菌中，并得到所希望的理想表型。蛋白质工程就是其中一项利用反向代谢的原理而出现的新技术。蛋白质的化学合成和修饰以及利用基因工程进行蛋白质表达是人类认识和利用蛋白质的巨大的飞跃。然而人们并不能满足于此，因为不论是蛋白质的人工合成还是天然蛋白质的化学修饰都存在很多局限，如得到的多肽长度、成本、修饰专一性等问题。相比之下基因工程表达蛋白质有很大的优势，但离达到人们所需要的蛋白质的性能还有很大距离。这就向蛋白质的研究利用提出了更高的要求，蛋白质工程恰恰能够满足这个要求。[8]实施目标是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。目前，利用反向代谢工程选育菌株已经成为研究热点，随着这项技术的发展，人们将会获得自己想要的任何一种且在自然界中不存在的蛋白质。三、SCP的生产现状及应用前景展望3.1单细胞蛋白的生产特性单细胞蛋白质生产周期短。单细胞生物繁殖特别快，世代周转迅速。如酵母菌在良好条件下每接种100千克，1天即可获得2500千克酵母，其生长繁殖速度约为大豆的1300倍，为动物生长的2000倍。所以，这类饲料生长速度快，世代周转迅速。8 生产单细胞蛋白质饲料产品的原料多为烃类及其衍生物、天然气、石油加工副产品、有机垃圾、纸浆、糖蜜、蒿秆粉等，原料来源广，可充分利用工农业的废物，净化污水，减少环境污染；另一方面，可以工业化生产，不与农业争地，也不受气候条件限制。[2]3.2SCP的生产现状我国SCP生产始于1922年,1986年4月10日，我国第一个SCP饲料厂在广东省江门市建成并试产成功。1987年全国SCP(酵母)总产量1.55万吨，1990年SCP超过2万吨，1991年总产量6万吨，其中固体酵母达4.8万吨，1992年固体酵母达8万吨，1993年超过1万吨，到2000年发展到15万吨。[2]我国是农业大国，食物结构以植物蛋白为主，动物蛋白的摄入量与欧美各国相差悬殊，为了提高人民群众的体质，SCP单细胞蛋白的开发与生产为解决人类食品和饲料问题开辟了新的途径。3.3前景展望当代世界的五大问题是人口、食物、资源、环境和能源问题，特别是食物和环境问题越来越引起社会的关注。生产SCP一方面可以利用各种废弃物、废液、废渣来作为原料来源，从而降低环境污染；另一方面，可以获得大量的蛋白质、维生素等营养物质，用作动物饲料和食品，从而缓解食物危机。若以蛋白质含量计算,1公斤单细胞蛋白相当于1-1.5公斤大豆.建立一座5只100吨发酵罐的工厂,可以年产5000吨单细胞蛋白,相当于5万亩耕地上种植大豆的产量。SCP的生产越来越引起世界各国的重视，特别是在美、英、德、法等国，SCP的产量都相当的高且技术也比较成熟。因此单细胞蛋白的开发和生产在我国更具有广阔的前景。3.4观点与认识蛋白质和DNA的转录、翻译的研究是当今生物学领域的研究热点之一，蛋白质直接决定生物的表型，是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与，人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。20种氨基酸竟能构成大自然中数以亿计的蛋白质，这引起了我们的极大的好奇。如果我们能对构成蛋白质的氨基酸以及它们之间的相互作用有更加深入的研究，这不仅能帮助我们解决目前仍未攻克的疾病，就是对于研究生物进化与起源也有重要意义。蛋白质如此重要，大规模的生产蛋白质就不可忽略，利用微生物进行生产有很多的优点，然而这项技术的发展只是处在起步阶段，这就需要我们不断地学习前人的经验和科学文化知识，积极投身到生产微生物单细胞蛋白的领域中去。8 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