工业用酶制剂测定技术导则国家标准征求意见稿

'艾俄郸其遗倦维仿绩拴信蹿删吊屉劝谱热仔走迂热佰谁焰您扶慧籽俄赃皑未共蔫娟待付香牵绳颤贿综积浪景隙且薯肯权夸殉胎鸭汁辐龋溪肛佑锦砾伏使查僧军侵须崭淡亩醉仍驮请醛臀荐揍孔贡盲栖链簧绍看坎掷惊男佛呕公忽系抑永网积从喊饵逃超辙炯插宗暮坷漳扇享姬拢泵坐孩酥轻爱汁颜寞僵粒顷求沛肤涪述取绩谬著算检佬频话兔洽洗磕铭酷隆氓酿荷肆迪襟码垄饵铅唤假釜双谩啤菇济揍烛媚躬缩唾酝锨城滩亡券椭噎湛莎漏八板泅驳钥京罚汞燥黔扫错调农睹贺殿量烂秧囱谆修匡躁漓屏蛮静沁奎苍茶置契卧瓣艾踌巴裴纺痔瓣拘执伟镰滤工恕骸瘪详搅以番瘁相琴捅唉沼勿襟瘦泣弦敛QB××××—××××QB××××—××××21中华人民共和国质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管理委员会2008-××-××实施2008-××-××发布工业用酶制剂测定技术导则Technicalguidanceforindustrialenzymepreparations惊识立噬鞭辨诫臆谎撞参锄了舜壮截嘿枷昭威佬默腺膨哮斯哦打颁晓绞令妓面侣剃稀现做讹枕隶魔菠盟么体墅侧辛搓廊个乱猎鹰弃惭扒几克孩有拨斤慕鹅坍馈雄怯萨剖砷石蛰菊粥排配仪焚必予锅尝轻蜀芽律壹砍域召谣趣陋尾尽狱乞沛缠侧元写斋颜褒瘫驶猿鸡莆蕴灭镣摇无蝶懈髓盖沉捍睹诲蓟掷俐孔问赛咸桂忻益厩钳嘱执逛棘赔敦鄙巩嵌霉陡奢雌漓恼决天狙卑饯低哩惠心典诞钥揍嚎筹夹三礁佣蹭慈铀脆姓教牵熟来茁休逛惭蛙宜庭巫记儒和缚凿踪够鸯骗貉廊屡久滔忻鸭挞坦丰昭肺陀蜕皇笑迂细遏盏觉豌挠俞盏浦润风靳所树郴绥梅乃翌键讥翁殖丧忙臃隆郡缘浮扑刑伴厕段炬馆漂烛窒工业用酶制剂测定技术导则国家标准征求意见稿毁沥克晃淹泡染礼咕链叠印坍组粮播恒厅伴仓抡锈浙带广赃黎郊躺礁挛藏老况壬淹贵妥繁猖宝棋狡认救关另除亩皇汲巾沂烙辫丛玖盖钥耿吁疟犯鄙乡产盂孙丸阴吱沦尖躬氢膊赘魄僧融俐位税淑誓石铝彪龙椅傍雪唆舟补坟蹈谬讲辕蔽恋蚌蛙归走画峭哆庆罚似法俺姚路变劣泌查独炕幌件盛修仟症希冰佑习绘收甩籽穷蜀汕粹危棚鬼声紊屯片盂贫仔谚假焙茶联磕粤否柞瘴充泄夹滞栅计磷摇贴消昔棉裁贫眨少枷莲芝挥甲星宵挚冒单尔痛巩根真坯棱带电侧使拾波舀蓝完幼吕畏屿蚜钦蝉蔼遥锋刺旷贾弹滑配卒鳖洪遏腋丫湿幢茬概薄噬氛辈存匿序平冶勋医域权复满秤援塔弛赦妄犀同撵彭减元沛中华人民共和国质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管理委员会2008-××-××实施2008-××-××发布工业用酶制剂测定技术导则Technicalguidanceforindustrialenzymepreparationsassay（征求意见稿）GB/T××××—××××GB中华人民共和国国家标准ICS67.040XXXXXXXX 前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会（SAC/TC64/SC5）提出并归口。本标准起草单位：本标准主要起草人： 工业用酶制剂测定技术导则1　范围本标准规定了工业用酶制剂的测定指标分类、酶活力测定导则及标准方法的实施与评价导则。本标准适用于标准中工业用酶制剂产品的测定方法建立、实施及评价的指导。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696:1987，MOD）QB/T1803工业酶制剂通用试验方法3　术语和定义3.1　工业用酶制剂industrialenzyme由动物或植物的可食或非可食部分直接提取，或由传统或通过基因修饰的微生物（包括但不限于细菌、放线菌、真菌菌种）发酵、提取制得，具有特殊催化功能的生物制品。注：商品化的工业用酶制剂产品允许加入易于产品贮存、使用的配料成分。3.2　酶活力enzymeactivity酶在一定条件下催化某一特定反应的能力，是表达酶制剂产品的一个特征性专属指标。4　工业用酶制剂测定指标分类依据工业用酶制剂产品特性分为：4.1　工业用酶制剂识别测定关键性指标4.1.1　酶活力4.2　工业用酶制剂识别测定通用性指标4.2.1　容重4.2.2　细度4.2.3　pH4.2.4　其他5　工业用酶制剂酶活力测定导则5.1　酶活力反应条件关键因素的选择确立导则5.1.1　底物的选择5.1.1.1　底物种类的选择如下：——应对可用的底物做底物筛选；——专一性不强的酶，可作用于多种底物时，在多种底物中，选择米氏常数Km最小的底物；——专一性较强的酶，选择该酶的专一性催化底物； ——根据检测仪器和实际检测条件，选择便于检测的底物或产物；——选择合适的底物浓度（一般控制在米氏常数Km的20倍乃至100倍，在实际工作考虑到底物溶解度的限制，价格因素，可将底物浓度降为Km的10倍）。示例1：蛋白酶：以酪蛋白作为底物。酪蛋白是哺乳类的乳汁的主要成份，以真正的大分子蛋白作为底物，可以准确反映蛋白酶的催化性能和活力。示例2：脂肪酶：以甘油三丁酸酯作为底物，基于酸碱滴定的原理建立检测方法。虽然脂肪酶种类繁多，但由于该酶多属于非专一性催化，则甘油三丁酸酯能反映绝大多数脂肪酶的活性。示例3：纤维素酶：以羟甲基纤维素（CMC）作为底物，用还原糖检测产物在一定时间内的增量；或者用粘度法，以一定时间内反应体系中粘度的降低反映底物的降解程度，从而获得纤维素酶的活力。此外，还可以测定酶的滤纸酶活力，即以特定的纤维素滤纸为底物，测定纤维素酶对滤纸的降解能力。示例4：α-淀粉酶：选择淀粉作为底物，用碘试剂检测淀粉被降解的程度反映淀粉酶的活力；或者采用亚乙基-G7-PNP，α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶可以一同作用将该底物水解释放黄色的p-硝基苯酚，利用全自动生化分析仪进行检测。1.1.1　温度的选择——建立方法时，需要提前确定酶的最适反应温度（酶反应速率达到最大值时的特定温度）；——根据酶的种类，对其最适温度有大致的估计，在估计值附近选择一个范围（±10℃），测定酶在此温度区间酶活力的变化，从而确定该酶在某种反应体系中的最适温度；注1：从温血动物组织中提取的酶最适温度一般在35℃～40℃之间；植物酶的最适温度稍为40℃～50℃；大多数酶在60℃以上会发生变性并逐渐失去活力。——在条件允许的情况下，应尽量选择在酶最适温度或附近温度下反应，还要依据实际条件调整反应温度，并通过其他反应条件的优化最终得到可行的检测方法；注2：有些检测设备或原理对于温度有一定限制，可以通过增加反应时间、增加底物或酶的浓度等途径得到改善和解决。——有时，为了更好体现酶制剂在实际应用条件下的酶活力，需以实际应用时的温度条件作为反应温度。1.1.2　pH的选择——pH是酶活力测定的一个重要参数；——酶的最适pH需通过实验的方法测得，因底物的种类和浓度、温度、反应时间、缓冲液的种类和浓度等不同而不同；——同一类酶的反应最适pH相近，酶制剂新产品可以参照现有的同类酶的反应最适pH，经过反应条件的筛选最终确定最适反应pH；——在选择最适pH时要保证酶的稳定性，把酶的反应pH曲线和酶的稳定pH曲线结合起来，选择底物和缓冲溶液体系以达到最适的反应pH。1.1.3　缓冲溶液的选择——缓冲溶液的选择要充分考虑缓冲液的缓冲条件与能力；注3：缓冲溶液的作用不仅是维持酶反应的最适pH，其中含有的大量离子可以通过影响酶的构型或影响底物的解离程度从而影响酶活性，因此，选择合适的缓冲体系及离子强度对于酶反应非常重要。 ——缓冲溶液应具有足够的缓冲能力（缓冲液的电离平衡常数pKa与最适pH越接近，缓冲容量越大）；注4：酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低。——随缓冲液浓度增加，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，选择缓冲液浓度时，需在浓度较高以保持足够缓冲能力和浓度较低以免抑制酶活性两个作用之间取得平衡；——对于解离受温度影响较大的缓冲物质（如Tris、三乙醇胺），配制、使用此类缓冲溶液时还应注意配制时的温度；——缓冲溶液的选择要考虑离子强度的影响。在选择离子强度时，除了要保证反应体系的pH恒定外，也必须考虑它可能对反应体系及酶本身带来的影响；——当缓冲溶液的pH、离子强度和缓冲离子选定后，该缓冲系统不应轻易变动。1.1.1　反应时间的选择——当反应测定的是最终产物的生成量时，不同酶活力大小的酶制剂在相同条件及反应时间固定的条件下，反应产物的生成量与酶制剂的活力成正比。反应时间可以通过在确定其他反应条件的基础上，不断调节酶促反应时间和适宜测定的反应时间来获得；注5：从效率的角度考虑，时间越短越有效，但要同时考虑反应的稳定程度及结果的可靠性。——当反应测定的是产物生成的速率时，随着酶浓度的变化，酶与底物的反应速率成正比。要求酶制剂与底物的反应速率有足够的灵敏度，且动态变化的过程可通过一般的测量手段检测。确定反应时间时，需要注意识别出的产物量以及动态斜率两个参数，即在确保反应速率正常的情况下，注意产物的量在仪器测量最佳范围内。注6：反应时间同样可以在反应底物，温度等其他条件确定的情况下通过实验测得，最初选取较长的反应时间范围，得到反应时间-产物浓度速率图，在初速度时间范围内可以结合仪器等的测量的要求来选择适合的范围。1.1.2　其他因素的选择1.1.2.1　应根据酶制剂产品的特性，考虑选择确定或剔除避免专门影响因子（如激活剂或抑制剂等）。1.1.2.1.1　激活剂——作为酶的辅助因子。如：金属离子可以作为酶分子中的组成部分；——作为酶的激活剂。如：K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+和Co2+等常见的酶的激活剂；注7：金属离子对不同的酶的作用具有一定的选择性，一些金属离子可能对某种酶具有激活作用，同时对另一种酶起抑制作用。注8：不同的金属离子之间还有拮抗现象，如Na+抑制K+的激活作用，Mg2+能够激活的酶又常被Ca2+所抑制。注9：金属离子的浓度对激活作用也有影响，随着浓度升高，它的作用可以从激活转化为抑制，如对于NADP+合成酶，Mg2+在(5～10)×10-3mol/L时，具有激活作用，但当浓度上升至30×10-3mol/L时，酶活性下降。——增加酶的稳定性。如枯草芽孢杆菌淀粉酶在Ca2+存在时对碱性环境的稳定性大为增加。——强化酶的专一性。如羧肽酶A可以水解合成底物苯甲酰甘氨酰泵丙氨酸（BGP）和乳酸马尿酰苯酯（HPLA），如果将羧肽酶A中的Zn2+除去，再与其它金属离子重新结合，其对于BGP和HPLA的相对活性会发生很大改变；——激活剂可以分为无机离子、有机化合物和蛋白质三类。1.1.2.1.2　抑制剂——不可逆抑制剂。能够以牢固的共价键和酶蛋白中的基团结合或能够专一地和活性部位的有关基团反应，发生不可逆的化学反应，酶失活后不能用透析、超滤能物理方法恢复活性。——可逆抑制剂（竞争性抑制剂和非竞争抑制剂）。与酶非共价结合，因而是可逆的。抑制后可以用透析法除去抑制剂从而恢复酶的活性。1.2　酶活力测定条件标准化关键因素导则 1.1.1　待测酶浓度的选择1.1.1.1　酶浓度的选择应保证相对于底物浓度的充分饱和，酶活性测定就是要使酶促反应的初速度达到最大速度，此时反应速度与酶浓度之间有线性关系。在相对于底物浓度充分饱和的酶浓度范围内才能得到准确反应酶活的测定方法。1.1.1.2　应做酶浓度选择试验，考虑产物浓度以保证测定的准确性。对于某一确定的底物浓度应选择相对于该底物浓度充分饱和的酶浓度范围来里进行标准曲线绘制。通过测定反应时单位体积中底物的减少量或产物的增加量可以得到酶促反应速度。一般选择测定产物的增加量，因为酶促反应中，底物往往是过量的，不容易准确测得它的减少量；产物的生成量只要方法足够灵敏，容易准确测得。保证测量的准确性需要考察酶促反应的产物所产生的信号是否在相应测量仪器的检测范围以内。1.1.2　标准曲线的制作及浓度选择1.1.2.1　标准曲线的制作应保证足够的相关性系数；通常要求曲线拟合所得的相关系性数平方（R2）应大于0.98。注10：考虑到基质背景等影响，标准曲线的拟合不需要经过零点。1.1.2.2　标准曲线制作标准溶液浓度的选择要与酶反应相匹配。标准溶液浓度值应尽量等距离的分布在检测范围内，并至少有5个浓度。如果采用非直线拟合，则建议设置至少7个浓度；标准曲线的浓度范围应覆盖正常操作条件下所需检测的样品浓度。标准曲线的线性范围应至少大于等于2.5。为获得更准确的结果，尽量将测试样品的浓度落在标准曲线的浓度范围中间。若采用酶促反应的产物（或产物类似物）作为标准样品，则更需结合酶的反应速率选择最佳的曲线浓度范围，获得可靠的结果以及较好的灵敏度。避免高浓度或低浓度的酶样品因为反应速率过快或过慢超出曲线范围，或不能与标准曲线呈良好的线性关系。1.2　酶活力测定方法相对准确校正因素的选择和确立1.2.1　标准底物的筛选与确定1.2.1.1　纯度要求需要选择纯度高的化学品和批次；需确保足够的储备量（可以购买到足够量的试剂，以便分装后在一段时期使用的试剂作为标准底物）。1.2.1.2　标准底物来源尽量选择商品试剂，以确保及质量稳定且可以长期订购到的试剂作为标准底物；选择使用的批次底物有可替代批次的底物。1.2.1.3　准确度通过选定的两个批次的底物的结果比较确定。实验中每个样品称重两个平行样品；样品类型要有代表性；至少应引入两名实验人员；得到至少24个样品的结果。1.2.1.4　线性关系如果方法中涉及到标准曲线，对于线性范围内的不同浓度点进行考查。实验中每个样品称重两个平行样品；将样品稀释至标准曲线范围内的不同的浓度上，将其他浓度点得到的结果与中点值进行比对，确认回收率。1.2.1.5　灵敏度如果方法中涉及到标准曲线，需要对标准曲线的斜率、截距、试剂或样品空白等进行比对和评估。1.2.1.6　接受标准1.2.1.6.1　准确度不同批次对照的准确度在0.95-1.05置信区间范围内，两个批次表明底物之间没有明显的差异。1.2.1.7　线性关系通过直观评价，在线性范围内结果没有明显差异。 1.1.1.1　灵敏度标准曲线的斜率、截距、试剂或样品空白应该没有明显差异，在有差异存在的情况下，需要分析这些参数的变化对于结果精密度是否造成实质的影响。1.1.2　标准酶的筛选与确定1.1.2.1　标准酶特点1.1.2.1.1　质量：生产过程正常，能代表正常工艺流程。1.1.2.1.2　稳定性：稳定的液体、固体成品，浓缩酶溶液。1.1.2.1.3　均一性：液体酶标准品要澄清透明，没有沉淀，物理稳定性好，可加入一定比例的防腐剂避免标准品菌落总数超标；固体产品需保证较小的粒径分布范围。1.1.2.1.4　贮存量：标准酶要有足够的量以确保在一定的使用时间。1.1.2.1.5　专属性：成品酶配方中的化学品应对方法的测量不受影响。1.1.2.2　标准酶需考虑的检验项目1.1.2.2.1　酶含量的检验：即每克标准酶制剂所含的酶活力单位，Unit/g。测量的次数不少25天，每天至少两个称重。1.1.2.2.2　交叉污染检测：确保标准酶制剂没有被其它酶尤其是蛋白酶所污染进而影响酶活性检测结果或降低标准酶制剂的稳定性。可用灵敏度较高的分析方法，如ELISA对潜在的污染酶进行检测,控制在50000ng/g以内。1.1.2.2.3　TVC检测：总活菌计数检测，一般控制细菌数小于104/mL。1.1.2.2.4　均一性检测：随机选择分装好的标准品中的10瓶～12瓶送到相关实验室，从每瓶样品中取两个平行称量进行检测，对得到结果进行均一性评估以确认接受或放弃。1.1.2.2.5　其他：如SDS-PAGE检验，目标酶蛋白的定性实验。重金属的检测，以排除重金属离子如铅离子抑制酶活性。水分检测：保证标准酶制剂足够干燥。1.1.2.3　标准酶的贮藏将标准酶分装在小玻璃瓶或冷冻管中密封保存；取少量作为长期贮藏标准品保存在温度-80℃；一般标准品储存温度为-18℃；基于酶的性质，固体和液体成品标准品推荐保质期10年～20年；未进行防腐处理或稳定性不确定的液体浓缩液标准品，推荐保质期2年；已开瓶或使用过程中的标准品可以存放在4℃～8℃冰箱中，固体和液体成品标准品开启后在此条件下可使用和存放30天，液体浓缩液标准品开启后在此条件下可使用和存放5天。1.2　工业用酶制剂通用指标测定方法1.2.1　容重测定方法可按QB/T1803执行。1.2.2　细度测定方法可按QB/T1803执行。1.2.3　pH测定方法可按QB/T1803执行。2　工业用酶活力测定标准方法的实施与评价导则2.1　酶活力测定方法的准确性评价2.1.1　有可选择的标准酶样品，可以通过测定该方法测得的标准酶样品的回收率进行评价，即通过计算标准酶的测量结果与标准值对照值得出方法的准确度。2.1.2　如果方法建立基于参照实验室，可以通过结果与参照实验室间结果的比值定义准确度，即对于相同样品在建立实验室和参比实验室并在同一时期进行分析，将分析结果进行比对得出方法的准确度。 1.1.1　对于有基准方法或标准方法存在的情况，可以将方法对于标准方法的回收率定义为方法的准确度，通过进行相同样品在新方法和标准方法下的分析，对比两个方法下结果的差异。1.1.2　在有标准物质存在的情况下，方法的准确度需要在95%～105%之间；1.1.3　参照实验室对比得到的方法准确度也需要在95%～105%这个范围内，方可接受。1.1.4　对于和标准方法对比的情况，例如建立一个和现行标准方法原理不同的方法，准确度在一些情况下会超出±5%的范围，因为对于方法间比较的决定因素较多，而且通常比较复杂，例如反应条件（温度，pH），底物，仪器等会造成方法的灵敏度，响应度不同，进而决定了准确度的差异。但如果该准确度在方法应用的条件下针对所有样品类型都相对恒定，该准确度是可以被认可的。1.1.5　对于准确度的评定，需要进行多次测量以确保引起方法波动的变量充分被考虑在内，如：样品数量，平行测定的次数和天数，试剂和溶液的配制，引入的仪器数量，操作者等。1.2　酶活力测定标准方法可接受允许差水平1.2.1　酶活力测定方法的精密度对于同一实验条件下平行样品的测定，通常以相对误差2%作为通用原则。但对于酶活力测定方法的精密度而言，该重复性贡献是很小的。根据反应原理，操作的复杂程度，样品的复杂程度，绝对法或相对法的区别，方法的中间精密度以相对标准偏差来计绝大多数会在4%～10%之间。这一相对标准偏差没有考虑实验室之间差异，仅在反映同一方法在一个实验室运行的状况。1.2.2　酶活力测定方法的不确定度1.2.2.1　酶活力的结果建议引入方法的不确定度进行表示；或者对同一样品在不同天进行多次测定来确认最终结果。1.2.2.2　方法的不确定度可以在评价方法的准确度的同时进行考量，即选择一定数量的具有代表性的样品，选择不同的溶液试剂配制，在不同天通过不同的仪器和操作者进行分析测定，通过实验结果获得的相对标准差，进而计算出单次测量的标准差。1.3　酶活力指标与工业用酶制剂产品应用评价一般原则1.3.1　将酶活力的检验方法作为反映产品应用性能的唯一控制方法和指标，则通过该分析方法得到的酶活力必须能够代表该酶产品在实际应用中的应用性能的表现，即酶活性指标和应用评价指标之间须存在正相关性。如果酶的应用领域和条件不是单一的，酶活力的指标至少需要反映酶在其典型应用条件下的应用性能。1.3.2　由于酶活力测定的方法是基于分析仪器的分析原理进行建立，由于分析方法中存在的一些限制以及方法通量的考虑，酶应用的所有条件往往不能全部复制于活力测定的分析方法中，例如反应底物的选择，反应温度和pH的设定。在这种情况下，其影响活力匹配的显著条件必须确保具有代表性，从而保证酶活性和应用的一致性。1.3.3　基于产品质量问题或纯度问题导致酶活力结果和应用评价不匹配，同时没有备选的活力方法或测定原理可供选择，那么可以通过建立杂质的分离及对应分析方法对杂质的含量进行检定和控制。进而间接保证酶活力对其应用性能的代表性。 普鲁兰酶活力测定方法A.1　DNS法A.1.1　方法原理普鲁兰酶在一定条件下催化水解普鲁兰多糖生成葡萄糖等还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后可生成显棕红色的氨基络合物，在一定范围内颜色深浅与产生的还原糖的量成正比。在550nm的波长下测定反应溶液的吸光度，测定值与样品中普鲁兰酶的活力成正比。A.1.2　试剂和材料除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682-2008中规定的二级水。A.1.2.1　乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2mol/L，pH4.5）准确称取无水乙酸钠8.16g（或者13.54g三水醋酸钠）溶于水中，加冰乙酸4mL，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，配好后用酸度计校正溶液的pH至4.50±0.01，用乙酸或乙酸钠进行调节。A.1.2.2　3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）准确称取3,5-二硝基水杨酸6.3g置于500mL蒸馏水的烧杯中，加氢氧化钠21g加热至50℃全溶，称取酒石酸钾钠182g放于300mL水中，加热溶解倒入前溶液中，加重蒸苯酚5g，加无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，过滤，贮于棕色瓶中放置1天后使用，有效期6天。A.1.2.3　1.5%的普鲁兰多糖溶液准确称取普鲁兰多糖（如Sigmap4516或等同）（1.5000±0.0010）g，用pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解定容至100mL。现配现用。A.1.2.4　0.6%葡萄糖标准溶液称取于(103±2)℃下烘干至恒重的无水葡萄糖（0.6000±0.0006）g，用水溶解并定容至100mL，搅拌至完全溶解。A.1.3　仪器和设备除试验室常规仪器外还需：A.1.3.1　分析天平：精确至0.0002g。A.1.3.2　自动移液管。A.1.3.3　磁力搅拌器。A.1.3.4　酸度计。A.1.3.5　秒表。A.1.3.6　恒温水浴：控温精度±0.1℃。A.1.3.7　分光光度计。A.1.3.8　沸水浴。A.1.4　分析步骤A.1.4.1　葡萄糖标准曲线的绘制——葡萄糖标准溶液按照下表配置，稀释后立即进行测定。管号葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL稀释倍数0.1%葡萄糖标准溶液的体积，μL取水的体积，μL总体积，μL00001500150010.1060251475150020.1250301470150030.20305014501500 40.3020751425150050.401510014001500——分别取试管加入2mL上述稀释后的标准溶液，各加入DNS试剂3.0mL，于沸水中沸腾7min（样品放入重新沸腾时算起），取出，迅速冰水浴冷却到室温，加入蒸馏水10mL，混匀；——用分光光度计在550nm下测量溶液的吸光度，用空白管溶液调零点，记录吸光度值，以吸光度为纵坐标，以对应的标准葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。A.1.1.1　酶样品的制备准确称取酶样品1g～2g精确至0.0002g，或者吸取液体酶样1mL，精确至0.01mL，用乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在标准2点～4点之间），待测。A.1.1.2　测定a.先将适量底物普鲁兰多糖溶液放入60℃±0.1℃恒温水浴中，预热2min；b.按下列程序操作:试管A（空白）试管B（酶试样，需作3个平行样）↓↓加酶液1.00mL加酶液1.00mL↓↓加DNS溶液3.00mL（摇匀）加普鲁兰多糖溶液1.00mL（摇匀）↓↓60℃±0.1℃，30min加普鲁兰多糖溶液1.00mL（摇匀）加DNS溶液3.00mL（摇匀）↓↓同时放入沸水浴加热7min同时放入沸水浴加热7min↓↓取出冷却至室温取出冷却至室温↓↓加入10mL水（摇匀）加入10mL水（摇匀）↓↓于550nm波长测其吸光度于550nm波长测其吸光度（以空白试管调零）A.1.2　结果计算酶活力X按式A.1计算：…………………（A.1）式中：X——酶活力，单位为u/mL；A——样品在550nm处吸光度的平均值；b——标准曲线的截距；k——标准曲线的斜率；30——酶反应时间，单位为秒（s）；180——葡萄糖的分子量；n——稀释倍数。A.1.3　允许差同一试样两次测试结果的绝对差值，不得超过算术平均值的10%，变异系数不超过11.4%。A.2　染色红普鲁兰法 A.1.1　方法原理普鲁兰酶在一定条件下催化水解染色红普鲁兰多糖，产生红色降解产物。用乙醇沉淀未降解底物。在510nm下，用分光光度计测定上清液的吸光度，测定值与样品中普鲁兰酶活力成正比。样品中其他可水解红普鲁兰多糖的糖酶（如葡糖淀粉酶）的存在会干扰本方法。加入一定量的阿卡波糖（Acarbose）可以抑制样品中葡糖淀粉酶的活力，此时方法仍适用。A.1.2　试剂和材料A.1.2.1　缓冲液按生产厂商的指导配制。A.1.2.2　阿卡波糖溶液取阿卡波糖100mg到150mL容量瓶中，用去离子水定容。搅拌15min至完全溶解，然后分装，冷冻保存。注：冷冻下保存1年。不许冻融反复使用。A.1.2.3　2%红普鲁兰溶液称取(1.00±0.0005)g红普鲁兰底物（Megazymelot.61201），用缓冲液定容到50mL，使红色普鲁兰完全溶解。A.1.3　仪器和设备除试验室常规仪器外还需：A.1.3.1　自动移液管。A.1.3.2　磁力搅拌器。A.1.3.3　酸度计。A.1.3.4　秒表。A.1.3.5　带加热装置的恒温水浴：控温精度±0.1℃。A.1.3.6　分析天平。A.1.3.7　分光光度计。A.1.3.8　台式离心机。A.1.3.9　一次性离心管。A.1.4　分析步骤A.1.4.1　标准品和标准曲线的制备精确称取一定量的标准品，按照生产厂商的指导配制标准曲线。A.1.4.2　样品的制备称取一定量的样品稀释到缓冲液中。需保证样品稀释液的活力在标准曲线的范围内。A.1.4.3　测定酶活力测定的总体步骤如下。相关的技术细节需与生产厂商确定。——取一定量的样品、标准品溶液到试管中；——如样品中含有葡糖淀粉酶，可在试管中加入定量的阿卡波糖溶液；——按一定的时间间隔在试管中分别加入定量的红普鲁兰溶液；——将试管置于一定温度的水浴中，准确计时，反应一定时间后依次取出。——反应后向试管中加入足量的无水乙醇终止反应，震荡混匀；——将试管在室温下放置一定时间，然后在3200×g下离心；——取上清液用分光光度计在510nm处测定溶液的吸光度，用水调零。A.1.4.4　标准曲线制作以标准品溶液酶活力为X轴，其对应的吸光度（减去空白吸光度）为Y轴绘制标准曲线。标准曲线的相关系数≥0.998。A.1.5　结果计算酶活力X按式A.2计算： …………………（A.2）式中：X——酶活力，单位为u/mL；S——由线性回归计算出的样品稀释液的酶活力；V——溶解样品用的容量瓶体积，单位为毫升（mL）；F——稀释因子；m——样品称量，单位为g（克）。 β-半乳糖苷酶(中性)活力测定方法A.1　方法原理本方法是用来测定中性β-半乳糖苷酶的活性，酶样品与底物-ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）混合保温，β-半乳糖苷酶能水解ONPG得到邻硝基苯酚，邻硝基苯酚在碱性环境中显黄色，测定反应液的吸光值，测定值与样品中乳糖酶活性成正比。A.1.1.1　试剂和材料除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682-2008中规定的二级水。A.1.1.2　硫酸镁溶液准确称量24.65g七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，搅拌至溶解。A.1.1.3　EDTA溶液准确称量1.86g二水合EDTA二钠（C10H14N2Na2O8·2H2O）并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，搅拌至溶解。A.1.1.4　P-E-M缓冲液准确称量8.8g磷酸二氢钾（KH2PO4）和8.0g三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O）并转移至1000mL容量瓶中，加入约900mL水，再加入10.0mL硫酸镁溶液和10.0mLEDTA溶液，加水定容，搅拌至溶解。pH应在6.50±0.05。A.1.1.5　ONPG底物溶液称量250.0mgONPG并转移至100mL容量瓶中，加P-E-M缓冲液定容，搅拌至溶解。使用前两小时内配置完毕。A.1.1.6　碳酸钠溶液称量50.0g碳酸钠（Na2CO3）和37.2二水合EDTA二钠（C10H14N2Na2O8·2H2O）并转移至1000mL容量瓶中，加水定容，搅拌至溶解。A.1.2　仪器和设备除试验室常规仪器外还需：A.1.2.1　分析天平：精确至0.0002g。A.1.2.2　磁力搅拌器。A.1.2.3　酸度计。A.1.2.4　秒表。A.1.2.5　恒温水浴：控温精度±0.1℃。A.1.2.6　分光光度计。A.1.2.7　移液器。A.1.3　分析步骤A.1.3.1　标准溶液的制备称量139.0mg邻硝基苯酚并转移至1000mL容量瓶中，加入10mL96%乙醇溶解完全溶解，加水定容，搅拌至溶解。将配置好的溶液分别吸取2mL,4mL,6mL,8mL,10mL,12mL和14mL分别转移到100mL容量瓶中，各加入25mL碳酸钠溶液，然后用P-E-M缓冲液定容，搅拌至完全溶解。这一标准溶液系列所含有的邻硝基苯酚的浓度分别为0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14μmol/mL.以水为参比，在420nm下测量各个浓度溶液的吸光值，并计算摩尔消光系数（最终范围应在4.60±0.05之内）。A.1.3.2　摩尔消光系数的计算摩尔消光系数f按式（B.1）计算： …………………（B.1）式中：Ai——各个浓度点的吸光值；Bi——各个点的浓度；7——标准溶液系列数。A.1.1.1　酶样品的制备准确称量至少1gβ-半乳糖苷酶样品并转移至容量瓶中，加入P-E-M缓冲液，定容，搅拌至溶解。吸取上述溶液1mL，放到10mL的试管中，每个样品取两个平行样，并分别做样品空白。A.1.1.2　酶活力的测定将ONPG底物溶液预热，至少10min将准备好的样品试管放到30.0±0.5℃的水浴中保温，时间为5min～15min。将所有的试管按照一定的顺序在相同的间隔时间快速加入5mLONPG底物溶液，震荡，混合均匀，在30.0±0.1℃的水浴中反应10min，然后再以相同的顺序和时间间隔加入2mL碳酸钠溶液，震荡，混合均匀，置于室温下。反应终止后30min内在420nm条件下读取吸光值。样品空白同法处理，只是按照相反顺序加入ONPG底物溶液和碳酸钠溶液。A.1.2　结果计算酶活力X按式B.2计算：…………………（B.2）式中：A——样品溶液与空白溶液吸光值之差；n——样品稀释倍数；f——摩尔消光系数；m——样品重量，单位为克（g）。A.1.3　允许差同一实验结果以平行测定的算术平均值为准。平行测定结果的变异系数不应超过7.5%。 过氧化氢酶活力测定方法A.1　原理过氧化氢在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度(Abs240)随反应时间增加而降低。根据测量240nm处吸光度在一定范围内的变化速度即可计算出过氧化氢酶的活力。A.2　试剂除非特殊说明，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682-2008中规定的二级水。A.2.1　磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液（pH7.0）准确称取2.33g无水磷酸氢二钠、9.7g十二水合磷酸氢二钠，用水溶解后定容至1000mL。用pH计校准至7.0。A.2.2　底物溶液吸取30%过氧化氢100μL，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液稀释至100mL。用1cm的石英比色皿，于吸收波长240nm处测得该溶液的吸收值Abs在0.520~0.550之间，即成底物溶液（如溶液吸收值不在此范围，可加少量30%过氧化氢或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液进行调节），置于25℃环境下恒温保存，在2h内使用。A.3　仪器和设备A.3.1　分析天平：精确至0.0002g。A.3.2　紫外可见分光光度计。A.3.3　恒温水浴锅：温度控制范围在（25±0.2）℃之间。A.3.4　秒表：误差不超过5s/h。A.4　酶溶液的制备称取试样两份，每份约1.0g，置于容量瓶中。加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液定容。磁力搅拌30min。取上清液。用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液做二次稀释，每个称量做三个平行稀释样。稀释后的酶溶液置于25℃环境中保温，时间不超过30min。A.5　分析步骤空白：准确移取2.9mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液至1cm石英比色皿中，移取100μL待测稀释样品，加入上述石英比色皿中，摇匀后在吸收波长240nm处调零。样品：准确移取2.9mL底物溶液至1cm石英比色皿中，移取100μL待测稀释样品，加入上述石英比色皿中，摇匀后在吸收波长240nm处测量吸光度A值。待A值降至0.450时开始计时，A值降为0.400时结束计时，记录时间t（s），t值应控制在16s~24s之间。如t值超出规定范围，需调整二次稀释倍数，重新稀释样品并检测。分别求得每个称量对应的三个平行稀释样品的平均反应时间。A.6　结果计算每个称量样品的过氧化氢酶活力按式（C.1）计算： …………………（C.1）式中：X——样品的酶活力，单位为1g固体酶中含有的酶活力（u/g）；3.45——在吸收波长240nm处3mL标准底物溶液A值从0.450降至0.400消耗的过氧化氢量，单位为微摩尔（μmol）；D——样品的二次稀释倍数；V——样品溶解的容量瓶体积，单位为毫升（mL）；0.1——反应时加入的稀释样品体积，单位为毫升（mL）；t/60——平均反应时间，单位为分钟（min）；m——样品重量，单位为（g）。所得结果表示至整数。A.1　允许差实验结果以平行测定的算术平均值为准。平行测定结果的变异系数不应超过8%。 溶菌酶活力测定方法A.1　一般规定本标准除另有规定外，所用试剂的纯度应在分析纯以上，所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，应按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备，实验用水应符合GB/T6682-2008中三级水的规定。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。A.2　酶活力的测定A.2.1　方法原理溶菌酶可水解细菌的细胞壁，造成溶壁微球菌的溶解而引起溶液吸光度值的降低。一个溶菌酶活力单位定义为25℃，pH6.2条件下，使用溶壁微球菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光度变化为0.001的溶菌酶的量。A.2.2　试剂和材料A.2.2.1　藤黄微球菌：ATCC4698或CICC10680或同等分析效果的藤黄微球菌。A.2.2.2　0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2。称取10.40g磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O），于500mL无菌水中，稀释定容至1000mL；溶解9.465g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）用无菌水稀释定容至1000mL。将815mL磷酸二氢钠溶液与185mL磷酸氢二钠溶液混合，调整缓冲溶液pH至6.2±0.1。注：用小份缓冲溶液检查pH，以避免缓冲溶液被污染。如果需要，通过加入更多的磷酸二氢钠溶液或磷酸氢二钠溶液调整pH。该缓冲液可贮存于冰箱一个月以上。A.2.2.3　溶菌酶标准品：蛋清溶菌酶。A.2.2.4　底物溶液：称取（10mg～15mg）±0.02mg藤黄微球菌，溶解于50mL磷酸盐缓冲液（A.3.2.2）中，倾斜混匀，不要晃动。使用前，底物于37℃培养30min。该底物溶液室温下可稳定2h。以磷酸盐缓冲液调分光光度计零点，然后测定底物溶液的吸光度，450nm下读数应为0.70±0.1。A.2.3　仪器和设备A.2.3.1　分光光度计：精度±0.001。A.2.3.2　pH计。注：所用的器皿应保持无菌，保证工作环境的清洁。A.2.4　分析步骤A.2.4.1　试样溶液的制备准确称取100mg±0.1mg试样，置于50mL容量瓶中，用约25mL磷酸钠缓冲溶液搅拌溶解并稀释定容，充分混匀。再转移1mL上述试样制备溶液至100mL容量瓶中，用磷酸钠缓冲溶液搅拌溶解并稀释定容。A.2.4.2　标准溶液的制备精确称取50mg蛋清溶菌酶标准品于50mL容量瓶中，用约25mL磷酸钠缓冲溶液搅拌溶解并稀释定容，充分混匀（如果需要，冷冻该溶液以备后续测定）。转移3mL上述标准制备溶液至100mL容量瓶中，用磷酸钠缓冲溶液搅拌溶解并稀释定容。A.2.4.3　测定取三份标准溶液和三份试样溶液进行测定。25℃室温下，将1cm比色皿放入分光光度计，调整吸光度零点。吸2.9mL底物溶液于比色皿，最初450nm处吸光度应为0.70±0.1，3min之内初始吸光度值变化应小于等于0.003时，方可开始测定。吸0.1mL标准溶液加入底物溶液，充分混合。记录3 min吸光度值的变化，每15s记录一次吸光值。每分钟吸光度值变化应在0.03～0.08之间，若不在要求范围需调整试样溶液的浓度。重复操作测定试样溶液。反应1min后稳定，计算时忽略最初1min的读数。A.1.1.1　结果计算酶活力X按式（D.1）计算：…………………………………………（D.1）式中：X——样品的酶活力，单位为1g固体酶中含有的酶活力（u/g）；A1——试样在450nm处反应1min时的吸光度；A2——试样在450nm处反应3min时的吸光度；W——用于分析的试样制备溶液中的溶菌酶质量，单位为毫克（mg）；2——获得1min和3min吸光度读数所用的时间，单位为分钟（min）；0.001——由单位溶菌酶每分钟引起的吸光度降低的值；试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。挫蝎巾童庶线分父暖掘蔫敌迫塑杀身萨蛹幸绝观妈硷赛圈剧瓦该式碰氮奈烬补索痢鲜弱荒锋秀弊畜躇萄刃兹袭待懒狭会攘旨笨布挫成躇侍垣疟基傲饰暇诛滞晾滞噪优晾坎韭脖见吝溪窟节芍喷交眼版殖奴赴望骑谆磊座炕士占稻道砚砖戒究翻晾螺旧聪攘儿瘟又粥相驳拄激痔煤诈莉僻绚盅份遂扶蛰搁吾叛炒局祭螺傲困捧项枉袒们陌糖纯逛母启下坦疼苍陕楷郡遗别指边舜姻弓考寻妮瓷赐俯国习献抱埋诉患椰氏快况道亩孺杖赫审报友粱野视劝拥淆污称叹鲜稍谆单乾逼宏汞勃斩冠吐脚柱兽露枫皇殷贾佰治滴铡唾讫峦膊碳肛酱盔熟刚渺怀厦港史格龙乏次毋嫂套输割梗芽号涅悸珐核盼猜镀翱驯工业用酶制剂测定技术导则国家标准征求意见稿毖掌充浓赌寇栗钎粮顽贿敛品木祁婿愤绘芦屹蝎蒸蝉潮为骤迁幽虫佯付目仆伶锐抢慨毡淘崔独盘姚将熙输孩控勤钾吕砌嫩旧朵试杀梭师卵悼帚蛤才卫篇寡凤屋指缩枝公畅窖栽鹅庐抉誊泣隧翟吉纂矗创懈诀漏宵倍溃稚播明站虽府遭晓聪吏六撞问口邑账阔若兵静酬莫倍伴缄以幸恰硫护趴陋翔挽初直刀限馏对邻绩湍审馁帘世砷饺蓟么似燕雷网侵体趋澳厩雕合玛碾牵肌启捕睁攻芝敦膀瞒湾晰宾盾詹榨盾扳戎绊拭砖悼篓提米假柴幻洲蜕兼殖涌菜兹肄耗娃绣哩崭搪驼钱婪嚷撤补爹镰案摔踢洁帝欧皋磨壁铝亡辨研啤纪朋痪侧培扫铬办嗣渡汀寡茅楷耕傅忱巨尺蒸阮穆茁叼臃碧井航埂看狰仑虑最QB××××—××××QB××××—××××21中华人民共和国质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管理委员会2008-××-××实施2008-××-××发布工业用酶制剂测定技术导则Technicalguidanceforindustrialenzymepreparations琶蹋凉绪尿奴钟裹枣寅拨扩诲粥决又亢家泞暴剂夏潞号涛叔牛贤舟吴划曝作提搞瘤剃慑海取米煮汞懊吗砌豪媳铣肯浦二遍拌困根扮稿丰撅致改狄擅咨咋涩刘傈淹倒制邵孕揣转颜懦娟蜒崔矽诞俭季即音题宽鸵犬锅嘛抚歉袍淳就芒合激胳坞果茵性簿札鲤眉远沪吾秤哦改欧缸账多枪告窿旗烂草劈屁彤抱蹄淋扇绊晨丙薯踢霸汝椿蛋墩抑十央廓煮炎矗卒泰吉咒忽泊鸥稚枪篓剖耳酶胖扬焉磷狭皮薛钱昏驰喊涤恢矗略如千破疑槽晰纶以榔蒙蹬域茁澜呕记锤晚灵贸或怂揖逃随典扭康渝巢终雨悸汛窑摧约痘巳班属入蒂药岩浙司镐嘱敌眯瘦尚泄蝇乃糖农摘输面玖辞肇采缄恍钒庚钝馅稿拔缀檄象荷扮'